豐富環(huán)境對(duì)血管性癡呆大鼠側(cè)腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)再生的影響①

賀旭，劉英飛，羅明英，成紹武，葛金文

·基礎(chǔ)研究·

豐富環(huán)境對(duì)血管性癡呆大鼠側(cè)腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)再生的影響①

賀旭1,2,3，劉英飛4，羅明英5，成紹武2,3，葛金文2,3

目的探討豐富環(huán)境(EE)對(duì)血管性癡呆大鼠側(cè)腦室室管膜下區(qū)(SVZ)神經(jīng)再生的影響。方法29只大鼠分成假手術(shù)組(n=5)、血管性癡呆組(VD組，n=12)和豐富環(huán)境組(EE組，n=12)。采用兩血管阻斷法(2-VO)制作血管性癡呆模型。VD組和假手術(shù)組常規(guī)飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)，EE組給予豐富環(huán)境干預(yù)。30 d后免疫組織化學(xué)染色觀察SVZ微管相關(guān)蛋白Doublecortin(DCX)與外源性細(xì)胞增殖標(biāo)記物BrdU的表達(dá)，免疫熒光雙標(biāo)觀察SVZ DCX/Ki67、DCX/p-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的共表達(dá)情況。結(jié)果與假手術(shù)組相比，VD組BrdU+細(xì)胞數(shù)目(t=2.989,P=0.026)、DCX+細(xì)胞平均光密度值(t=3.069,P=0.005)增加；與VD組比較，EE組BrdU+細(xì)胞數(shù)目(t=3.067,P=0.027)、DCX+細(xì)胞平均光密度值(t=2.907,P=0.011)進(jìn)一步增加。EE組DCX/Ki67(t=2.994,P=0.040)、DCX/p-CREB(t=4.707,P=0.009)共表達(dá)細(xì)胞高于VD組。結(jié)論豐富環(huán)境可通過CREB信號(hào)通路上調(diào)血管性癡呆大鼠SVZ神經(jīng)再生水平。

血管性癡呆；豐富環(huán)境；室管膜下區(qū)；神經(jīng)再生；大鼠

血管性癡呆(vascular dementia,VD)是指由一系列如腦缺血等血管因素導(dǎo)致腦組織損害引起的神經(jīng)功能損害，同時(shí)伴有認(rèn)知功能減退為特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。公共流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，VD發(fā)病率在所有癡呆類型中高居第二，僅次于阿爾茨海默病[2-4]。VD最顯著的特征是神經(jīng)元的丟失和伴有認(rèn)知功能的損害[5]。臨床實(shí)驗(yàn)表明，藥物和免疫干預(yù)在降低輕度認(rèn)知損害和癡呆等方面難以取得滿意臨床效果。側(cè)腦室室管膜下區(qū)(subventricular zone,SVZ)作為一個(gè)神經(jīng)發(fā)生區(qū)域之一，貫穿于動(dòng)物終生。VD后SVZ內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化，出現(xiàn)神經(jīng)再生，但產(chǎn)生的細(xì)胞難以完全替代凋亡的細(xì)胞。因此，我們亟需尋找一種新的方法或手段延緩VD的發(fā)病進(jìn)程。

豐富環(huán)境(enriched environment,EE)是指動(dòng)物所生活空間環(huán)境變大，成員擴(kuò)大以及內(nèi)置新穎物體數(shù)量增加，表現(xiàn)為可提供多感官刺激、主動(dòng)性運(yùn)動(dòng)及相互間社會(huì)交往機(jī)會(huì)。研究發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境干預(yù)可增加智力，延緩衰老，有益于腦缺血后小鼠運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，提高其社交功能[6]。Doublecortin(DCX)作為一種微管相關(guān)蛋白，表達(dá)在遷移的成神經(jīng)細(xì)胞和未成熟神經(jīng)元中，代表神經(jīng)再生的水平[7-8]。豐富環(huán)境可以通過上調(diào)海馬突觸可塑性和促進(jìn)梨狀皮質(zhì)DCX的表達(dá)而改善癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶[9-10]。但是關(guān)于豐富環(huán)境是否可促進(jìn)VD大鼠SVZ神經(jīng)再生鮮有報(bào)道。本研究通過二血管阻斷法建立VD模型，觀察豐富環(huán)境對(duì)VD大鼠SVZ的影響，探究豐富環(huán)境在VD大鼠中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

出生2個(gè)月左右、體質(zhì)量(260±15)g的SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK(湘)2013-0004。動(dòng)物房室溫保持(23±1)℃，相對(duì)濕度50%～55%，通風(fēng)條件好，飼養(yǎng)于光照/黑暗為12 h/12 h的環(huán)境，自由飲水，定期更換墊料，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

冰凍切片機(jī)：英國(guó)Shan Don公司。Kopf腦立體定位儀：美國(guó)David KOPF Instruments公司。BX67熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司。鼠抗BrdU抗體，批號(hào)MCA2060：英國(guó)SEROTEC公司。羊抗DCX抗體，批號(hào)SC-8066：美國(guó)SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司。兔抗Ki67，批號(hào)：美國(guó)VECTOR公司。兔抗p-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)抗體，批號(hào)9198：美國(guó)CELL SIGNALING公司。生物素化山羊抗大鼠：武漢博士德公司。廣譜生物素化二抗：美國(guó)VECTOR公司。二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)：美國(guó)SIGMA公司。Alexa Fluor 488與Alexa Fluor 594偶聯(lián)驢抗兔及驢抗山羊IgG：美國(guó)INVITROGEN公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型建立

采用兩血管結(jié)扎法[10-11]永久性結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈建立VD模型。所有大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，仰臥固定在Kopf腦立體定位儀上。去毛，碘伏消毒，從頸部一側(cè)做手術(shù)切口，分離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，用7號(hào)手術(shù)線永久性結(jié)扎?？紤]到同時(shí)結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后，大鼠死亡率高，因此1周后，從頸部另一側(cè)做一切口，分離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，永久性結(jié)扎。模型制作過程中盡量減少大鼠的痛疼和動(dòng)物的使用數(shù)量。

假手術(shù)組(n=5)大鼠分離頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)，但不結(jié)扎，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)參與實(shí)驗(yàn)研究的大鼠進(jìn)行編號(hào)，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、VD組和EE組。VD組(n=12)每籠4只，常規(guī)飼養(yǎng)30 d；EE組(n=12)每天放入1.5×1.5×1.5 m的木質(zhì)曠場(chǎng)進(jìn)行豐富環(huán)境刺激8 h(8:30 am～16:30 pm)，共30 d。

豐富環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：提供標(biāo)準(zhǔn)鼠糧、水；放置各種顏色的管道及小球、塑料房子、小桶、滑輪及乒乓球等；曠場(chǎng)內(nèi)的物品每天更換，同時(shí)用75%酒精擦洗；每天更換曠場(chǎng)內(nèi)大鼠墊料和擦洗曠場(chǎng)內(nèi)壁和地板，以消除大鼠留下來的氣味。

三組大鼠處死前7 d腹腔注射BrdU 50 mg/kg(終濃度50 mg/ml)，連續(xù)注射3次，每次間隔8 h。造模30 d后免疫組化觀察三組大鼠SVZ DCX+細(xì)胞，BrdU+細(xì)胞；熒光雙標(biāo)觀察DCX/Ki67與DCX/p-CREB共表達(dá)細(xì)胞。

1.3.3腦組織標(biāo)本的制備

10%水合氯醛3.5 ml/kg麻醉成功后，穿刺針從大鼠心尖部位插入直到主動(dòng)脈，生理鹽水快速灌注沖洗血液，然后改用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(polyformaldehyde phosphate buffer,PF)灌注；取出鼠腦，4%PF后固定過夜；梯度沉糖(15%和30%各一遍)以防止冰晶出現(xiàn)；包埋。采用冠狀位切片，鄰片法：恒溫冰凍切片出現(xiàn)側(cè)腦室解剖結(jié)構(gòu)時(shí)，先切1套12張厚30 μm腦片放入組織培養(yǎng)板，然后切取1套12張厚6 μm切片，接著棄取12×30 μm+12×6 μm組織，再收集下一輪腦片。其中免疫組織化學(xué)染色選用30 μm腦片，而免疫熒光雙標(biāo)染色則采用6 μm腦片。

1.3.4ABC法免疫組織化學(xué)染色

0.01 mmol/L PBS(pH=7.3)漂洗腦片3次，每次10 min；3%H2O2處理30 min，漂洗3次，每次10 min；5%馬血清+0.1%tritonX-100(0.01 mmol/L)孵育2 h；加入羊抗DCX(1∶1000)4℃孵育過夜；漂洗3次，每次10 min；加入生物素化馬抗山羊IgG(1∶400)室溫孵育2 h；抗生物素蛋白-生物素復(fù)合物(ABC Kit)(1∶400)：A液與B液提前30 min混勻，室溫孵育2 h。DAB顯色，酒精脫水，二甲苯脫脂，中性樹脂封片。

鼠抗BrdU的實(shí)驗(yàn)步驟：甲醇∶30%H2O2∶PB=7∶1∶2處理腦片15 min，消除內(nèi)源性過氧化物酶；在65℃水浴鍋中使用50%甲酰胺∶檸檬酸鈉=1∶1進(jìn)行抗原修復(fù)；2 N HCl處理組織30 min；0.01 mol/L Tris-HCl反應(yīng)10 min；馬血清孵育后加入大鼠抗BrdU(1∶1000)4℃孵育過夜；加入生物素化馬抗大鼠IgG(1∶400)室溫孵育2 h，其他實(shí)驗(yàn)步驟同前。

1.3.5免疫熒光組織化學(xué)染色

0.01 mol/L PBS洗滌3次，每次10 min；5%驢血清+0.1%tritonX-100磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L)孵育2 h；加入山羊抗DCX(1∶1000)和兔抗Ki67(1∶1000)以及山羊抗 DCX(1∶1000)和兔抗p-CREB(1∶1000)，4℃過夜；0.01 mmol/L PBS-T溶液漂洗3次，每次10 min；Alexa Fluor 488與Alexa Fluor 594偶聯(lián)驢抗兔和驢抗山羊IgG(1∶400)孵育2 h；漂洗3次，每次10 min；雙苯酰亞胺(1∶5000)染核10 min；漂洗；貼片；50%甘油封片。

1.4 圖片分析

拍照時(shí)各組免疫組織化學(xué)和免疫熒光切片曝光度和像素保持一致。每套組化和熒光切片取相同的部位進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。考慮到SVZ DCX+細(xì)胞密集，因此采用NIH Image J計(jì)算平均光密度值(average optical density,AOD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Prism GraphPad 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以(xˉ±s)表示，通過單因素或者配對(duì)Studentt檢驗(yàn)比較組間差異。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BrdU+

與假手術(shù)組相比，VD組BrdU+細(xì)胞數(shù)目增加(P＜0.05)。與VD組比較，EE組BrdU+細(xì)胞數(shù)目增加(P＜0.05)。見圖1、表1。

2.2 DCX+

DCX+細(xì)胞在大量聚集成團(tuán)狀。見圖2。與假手術(shù)組相比，VD組DCX+細(xì)胞平均光密度值明顯增加(P＜0.01)。與VD組比較，EE組DCX+細(xì)胞平均光密度值進(jìn)一步上升(P＜0.05)。見表1。

2.3 DCX/ki67

VD組和EE組的DCX細(xì)胞可經(jīng)過側(cè)腦室下角遷移到紋狀體，并與內(nèi)源性細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki67發(fā)生共表達(dá)。見圖3。EE組DCX/ki67共表達(dá)細(xì)胞數(shù)高于VD組(P＜0.05)。見表1。

2.4 DCX/p-CREB

VD組和EE組的DCX細(xì)胞與核轉(zhuǎn)錄因子p-CREB有共表達(dá)。見圖4。EE組DCX/p-CREB共表達(dá)細(xì)胞數(shù)明顯高于VD組(P＜0.01)。見表1。

圖1 三組SVZ BrdU+細(xì)胞表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，bar=100 μm)

圖2 三組SVZ DCX+細(xì)胞表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，bar=100/50 μm)

圖3 VD組和EE組SVZ DCX/Ki67共表達(dá)(免疫熒光染色，bar=100 μm)

圖4 VD組和EE組SVZ DCX/p-CREB共表達(dá)的影響(免疫熒光染色，bar=100μm)

表1 三組SVZ BrdU+、DCX+表達(dá)及DCX與Ki67、DCX/p-CREB共表達(dá)情況

3 討論

豐富環(huán)境是指在生存環(huán)境和社會(huì)交往兩個(gè)方面相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境更加復(fù)雜的環(huán)境，具體表現(xiàn)為多感官刺激、自愿物理運(yùn)動(dòng)、社會(huì)性刺激及相互交往機(jī)會(huì)的增多。遭受物理損傷、化學(xué)傷害或者神經(jīng)系統(tǒng)病變后，豐富環(huán)境均能上調(diào)嚙齒類動(dòng)物或其他哺乳動(dòng)物海馬的神經(jīng)再生能力[12-15]。

VD發(fā)病機(jī)制涉及到腦血管因素引起腦組織缺血缺氧，進(jìn)而造成神經(jīng)元凋亡或丟失等病理改變[16]。我們之前的研究表明，豐富環(huán)境能通過促進(jìn)梨狀皮質(zhì)未成熟神經(jīng)元的表達(dá)與分化，從而改善VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶[10]。本次研究我們進(jìn)一步觀察豐富環(huán)境對(duì)VD大鼠SVZ神經(jīng)再生的影響。

DCX作為一種微管相關(guān)蛋白，起促進(jìn)微管聚合的作用，表達(dá)在遷移的成熟神經(jīng)細(xì)胞和未成熟神經(jīng)元中，是成年神經(jīng)再生的重要標(biāo)記物，可以標(biāo)記在有絲分裂后的神經(jīng)前體細(xì)胞和未成熟神經(jīng)元中，代表神經(jīng)再生的水平[8,17]，常受外界環(huán)境刺激[18]或者正常行為經(jīng)驗(yàn)的調(diào)控[19]。BrdU作為胸腺嘧啶類似物，是外源性細(xì)胞增殖標(biāo)記物，通常通過腹腔注射標(biāo)記胚胎期和成年期分裂細(xì)胞的S期。

目前研究神經(jīng)再生常聯(lián)合運(yùn)用這兩種方法。本研究通過免疫組織化學(xué)染色觀察三組大鼠SVZ DCX+細(xì)胞和BrdU+細(xì)胞的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VD組SVZ DCX+細(xì)胞和BrdU+細(xì)胞的表達(dá)較假手術(shù)組增加。這可能是因?yàn)檎３赡甏笫骃VZ的神經(jīng)前體細(xì)胞處于“靜息”狀態(tài)，而兩側(cè)頸總動(dòng)脈夾閉產(chǎn)生腦缺血環(huán)境，從而刺激和加速SVZ內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖。給予VD大鼠豐富環(huán)境干預(yù)后，DCX+細(xì)胞和BrdU+細(xì)胞進(jìn)一步增加。這表明豐富環(huán)境使VD大鼠腦內(nèi)內(nèi)源性神經(jīng)前體細(xì)胞激活的現(xiàn)象更加明顯。

Ki67是一種核蛋白，是內(nèi)源性細(xì)胞增殖標(biāo)記物，可以發(fā)現(xiàn)于除了G0和早期G1階段外細(xì)胞周期的所有時(shí)期，在靜止期Ki67不表達(dá)[20]。免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果顯示，VD組和EE組均有DCX/Ki67細(xì)胞，且EE組共表達(dá)細(xì)胞高于VD組。這說明兩血管阻斷法制備的癡呆大鼠SVZ中有部分未成熟神經(jīng)元處于細(xì)胞增殖階段，并且給予豐富環(huán)境干預(yù)后可以加速神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖。

CREB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，CREB信號(hào)通路被激活后可參與神經(jīng)發(fā)育與再生、突觸可塑性及認(rèn)知功能等多種生物學(xué)作用，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明CREB信號(hào)通路參與了嗅球[21]、海馬[22-23]、SVZ[24]及吻側(cè)遷移流[25]的神經(jīng)再生。本研究使用免疫熒光雙標(biāo)技術(shù)觀察SVZ DCX/p-CREB的共表達(dá)情況，結(jié)果顯示EE組DCX/p-CREB細(xì)胞高于VD組。這表明豐富環(huán)境可通過CREB信號(hào)通路的磷酸化而調(diào)控VD大鼠SVZ神經(jīng)再生。

綜上所述，豐富環(huán)境可以促進(jìn)VD大鼠SVZ神經(jīng)再生，加速VD大鼠SVZ神經(jīng)前體細(xì)胞的產(chǎn)生及增殖，且豐富環(huán)境通過CREB信號(hào)通路調(diào)控VD大鼠SVZ神經(jīng)再生。

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Effect of Enriched Environment on Neuroregeneration in Subventricle Zone of Rats with Vascular Dementia

HE Xu1,2,3,LIU Ying-fei4,LUO Ming-ying5,CHENG Shao-wu2,3,GE Jin-wen2,3
1.Department of Anatomy,Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000,China;2.Department of Integrated Traditional and Western Medicine,Hunan University of Traditional Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China;3.Key Laboratory of Hunan Province for Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Prevention and Treatment of Cardio-Cerebral Disease,Changsha,Hunan 410208,China;4.Hospital Affiliated to Yiyang Medical College,Yiyang,Hunan 413000,China;5.Department of Human Anatomy,Kunming Medical College,Kunming,Yunnan 650500,China

GE Jin-wen.E-mail:40831556@qq.com

ObjectiveTo explore the effect of enriched environment on neuroregeneration in subventricle zone(SVZ)of rats with vascular dementia.MethodsAll rats were divided into sham group(n=5),vascular dementia group(VD group,n=12)and enriched environment group(EE group,n=12).Then,2-VO method was applied to make the vascular dementia model.The sham group and VD group

conventional breeding environment for 30 days,while EE group was subjected to enriched environment for 30 days.Immunohistochemistry was applied to detect the BrdU and Doublecortin(DCX)expression in SVZ,and DCX/Ki67,DCX/p-cAMP-response element binding protein(CREB)expression in SVZ was assessed by immunofluorescence double-labeling technique.ResultsCompared with the sham group,the number of DCX+cells(t=2.989,P=0.026)and BrdU+cells(t=3.069,P=0.005)increased in VD group,and increased more in EE group(t=3.067,P=0.027;t=2.907,P=0.011).Besides,the number of the DCX/Ki67(t=2.994,P=0.040)and DCX/p-CREB(t=4.707,P=0.009)cells was significantly higher in EE group than in VD group.ConclusionEnriched environment could up-regulate the neuroregeneration capacity in SVZ of rats with vascular dementia through CREB signal pathway.

vascular dementia;enriched environment;subventricle zone;neuroregeneration;rats

R749.1

A

1006-9771(2017)12-1384-06

[本文著錄格式]賀旭，劉英飛，羅明英，等.豐富環(huán)境對(duì)血管性癡呆大鼠側(cè)腦室室管膜下區(qū)神經(jīng)再生的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(12):1384-1389.

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81500377)；2.湖南省教育廳優(yōu)秀青年課題(No.16B269)；3.益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校引進(jìn)高層次人才科研啟動(dòng)費(fèi)項(xiàng)目(No.2016-001)。

1.益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校解剖教研室，湖南益陽市413000；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙市410208；3.中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙市410208；4.益陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院內(nèi)一科，湖南益陽市413000；5.昆明醫(yī)科大學(xué)人體解剖教研室，云南昆明市650500。作者簡(jiǎn)介：賀旭(1984-)，男，漢族，湖南邵陽市人，博士，講師，主要研究方向：中藥在心腦血管疾病神經(jīng)發(fā)生與神經(jīng)再生的作用。通訊作者：葛金文(1965-)，男，漢族，湖南婁底市人，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：腦血管病發(fā)病機(jī)制及中西醫(yī)結(jié)合防治研究和中西醫(yī)結(jié)合方法學(xué)研究。E-mail:40831556@qq.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.12.004

CITED AS:He X,Liu YF,Luo MY,et al.Effect of enriched environment on neuroregeneration in subventricle zone of rats with vascular dementia[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(12):1384-1389.

2017-06-30

2017-08-17)