微流控芯片在腫瘤仿生模型構(gòu)建中的應(yīng)用

劉婷姣

(大連醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔病理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

專家述評

微流控芯片在腫瘤仿生模型構(gòu)建中的應(yīng)用

劉婷姣

(大連醫(yī)科大學(xué) 口腔醫(yī)學(xué)院 口腔病理學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

微流控芯片是一種在微米尺度下對流體進(jìn)行精確操控的新技術(shù)，已被證明是對哺乳動物細(xì)胞及其微環(huán)境進(jìn)行操控的理想平臺。本文擬圍繞腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對微流控芯片在腫瘤仿生模型構(gòu)建中的應(yīng)用作一綜述。目前，基于微流控芯片技術(shù)構(gòu)建的腫瘤仿生模型主要包括：腫瘤原發(fā)灶模型、腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生模型、腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲模型、腫瘤細(xì)胞外滲模型、腫瘤多器官轉(zhuǎn)移模型等。相對于傳統(tǒng)的體外研究方法，這些仿生模型很大程度上再現(xiàn)了體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，逐漸成為腫瘤研究極重要的平臺。

微流控芯片；腫瘤；仿生模型

微流控芯片(microfluidic chip)又稱芯片實(shí)驗(yàn)室(lab on a chip)，是一種可在微米尺度下精確操控流體的新技術(shù)，具有微型化和高通量的特點(diǎn)，并兼具可單元組合和功能集成的優(yōu)勢[1-4]。微流控技術(shù)可以同時處置分子、細(xì)胞、組織、器官，顯示物理量、化學(xué)量和生物量，已經(jīng)被證明是對哺乳動物細(xì)胞及其微環(huán)境進(jìn)行操控的理想平臺，它消耗低、通量高、仿生性強(qiáng)。得益于現(xiàn)代化的微加工技術(shù)和微通道內(nèi)精準(zhǔn)的流體控制，研究者已經(jīng)可以在微流控芯片上構(gòu)建微米量級且相對封閉的細(xì)胞培養(yǎng)、刺激、分選、裂解、分析等操作單元，并把這種成功延伸到組織和器官的仿生模擬[4]。目前，微流控芯片仿生肺、仿生肝、仿生腎、仿生心臟、仿生腸等已見諸報道，這些研究從學(xué)術(shù)角度證明，在一塊僅有幾平方厘米的薄片上模擬人體生理結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)所謂芯片器官(organ on a chip)已經(jīng)可行[5-9]。

腫瘤是全球性疾病，在導(dǎo)致人類死亡的疾病中位居第二，僅次于心血管疾病，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的最主要原因。腫瘤轉(zhuǎn)移是個復(fù)雜的過程，以血行轉(zhuǎn)移為例通常包括以下幾個步驟：(1)瘤細(xì)胞在原位增殖、侵襲；(2)原發(fā)灶瘤細(xì)胞進(jìn)入血管，即內(nèi)滲；(3)瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視在血液循環(huán)中存活下來，成為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)；(4)CTC在遠(yuǎn)處器官黏附于內(nèi)皮細(xì)胞并穿出血管，即外滲；(5)進(jìn)入遠(yuǎn)處器官的瘤細(xì)胞克隆性增殖形成轉(zhuǎn)移灶[10-13]。本課題組是國內(nèi)較早從事醫(yī)學(xué)與微流控芯片學(xué)科交叉研究的科研團(tuán)隊(duì)，我們以微流控芯片為技術(shù)平臺成功構(gòu)建了多個腫瘤模型。以下將圍繞腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)對微流控芯片在腫瘤仿生模型構(gòu)建中的應(yīng)用做一簡單介紹。

1 腫瘤原發(fā)灶模型

腫瘤原發(fā)灶是一個復(fù)雜的包括多種細(xì)胞(如瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)和細(xì)胞因子的組織微環(huán)境，腫瘤微環(huán)境對瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等發(fā)揮重要的調(diào)控作用[14-15]?；谖⒘骺匦酒哪[瘤原發(fā)灶模型主要是將瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、ECM和細(xì)胞因子等集成于一塊芯片，模擬腫瘤微環(huán)境。

傳統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)器材包括培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶和孔板等，常常對細(xì)胞進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，即二維(two dimentional, 2D)細(xì)胞培養(yǎng)。但是，越來越多的研究結(jié)果證實(shí)當(dāng)細(xì)胞處于由ECM組成的三維(three dimentional, 3D)微環(huán)境中時，其生物學(xué)行為及所表達(dá)的基因更接近于體內(nèi)狀況，由此導(dǎo)致體外3D細(xì)胞培養(yǎng)被越來越多的研究者所重視并采納[16-19]。目前常用的ECM替代物包括商品化的基底膜樣物質(zhì)，例如BD公司的Matrigel TM和R&D公司的Cultrex PathClear Basement Membrane Extract(BME)。此外，I型膠原也常被用于細(xì)胞3D培養(yǎng)。在微流控芯片上進(jìn)行的細(xì)胞3D培養(yǎng)，不但為細(xì)胞提供ECM支架，還可以利用微流控技術(shù)在ECM內(nèi)形成生長因子的濃度梯度，考察癌細(xì)胞在生長因子誘導(dǎo)下的侵襲過程(圖1A)[20]。3D培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞還常常表現(xiàn)出對化療藥物的耐藥性增加[21-23]。因此，基于微流控芯片的細(xì)胞3D培養(yǎng)有可能成為篩選化療藥物的一個重要平臺[24-26]。

除ECM以外，腫瘤微環(huán)境中的間質(zhì)細(xì)胞對腫瘤發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要的調(diào)控作用[27-29]。研究者利用微流控芯片的多維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)為不同種類的細(xì)胞構(gòu)建培養(yǎng)空間，在芯片上實(shí)現(xiàn)異種細(xì)胞的3D共培養(yǎng)，考察細(xì)胞間的相互作用。例如，本課題組在微流控芯片平臺上實(shí)現(xiàn)了癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)與唾液腺癌細(xì)胞的非接觸式3D共培養(yǎng)(圖1B)，發(fā)現(xiàn)在CAFs的誘導(dǎo)下癌細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)，以細(xì)胞團(tuán)的形式侵入鄰近基質(zhì)內(nèi)[30]。Jeong SY等[31]研究者將結(jié)直腸癌細(xì)胞與成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞的增殖活性和基因表達(dá)與單獨(dú)3D培養(yǎng)的癌細(xì)胞比較均發(fā)生明顯的變化。Kobayashi A等[32]利用微流控芯片細(xì)胞圖案化功能將肝癌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞排列成緊密相鄰的條帶，結(jié)果表明肝癌細(xì)胞分泌白蛋白的功能顯著增強(qiáng)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明癌細(xì)胞與間質(zhì)細(xì)胞的3D共培養(yǎng)為癌細(xì)胞提供了一個與體內(nèi)接近的微環(huán)境，這些微流控芯片有望成為腫瘤研究的理想平臺。

A:細(xì)胞3D培養(yǎng)微流控芯片；B:細(xì)胞3D共培養(yǎng)微流控芯片圖1 細(xì)胞3D培養(yǎng)及3D共培養(yǎng)微流控芯片[20, 30]Fig 1 Tumor cells 3D culture and co-culture on microfluidic chips[20,30]

2 腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)血管新生模型

血管新生(angiogenesis)是指從原有血管通過“芽生”的方式形成新的腔狀毛細(xì)血管的過程，涉及ECM的降解及血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[33]。出芽的內(nèi)皮細(xì)胞包括位于最前端的端細(xì)胞(tip cells)和緊隨其后的莖細(xì)胞(stalk cells)及方陣細(xì)胞(phalanx cells)。端細(xì)胞具有長的絲足，侵襲能力較強(qiáng)，能夠引導(dǎo)其他內(nèi)皮細(xì)胞朝著有血管生成刺激因素的方向生長；莖細(xì)胞緊隨端細(xì)胞之后，具有較強(qiáng)的增殖能力，可以形成新的管腔；在發(fā)育成熟的血管中，內(nèi)皮細(xì)胞增殖活力較弱，緊密排列成方陣樣，有利于血流的順利通過，此處的內(nèi)皮細(xì)胞稱為方陣細(xì)胞。

腫瘤組織的微血管密度常常高于正常組織，這是由于腫瘤細(xì)胞具有活躍的誘導(dǎo)血管新生能力[34-35]。體外構(gòu)建腫瘤誘導(dǎo)的血管新生模型至少需要包括腫瘤細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、ECM、血管新生誘導(dǎo)因子等要素，并為血管新生提供適當(dāng)?shù)目臻g。本課題組以微流控技術(shù)為主要手段構(gòu)建了一個腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生體外模型，在微流控芯片上模擬腫瘤原發(fā)灶和微血管，二者之間以血管新生通道相連。研究結(jié)果表明瘤細(xì)胞的分泌物在血管新生通道內(nèi)擴(kuò)散形成濃度梯度，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽生長，產(chǎn)生具有長絲足的端細(xì)胞，位于新生血管的前沿。為進(jìn)一步驗(yàn)證微流控模型的可靠性，我們比較了不同腫瘤細(xì)胞在微流控模型和裸鼠皮下移植瘤模型中的誘導(dǎo)血管新生能力，結(jié)果表明體外模型與體內(nèi)模型的結(jié)果具有一致性，提示該微流控模型可以部分取代動物模型[36]。Shin Y等[37]詳細(xì)描述了一種微流控芯片的設(shè)計(jì)，以及如何在芯片上進(jìn)行腫瘤細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的3D-2D聯(lián)合培養(yǎng)，進(jìn)而誘導(dǎo)血管新生。Kim S等[38]研究者構(gòu)建了一個具有5條平行通道的微流控芯片，通道間以微柱相隔，在不同的通道內(nèi)分別接種血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和癌細(xì)胞，培養(yǎng)一段時間后，內(nèi)皮細(xì)胞向ECM通道出芽生長，形成了具有管腔的微血管，這些微血管表達(dá)VE-cadherin、CD31、ICAM-1等正常微血管的標(biāo)志物，而且具有血管的屏障功能，并在一定時間內(nèi)保持穩(wěn)定(圖2)。最近，該研究小組利用微流控技術(shù)精確控制生長因子的濃度和空間分布、內(nèi)皮細(xì)胞-間質(zhì)細(xì)胞相互作用、間隙流對淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)械刺激等多種化學(xué)和機(jī)械因素，在與上述研究結(jié)構(gòu)相同的微流控芯片上成功再現(xiàn)了淋巴管新生。間隙流是指在ECM間隙內(nèi)流動的液體，可以在毛細(xì)血管、淋巴管、ECM之間進(jìn)行物質(zhì)傳遞，這種緩慢流動的液體還對位于ECM內(nèi)的細(xì)胞產(chǎn)生剪切力刺激，從而影響細(xì)胞的增殖和分化等。上述研究在微流控平臺上證明間隙流對淋巴管的出芽和生長具有重要的調(diào)控作用[39]。

Ⅰ：微流控芯片照片及示意圖；Ⅱ：新生血管免疫熒光照片圖2 基于微流控芯片的血管新生[38]Fig 2 Angiogenesis on a microfluidic chip[38]

3 腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲模型

腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶侵入血管的內(nèi)滲過程是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個重要環(huán)節(jié)，動物模型研究很難抓住到這一短暫的關(guān)鍵點(diǎn)。Zervantonakis IK等[40]研究人員構(gòu)建了用于研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)滲的微流控芯片，該芯片由3條平行的通道組成，之間以微柱相隔，中間通道充滿ECM替代物，兩側(cè)分別用于模擬微血管和腫瘤組織。研究者在該芯片上實(shí)時考察了腫瘤細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用、瘤細(xì)胞穿過內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入血管的動態(tài)過程，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞分泌的腫瘤壞死因子可以損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的屏障功能，導(dǎo)致內(nèi)滲腫瘤細(xì)胞數(shù)目顯著增加。Lee H等[41]在微流控芯片上將血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞接種于不同的空間，模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境，改變腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)方式(2D培養(yǎng)或3D培養(yǎng))和生長空間，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出不同的生物學(xué)行為。例如將癌細(xì)胞進(jìn)行3D培養(yǎng)時可以誘發(fā)血管新生，而將癌細(xì)胞進(jìn)行2D培養(yǎng)時，可有誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)滲。

4 腫瘤細(xì)胞外滲模型

CTC經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)遠(yuǎn)處器官，黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，穿出血管壁的過程稱為外滲，是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的一個重要限速步驟。體外構(gòu)建腫瘤細(xì)胞外滲模型至少需要集成CTC、血管、特異性血管周圍組織等單元。生物學(xué)研究已經(jīng)證實(shí)肺、肝、骨等器官高表達(dá)趨化因子CXCL12，乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)CXCL12的受體CXCR4，CXCL12/CXCR4生物軸在乳腺癌的血行轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[42-43]。本課題組在微流控芯片上構(gòu)建了內(nèi)襯血管內(nèi)皮細(xì)胞的微血管、具有CXCL12濃度梯度的管周基質(zhì)，然后將高表達(dá)CXCR4的腫瘤細(xì)胞團(tuán)加入微血管單元，實(shí)時考察了腫瘤細(xì)胞團(tuán)在趨化因子誘導(dǎo)下穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入管周組織的內(nèi)滲過程及其影響因素[44]。Bersini S等[45]在微流控芯片上誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，用于模擬骨髓微環(huán)境，然后在鄰近骨髓微環(huán)境的微血管通道內(nèi)加入乳腺癌細(xì)胞，考察癌細(xì)胞穿過血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障進(jìn)入骨髓微環(huán)境的外滲過程(圖3)。

A：微流控芯片上細(xì)胞分布示意圖；B：芯片上面觀；C：芯片前面觀；D：茜素紅染色顯示成骨細(xì)胞分化；E：成骨細(xì)胞分泌骨鈣蛋白(綠色)圖3 基于微流控芯片的腫瘤細(xì)胞外滲研究[45]Fig 3 Tumor extravasation on a microfluidic chip[45]

5 腫瘤多器官轉(zhuǎn)移模型

腫瘤晚期可以發(fā)生多器官轉(zhuǎn)移，體外構(gòu)建腫瘤多器官轉(zhuǎn)移模型有助于明確影響腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)因素，以及篩選抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。本課題組以微流控芯片為平臺構(gòu)建了腫瘤肺、肝、骨等多器官轉(zhuǎn)移模型。該模型包括兩個主要功能模塊，上層模塊包含4條分枝狀的微通道，用于模擬血管；下層模塊包括4個培養(yǎng)池，可以接種不同的細(xì)胞或組織，用于模擬不同的器官。我們在芯片模型上考察了肺、肝、骨、骨骼肌等原代細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移，結(jié)果表明腫瘤細(xì)胞趨向于轉(zhuǎn)移至仿生肺、肝、骨等單元，而很少轉(zhuǎn)移至仿生骨骼肌單元。通過與肺轉(zhuǎn)移動物模型相比較，腫瘤細(xì)胞在芯片模型上的轉(zhuǎn)移能力與在動物模型上基本一致，提示該芯片模型有望在某種程度上取代動物模型[46]。

6 展 望

實(shí)驗(yàn)動物一直是腫瘤臨床前研究的重要模型，但是動物模型價格昂貴，實(shí)驗(yàn)周期長，而且與人類存在種屬差異性，極大地限制了腫瘤基礎(chǔ)研究的發(fā)展和抗腫瘤藥物的研發(fā)。隨著材料學(xué)和微加工技術(shù)的不斷發(fā)展，微流控技術(shù)在仿生模型上的應(yīng)用越來越廣泛，腫瘤仿生模型已逐漸克服以往細(xì)胞種類單一、功能簡單等缺陷，逐步發(fā)展成為多器官和多功能的系統(tǒng)模型。我們期待微流控腫瘤仿生模型在將來能夠逐漸替代實(shí)驗(yàn)動物，推動腫瘤研究的發(fā)展。

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Biomimetictumormodelsbasedonmicrofluidicchips

LIU Tingjiao

(DepartmentofOralPathology，CollegeofStomatology，DalianMedicalUniversity，Dalian116044，China)

Microfluidic chips, a new technology for precisely manipulating fluids at the micron scale, have proven to be ideal platforms for manipulating mammalian cells and their microenvironments. This article aims to review the application of microfluidic chips in the construction of tumor biomimetic models around some key parts of tumor metastasis. Currently, tumor biomimetic models based on microfluidic chip technology mainly include tumor primary tumor model, tumor cell induced angiogenesis model, tumor cell infiltration model, tumor cell extravasation model and tumor multi-organ metastasis model. Compared with the traditional in vitro research methods, these bionic models reproduce the in vivo tumor microenvironment to a large extent and gradually become an important platform for tumor research.

microfluidic chip; tumor; biomimetic model

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30700955, 30872897, 81171425, 81571767)；遼寧省教育廳項(xiàng)目(LR201013)；遼寧省科技廳項(xiàng)目(20071080)；中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(20080441105)；大連市優(yōu)秀青年科技人才基金項(xiàng)目(2008J23JH037)

劉婷姣，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：基于微流控芯片的腫瘤仿生模型的構(gòu)建和應(yīng)用。E-mail: tingjiao@dmu.edu.cn

10.11724/jdmu.2017.06.01

R737. 33

A

1671-7295(2017)06-0521-06

劉婷姣.微流控芯片在腫瘤仿生模型構(gòu)建中的應(yīng)用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2017,39(6)：521-526.

2017-10-08；

2017-11-10)