山慈菇多糖的提取及其抗氧化作用的研究

房宇坤，寧安紅，劉 磊，鐘民濤，周紹正，黃 敏

(大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物教研室,遼寧 大連 116044)

論著

山慈菇多糖的提取及其抗氧化作用的研究

房宇坤，寧安紅，劉 磊，鐘民濤，周紹正，黃 敏

(大連醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 微生物教研室,遼寧 大連 116044)

目的提取山慈菇多糖，測(cè)定其總糖含量并對(duì)其體外抗氧化能力進(jìn)行初步研究。方法采用熱水浸提法提取山慈菇多糖，并通過(guò)脫蛋白，醇沉等方法分離純化山慈菇多糖。采用苯酚-硫酸法測(cè)定山慈菇多糖的含量。通過(guò)鄰苯三酚自氧化法、Fenton法和DPPH法測(cè)定山慈菇多糖溶液及對(duì)照組VC溶液在濃度分別為0.5 mg/mL,1 mg/mL,2 mg/mL,4 mg/mL時(shí)對(duì)超氧陰離子、DPPH自由基及羥自由基的清除率。結(jié)果苯酚-硫酸法測(cè)得分離純化后的山慈菇多糖的濃度為30 mg/mL。山慈菇多糖溶液及VC清除超氧陰離子，DPPH自由基及羥自由基的效率隨濃度的增加而增強(qiáng)，兩組內(nèi)差異具有顯著性意義(P<0.05，P<0.001)。結(jié)論山慈菇多糖在體外具有明顯清除超氧陰離子、羥自由基和DPPH自由基的作用，并且在體外的抗氧化作用均隨其濃度的增大而增大。

山慈菇多糖；多糖含量的測(cè)定；體外抗氧化

山慈菇，為蘭科植物杜鵑蘭、獨(dú)蒜蘭或云南獨(dú)蒜蘭的干燥假鱗莖。習(xí)稱“冰球子”，別名還有金燈、朱姑、鹿蹄草等。山慈菇味甘、微辛，性涼。具有清熱解毒，消癰散結(jié)等功效，常用于癰腫疔毒，瘰疬痰核，蛇蟲咬傷，瘸瘕痞塊。中醫(yī)臨床上常與其它藥物作為配伍治療癌癥[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，山慈菇的提取液可以對(duì)小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用[2]。而且山慈菇提取物具有明顯的抑制血管生成的作用[3]。除此之外山慈菇多糖可能是通過(guò)誘導(dǎo)荷瘤鼠脾細(xì)胞分泌TNFα和IL-2等細(xì)胞因子，從而抑制移植性肝癌H22的生長(zhǎng)[4]。

越來(lái)越多的研究顯示抗氧化是預(yù)防衰老的重要步驟，因?yàn)樽杂苫蜓趸瘎?huì)將細(xì)胞和組織分解，影響代謝功能，會(huì)引起不同的健康問(wèn)題。例如常見的癌癥、動(dòng)脈硬化、糖尿病、白內(nèi)障、心血管病、老年癡呆、關(guān)節(jié)炎等，這些疾病都被認(rèn)為與自由基相關(guān)。如果能夠消除過(guò)多的氧化自由基，對(duì)于許多自由基引起的及老化相關(guān)疾病都能夠預(yù)防。同時(shí)，許多人工合成的抗氧化食品添加劑例如丁基羥基茴香醚(BHA)，丁化羥基甲苯(BHT)等毒性較大。所以，國(guó)內(nèi)外對(duì)研究和開發(fā)天然抗氧化劑十分重視。由于中藥多糖對(duì)機(jī)體的毒副作用小，并具有增強(qiáng)免疫力等獨(dú)特的藥理作用，成為中草藥抗氧化成分的研究和新的發(fā)展方向。但是目前有關(guān)山慈菇多糖的提取以及山慈菇多糖的體外抗氧化作用的研究作者未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)提取山慈菇的多糖并測(cè)定山慈菇多糖的含量，并在體外測(cè)定其抗氧化能力，為山慈菇的用藥和開發(fā)提供重要的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

山慈菇原料：購(gòu)于百信大藥房 南京鹿江中藥飲片廠(產(chǎn)地：貴州，批號(hào)：391101，日期：2016年4月18日，自然曬干)，DPPH (1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，coolaber)；三氯乙酸、VC(抗壞血酸coolaber)、鄰苯三酚(焦性沒(méi)食子酸)、D-無(wú)水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、水楊酸、無(wú)水乙醇、石油醚、丙酮、無(wú)水乙醚等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

723紫外-可見分光光度計(jì)(上海菁華科學(xué)技術(shù)儀器有限公司)；DU215CD電子分析天平(梅特勒-托利多);酶標(biāo)儀(Thermo設(shè)備有限公司)；RE-10/20L旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海況勝實(shí)業(yè)有限公司)，HH數(shù)顯恒溫水浴鍋(國(guó)華電器有限公司)、超純水機(jī)(Thermo設(shè)備有限公司)、XFB-500粉碎機(jī)(吉首市中誠(chéng)制藥器械廠)、低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf 5810R)；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱HPX-9082 MBE(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)；真空冷凍干燥機(jī)FD-1-50(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山慈菇多糖的提取

自然干燥后的山慈菇25 g粉碎，過(guò)40目篩，按1∶15固液比，水浴溫度100 ℃、浸提時(shí)間2 h、熱水浴中回流浸提3次，冷卻后過(guò)濾，合并上清液；上清液減壓濃縮至約150 mL后，加入等體積的10%三氯乙酸除蛋白[5]，離心20 min后取上清，加入一定體積95%乙醇[6]，使其終濃度為75%進(jìn)行沉淀，所得沉淀依次用無(wú)水乙醇、丙酮洗滌，真空冷凍干燥后得粗多糖樣品粉末。

1.3.2 總糖含量的測(cè)定

苯酚-硫酸比色法[7]測(cè)定總糖含量，其測(cè)定原理是：多糖或寡糖被濃硫酸在適當(dāng)高溫下水解可以產(chǎn)生單糖，并迅速脫水成糠醛衍生物，該衍生物在強(qiáng)酸條件下與苯酚起顯色反應(yīng)生成橙色物質(zhì)，在波長(zhǎng)490 nm處和一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度Y值與糖濃度X呈線性關(guān)系[8]，測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of glucose

1.3.3 對(duì)超氧陰離子自由基(O2-)清除率的測(cè)定(鄰苯三酚法)[9]

配制50 mmol·L-1的Tris-HCl 緩沖溶液(pH=8.2)25 ℃水浴20 min后，加入不同濃度的山慈菇多糖溶液(0.5 mg/mL,1 mg/mL,2 mg/mL,4 mg/mL)，同時(shí)以相同濃度及劑量抗壞血酸作對(duì)照組。再加入0.4 mL濃度為7 mmol·L-1的鄰苯三酚，反應(yīng)4 min 后加入10 mmol·L-1的HCl 溶液1.00 mL 終止反應(yīng)，以蒸餾水為參比液，在320 nm 處測(cè)吸光度值，A1為樣品加入緩沖溶液及鄰苯三酚后的吸光度；A2為樣品加入緩沖溶液后的吸光度；A0為緩沖溶液加入鄰苯三酚后的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。其清除率可用下列公式計(jì)算：

1.3.4 清除DPPH自由基的能力(DPPH法)[10]

稱取DPPH粉末7.88 mg，配置成2×10-4mol·L-1DPPH工作液(無(wú)水乙醇為溶劑)，置于棕色瓶備用。在干凈的96孔板中，每孔分別加入180 μL的DPPH工作液，分別加入20 μL濃度為0.5 mg/mL,1 mg/mL,2 mg/mL,4 mg/mL的山慈菇多糖溶液和VC溶液，混勻；在37 ℃條件下反應(yīng)30 min后，將96孔板放入酶標(biāo)儀中于515 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品吸光度(A1)；取20 μL無(wú)水乙醇代替樣品多糖溶液測(cè)得空白吸光度(A0)；以180 μL無(wú)水乙醇代替DPPH溶液測(cè)得樣品本來(lái)的吸光度(A2)。每個(gè)檢測(cè)做4個(gè)復(fù)孔，取其平均值[11]。并以抗壞血酸溶液做對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。清除率計(jì)算公式：

1.3.5 清除羥自由基的能力(Fenton法)[12]

在干凈的96孔板中，依次加入50 μL 6 mmol·L-1FeSO4和50 μL 6 mmol·L-1的H2O2，混勻, 每孔分別加入50μL的不同濃度的山慈菇多糖溶液和VC溶液(0.5 mg/mL,1 mg/mL,2 mg/mL,4 mg/mL)，靜置10 min；然后加入50 μL 6 mmol·L-1的水楊酸，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min后，將96孔板放入酶標(biāo)儀中于510 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品吸光度(A1)；取50 μL蒸餾水代替水楊酸測(cè)得吸光度(A0)；以50 μL蒸餾水代替多糖樣品溶液測(cè)得吸光度(A2)。每個(gè)檢測(cè)做4個(gè)復(fù)孔，取其平均值[13]。并以同等濃度的抗壞血酸(VC)溶液做對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。清除率計(jì)算公式：

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及其統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 山慈菇多糖的含量

依照1.3.2的方法，測(cè)得山慈菇多糖一定濃度溶液吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算得出山慈菇多糖的濃度為30 mg/mL。

2.2 山慈菇多糖清除超氧陰離子能力的測(cè)定

山慈菇多糖溶液及VC清除超氧陰離子的效率隨濃度的增加而增強(qiáng)，兩組內(nèi)差異具有顯著性意義(P<0.05，P<0.001)。在多糖溶液濃度為4 mg/mL，清除率達(dá)到50%，而同等濃度的VC組清除率為73%；濃度越低，山慈菇多糖的清除率和相對(duì)的VC清除率相差減少，在最低濃度0.5 mg/mL時(shí)，山慈菇多糖的清除率為15%而VC的清除率為18%。見圖2。

*P<0.05,***P<0.001圖2 山慈菇多糖清除超氧陰離子的能力Fig 2 Scavenging effect of polysaccharides from Rhizoma Pleionis to superoxide anion radicals

2.3 山慈菇多糖清除DPPH自由基的能力

山慈菇多糖溶液及VC清除DPPH自由基的效率隨濃度的增加而增強(qiáng)，兩組內(nèi)差異具有顯著性意義(P<0.05，P<0.001)。同濃度下，山慈菇多糖沒(méi)有抗壞血酸(VC)的清除率高。在多糖溶液濃度為4 mg/mL，清除率為45.8%，而同等濃度的VC組清除率為71.6%。見圖3。

與多糖濃度0.5 mg/mL相比，**P<0.01,***P<0.001圖3 山慈菇多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig 3 Scavenging effect of polysaccharides from Rhizoma Pleionis to DPPH radicals

2.4 山慈菇多糖清除羥自由基的能力

山慈菇多糖溶液及VC清除羥自由基(·OH)的效率隨濃度的增加而增強(qiáng)，兩組內(nèi)差異具有顯著性意義(P<0.05，P<0.001)。1 mg/mL、2 mg/mL及4 mg/mL濃度下，山慈菇多糖沒(méi)有VC的清除率高。濃度為0.5 mg/mL時(shí)，山慈菇多糖對(duì)羥自由基的清除能力(52.7%)明顯高于VC(29.3%)。見圖4。

***P<0.001圖4 山慈菇多糖對(duì)羥自由基的清除作用Fig 4 Scavenging effect of polysaccharides from Rhizoma Pleionis to hydroxyl radicals

3 討 論

人體因?yàn)榕c外界的持續(xù)接觸，包括呼吸(氧化反應(yīng))、外界污染、放射線照射等因素不斷的在人體體內(nèi)產(chǎn)生自由基[14]。人體在不可避免地產(chǎn)生自由基的同時(shí)，也在自然產(chǎn)生著抵抗自由基的抗氧化物質(zhì)，以抵消自由基對(duì)人體細(xì)胞的氧化攻擊。當(dāng)人體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化時(shí)，便會(huì)在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[15]。由氧化應(yīng)激水平升高誘發(fā)的最常見疾病有心臟病、癌癥、骨關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病以及神經(jīng)退化性問(wèn)題如阿爾茲海默癥[16]、帕金森病。所以選擇有利于人體健康并且抗氧化效果好的有效成分已經(jīng)成為現(xiàn)在研究的熱點(diǎn)。中藥多糖是近些年被研究證明具有免疫調(diào)節(jié)，抗氧化，抗炎，抗腫瘤，抗輻射，抗病毒，降血脂，降血糖等多種功能。許多中藥多糖被研究證明具有良好的抗氧化作用。比如靈芝多糖在體內(nèi)能夠通過(guò)提高CAT(過(guò)氧化氫酶)的活性，降低LPO(過(guò)氧化脂質(zhì))和MDA(丙二醛)的含量起到抗氧化的作用[17]。近年來(lái)，研究表明中藥復(fù)方多糖有明顯的抗氧化作用[18]，而且一些研究結(jié)果顯示中藥復(fù)方多糖組分間具有協(xié)同的作用[19]，從而提高了中藥復(fù)方多糖的抗氧化能力。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)室提取制備山慈菇多糖，測(cè)定其總糖含量。在溫度100 ℃、固液比1∶15、時(shí)間2 h及提取次數(shù)3次的工藝條件提取后，用苯酚-硫酸比色法測(cè)定山慈菇總糖濃度為30 mg/mL。并通過(guò)鄰苯三酚自氧化法，DPPH和Fenton法來(lái)共同測(cè)定山慈菇多糖的體外抗氧化作用，其中Fenton體系代表了水溶性自由基體系，而DPPH代表了脂溶性自由基體系；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明山慈菇多糖溶液清除超氧陰離子，DPPH自由基的清除率雖然沒(méi)有同等濃度下的VC的清除率強(qiáng)，但是仍然有較明顯的清除作用，并隨著多糖濃度的增加，清除能力增強(qiáng)。而且，在清除羥自由基的實(shí)驗(yàn)中，山慈菇多糖高濃度雖然沒(méi)有抗壞血酸對(duì)羥自由基的清除作用明顯，但是在濃度為0.5 mg/mL時(shí)，山慈菇多糖對(duì)羥自由基的清除能力高于VC，這表明低濃度的山慈菇多糖溶液仍然具有很強(qiáng)的羥自由基的清除能力。另外，山慈菇多糖對(duì)超氧陰離子，羥自由基，DPPH自由基的清除率都具有明顯的量效關(guān)系。

盡管，山慈菇多糖在同等濃度下的抗氧化作用效果不如VC，但是其抗氧化作用的發(fā)現(xiàn)仍然具有很重要的意義。眾所周知，VC是人體的高效抗氧化劑，還有許多重要的生物合成過(guò)程中也需要VC參與作用。但是大量服用VC后突然停藥會(huì)出現(xiàn)藥物的戒斷反應(yīng)。而且腎功能較差，胃酸分泌異常的人也不宜多服用VC。山慈菇的抗氧化作用雖然沒(méi)有VC的抗氧化作用強(qiáng)，但是山慈菇作為藥食同源的野生植物，也常常與其它中藥配伍使用，其多糖的副作用較小，這對(duì)多糖的抗氧化作用具有非常重要的營(yíng)養(yǎng)及藥理意義，對(duì)于開發(fā)山慈菇具有非常重要現(xiàn)實(shí)意義，但是其體內(nèi)抗氧化能力有待進(jìn)一步研究探明和確證其抗氧化作用和作用機(jī)制。

[1] 李勁, 鄧志芳, 高雯琪, 等. 中藥“龍泉復(fù)方”的不同配伍對(duì)腫瘤細(xì)胞系HepG-2和EC-1增殖的影響[J]. 中南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2011, 30(1): 46-49.

[2] 劉銀花, 鐘世軍, 曾濤, 等. 山慈菇提取液對(duì)小鼠4T1乳腺癌細(xì)胞抑制作用機(jī)制的研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016(1): 134-137.

[3] 李余先, 杜剛, 官麗麗, 等. 山慈菇提取物抑制血管形成的藥效學(xué)研究[J]. 吉林農(nóng)業(yè), 2015(11): 76-77.

[4] 徐小娟, 蔡懿鑫, 毛宇, 等. 山慈菇多糖對(duì)荷H22肝癌小鼠的抗腫瘤機(jī)制研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2015, 36(7): 23-25.

[5] Liang JR, Ai XX, Gao YH, et al. MALDI-TOF MS analysis of the extracellular polysaccharides released by the diatom Thalassiosira pseudonana[J]. J Appl Phycol, 2012, 25(2): 477-484.

[6] Du N, Tian W, Zheng D, et al. Extraction, purification and elicitor activities of polysaccharides from Chrysanthemum indicum[J]. Int J Biol Macromol, 2016, 82: 347-354.

[7] Wang Y, Jing Y, Leng F, et al. Establishment and Application of a Method for Rapid Determination of Total Sugar Content Based on Colorimetric Microplate[J]. Sugar Tech, 2016, 19(4): 424-431.

[8] 吳榮昆, 黃小流, 劉美金, 等. 井岡山馬齒莧多糖的體外抗氧化作用及總糖含量測(cè)定[J]. 井岡山大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2016, 37(2): 102-106.

[9] Zhang QA, Wang X, Song Y, et al. Optimization of Pyrogallol Autoxidation Conditions and Its Application in Evaluation of Superoxide Anion Radical Scavenging Capacity for Four Antioxidants[J]. J AOAC Int, 2016, 99(2): 504-511.

[10] Wang N, Zhang Y, Wang X, et al. Antioxidant property of water-soluble polysaccharides from Poria cocos Wolf using different extraction methods[J]. Int J Biol Macromol, 2016, 83: 103-110.

[11] Grajeda-Iglesias C, Salas E, Barouh N, et al. Antioxidant activity of protocatechuates evaluated by DPPH, ORAC, and CAT methods[J]. Food Chem, 2016, 194: 749-757.

[12] Maja Kozarskia, Anita Klausb, Dragica Jakovljevicc, et al.Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification[J]. Food Res Int,2014：53-64.

[13] 陳玲, 曹詩(shī)林, 李炳輝, 等. 知母多糖提取物生物活性的研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志, 2013, 40(2): 309-312.

[14] Valko M, Jomova K, Rhodes CJ, et al. Redox-and non-redox-metal-induced formation of free radicals and their role in human disease[J]. Arch Toxicol, 2016, 90(1): 1-37.

[15] Phaniendra A, Jestadi DB, Periyasamy L. Free radicals: properties, sources, targets, and their implication in various diseases[J]. Indian J Clin Biochem, 2015, 30(1): 11-26.

[16] Wojtunik-Kulesza KA, Oniszczuk A, Oniszczuk T, et al. The influence of common free radicals and antioxidants on development of Alzheimer's Disease[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 78: 39-49.

[17] Zhang J, Meng G, Zhai G, et al. Extraction, characterization and antioxidant activity of polysaccharides of spent mushroom compost of Ganoderma lucidum[J]. Int J Biol Macromol, 2016, 82: 432-439.

[18] 商云霞, 朱曉慶, 谷新利, 等. 中藥復(fù)方多糖對(duì)雞紅細(xì)胞免疫功能和SOD活性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 43(4): 214-217.

[19] 徐小芳, 羅燕, 趙民, 等. 中藥復(fù)方多糖對(duì)雞抗氧化功能的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(2): 706-713.

ExtractionandantioxidantactivityofpolysaccharidesfromRhizomaPleionis

FANG Yukun, NING Anhong, LIU Lei, ZHONG Mintao, ZHOU Shaozheng, HUANG Min

(DepartmentofMicrobiology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

ObjectiveTo extract polysaccharides from Rhizoma Pleionis and investigate its antioxidative activity in vitro.MethodsThe polysaccharides were extracted by hot water fromRhizomaPleionisand purified by phenol-sulfuric acid colorimetry. The antioxidative effects were determined by autoxidation of pyrogallol method，DPPH free radical scavenging assay and Fenton method. VC was used as a control with the concentration of 0.5, 1, 2 and 4 mg/mL.ResultsThe content of polysaccharide fromRhizomaPleioniswas 30 mg/mL. It had the function of removing superoxide anion radicals, DPPH free radicals and hydroxyl free radical. The scavenging effect enhanced with the increase of polysaccharide concentration. At the concentration of 0.5 mg/mL, the polysaccharide fromRhizomaPleionis’s capacity to scavenge hydroxyl free radical was higher than VC.ConclusionThe polysaccharides fromRhizomaPleioniscould have antioxidative effects by scavenging superoxide anion radicals, DPPH free radicals and hydroxyl free radicals.

polysaccharides fromRhizomaPleionis；polysaccharides of content determination；antioxidant activity in vitro

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30770018)

房宇坤(1991-)，女，碩士研究生。E-mail：476796625@qq.com

黃 敏，教授。E-mail：huangminchao@163.com

10.11724/jdmu.2017.06.02

R73

A

1671-7295(2017)06-0527-05

房宇坤，寧安紅，劉磊，等.山慈菇多糖的提取及其抗氧化作用的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2017,39(6)：527-531.

2017-08-24；

2017-11-11)