丙酮酸乙酯對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

熊婧 胡丹 張振濤 張兆輝

·論 著·

丙酮酸乙酯對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

熊婧 胡丹 張振濤 張兆輝

目的建立魚藤酮(Rotenone, Rot)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型，探討丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate，EP)對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制。方法Rot作用于SH-SY5Y細(xì)胞，構(gòu)建Rot誘導(dǎo)的PD細(xì)胞模型，使用不同濃度的EP作用于PD細(xì)胞模型，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，Annexin V/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡，免疫印跡法檢測(cè)LC3 Ⅱ/Ⅰ、P62蛋白的表達(dá)，免疫熒光染色觀察HMGB1的表達(dá)及定位。結(jié)果EP減輕了Rot引起的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并提高了細(xì)胞活力；EP減少了Rot誘導(dǎo)的LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)比例增高，增加P62蛋白的表達(dá)，且與EP的水平呈正相關(guān)。激光共聚焦顯微鏡觀察到EP抑制了HMGB1的胞漿轉(zhuǎn)位。結(jié)論EP可能通過抑制HMGB1的轉(zhuǎn)位來減少Rot誘導(dǎo)的自噬性損傷，從而對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

丙酮酸乙酯 帕金森病 自噬 高遷移率族蛋白1

帕金森病是中老年人群常見的神經(jīng)變性疾病，目前的治療方法主要為多巴胺替代治療，而長(zhǎng)期使用多巴胺將會(huì)引起患者出現(xiàn)異動(dòng)癥、療效減退等反應(yīng)，尚缺乏特效的藥物治療及有效的神經(jīng)保護(hù)治療措施。尋找一種對(duì)多巴胺能神經(jīng)元有保護(hù)作用的藥物一直是PD研究的熱點(diǎn)。丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate，EP)是一種丙酮酸的酯類衍生物，可作為食品添加劑使用，近年來研究發(fā)現(xiàn)EP具有抗氧化、抗炎、抑制或者增強(qiáng)凋亡、調(diào)節(jié)自噬溶酶體途徑、抑制腫瘤生長(zhǎng)等作用[1]。本研究將在魚藤酮(Rotenone, Rot)誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中觀察EP對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，并將進(jìn)一步檢測(cè)自噬活性及高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1, HMGB1)的表達(dá)水平來探明EP發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 主要材料及試劑

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y)購(gòu)自武漢大學(xué)典型培養(yǎng)物儲(chǔ)藏中心；EP、兔抗微管相關(guān)蛋白輕鏈3多克隆抗體(anti-LC3B)及兔抗P62多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)sigma公司，小鼠抗HMGB1抗體購(gòu)自Abcam公司，羅丹明(Tritc)標(biāo)記羊抗小鼠熒光二抗，Hoechst 33258染料購(gòu)自ProteinTech Group 公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bender Medsystem公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

SH-SY5Y細(xì)胞置于DMEM/F12培養(yǎng)基中，內(nèi)含10%(體積分?jǐn)?shù))滅活胎牛血清，37 ℃含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)照組，Rot(2.5 μM)組，EP(5 mM)+Rot組及EP(10 mM)+Rot組。不同水平的EP預(yù)處理30 min后加入Rot作用24 h，細(xì)胞用于檢測(cè)。

1.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞活力

控制細(xì)胞密度約為2×105/mL，以100 μL/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%左右，加入藥物處理，各組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；藥物作用24 h后每孔加入5 mg/mL MTT 溶液10 μL，37 ℃避光培養(yǎng)4 h，棄上清，之后加入DMSO，37 ℃培養(yǎng)20 min至顆粒完全溶解；在酶標(biāo)儀上測(cè)定吸光度【OD】值，吸收波長(zhǎng)為570 nm，濾光片波長(zhǎng)為625 nm。OD值作為反映細(xì)胞活性或代謝狀態(tài)的參數(shù)，細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD均值/對(duì)照組OD均值×100%。

1.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)Rot處理24 h后使用不含EDTA的胰酶消化并收集細(xì)胞，使用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2遍，之后制成單細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液，分別加入5 μL Annexin-V/FITC和10 μL PI溶液，加入buffer緩沖液制成400 μL的反應(yīng)體系，混合后室溫避光孵育15min，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)早期細(xì)胞凋亡。

1.5 免疫印跡法檢測(cè)

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)處理后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液后置于冰上裂解30 min，4 ℃下以12000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測(cè)定蛋白水平后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，之后分別加入兔抗LC3B、P62抗體4 ℃孵育過夜，之后使用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h后顯色、曝光。

1.6 免疫熒光細(xì)胞染色

制備細(xì)胞爬片，藥物處理24 h后棄培養(yǎng)基，隨后漂洗，4%多聚甲醛固定，之后破膜，5%BSA封閉，之后分別加入小鼠抗HMGB1(1∶500)抗體于4 ℃孵育過夜，復(fù)溫后加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠熒光二抗37 ℃孵育1 h，之后Hoechst33258染色10 min，封片，固定，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EP對(duì)細(xì)胞活力的影響

SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)Rot處理24 h后細(xì)胞活力下降至對(duì)照組的(61.23±3.12)%，而使用EP 5 mM及10 mM預(yù)處理后再暴露于Rot的細(xì)胞活力分別為對(duì)照組的(78.23±4.08)%和(82.76±2.98)%，與Rot組比較細(xì)胞活力有所提高(P<0.05)(圖1)。

圖1 EP對(duì)細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組比較,*P<0.05;與Rot組比較,#P<0.05

2.2 EP對(duì)Rot作用后細(xì)胞凋亡的影響

Rot作用24 h后SH-SY5Y細(xì)胞凋亡率增加至(20.15±2.16)%，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而使用EP 5 mM及10 mM預(yù)處理后均顯著降低Rot誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(P<0.05)(圖2)。

2.3 EP對(duì)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Rot處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后LC3 Ⅱ/Ⅰ的比例較對(duì)照組明顯增高，自噬降解底物P62的蛋白水平也增高(P<0.05)；使用EP 5 mM及10 mM預(yù)處理后LC3 Ⅱ/Ⅰ的比例較Rot組降低，而P62蛋白水平較Rot組明顯增高(P<0.05)(圖3)。

圖2 EP對(duì)細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較,*P<0.05;與Rot組比較,#P<0.05

2.4 EP對(duì)HMGB1表達(dá)定位的影響

對(duì)照組細(xì)胞中HMGB1均勻分布在細(xì)胞核中，而Rot處理24 h后HMGB1向胞漿及細(xì)胞外轉(zhuǎn)移，并形成顆粒樣聚集物；EP10 mM預(yù)處理組HMGB1也存在胞漿轉(zhuǎn)位及少量顆粒樣聚集物，但較Rot組少(圖4)。

3 討 論

PD的發(fā)病機(jī)制目前尚未完全明確，既往研究提示氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、蛋白質(zhì)異常折疊和聚集、凋亡、自噬溶酶體系統(tǒng)異常及炎癥反應(yīng)等均參與PD的發(fā)病[2]。EP是一種穩(wěn)定的丙酮酸酯質(zhì)衍生物，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基及調(diào)節(jié)自噬、凋亡的作用[1]，因此推測(cè)EP可能對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用。為證實(shí)該推測(cè)，本研究建立了魚藤酮誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)EP可以減輕魚藤酮引起的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并能提高細(xì)胞活力，提示EP對(duì)PD細(xì)胞模型具有保護(hù)作用。同時(shí)通過對(duì)自噬相關(guān)蛋白的檢測(cè)及HMGB1表達(dá)及定位的觀察發(fā)現(xiàn)EP可能通過抑制HMGB1的胞漿轉(zhuǎn)位來減輕PD細(xì)胞模型的自噬損傷而發(fā)揮保護(hù)作用。

EP是一種具有芳香氣味的丙酮酸酯質(zhì)衍生物，具有高穩(wěn)定性，被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為可用于食品的添加劑。研究表明EP具有較強(qiáng)的抗氧化活性及抗炎作用，它一方面有效地清除氧自由基而起到抗氧化作用[3]；另一方面通過抑制一氧化氮、NF-κB等促炎因子的釋放起到抑制炎癥反應(yīng)的作用，對(duì)很多缺血再灌注損傷及化膿性炎癥反應(yīng)模型都能起到保護(hù)作用[4-5]；EP還具有很強(qiáng)的抑癌作用[6]。另外，EP由于其脂溶性，可以穿透血腦屏障，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腹腔注射的EP可以改善LPS誘導(dǎo)的大鼠腦白質(zhì)損傷[7]，同時(shí)也可以減輕大鼠急性腦缺血引起的腦組織缺血缺氧性損傷[5]，具有神經(jīng)保護(hù)作用。有研究發(fā)現(xiàn)EP可以通過抑制COX-2、IL-1β及TNF-α等炎性因子的釋放而減輕紅藻氨酸對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的損傷[8]，從而改善大鼠的記憶功能。既往的研究也發(fā)現(xiàn)EP對(duì)PD模型具有保護(hù)作用，EP可以通過調(diào)節(jié)ERK的磷酸化來保護(hù)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞免受MPTP誘導(dǎo)的損傷[9]。本研究也證實(shí)了EP可以減少Rot誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞活力，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

圖3 EP對(duì)LC3、P62蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,*P<0.05;與Rot組比較,#P<0.05

圖4 EP對(duì)HMGB1表達(dá)定位的影響(×400倍) 紅色熒光為HMGB1,藍(lán)色熒光為細(xì)胞核

EP的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制仍不明確，本研究對(duì)EP的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探討。自噬是一把雙刃劍，廣泛存在于真核細(xì)胞中，它即是一種與凋亡、壞死并列的程序性細(xì)胞死亡方式，也是一種細(xì)胞清除細(xì)胞內(nèi)異常聚集的蛋白及受損細(xì)胞器的自我保護(hù)方式。自噬過程中首先形成自噬囊泡，將需要降解的物質(zhì)包裹在囊泡中再轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體中降解，在囊泡形成過程中LC3由LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ轉(zhuǎn)化，LC3 Ⅱ/Ⅰ比例可以反映自噬囊泡的形成情況。本研究在魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞模型中觀察到LC3 Ⅱ/Ⅰ的比例增高，而EP預(yù)處理則減少了Rot誘導(dǎo)的LC3 Ⅱ/Ⅰ的比例增高。有研究發(fā)現(xiàn)在PD模型中存在自噬受阻，LC3陽性自噬囊泡的數(shù)量顯著增加[10]，自噬的激活可能是由神經(jīng)毒素觸發(fā)的程序性細(xì)胞死亡的一部分[11]，在帕金森病動(dòng)物模型及患者中亦可觀察到這種現(xiàn)象發(fā)生。本研究結(jié)果也提示EP可以抑制自噬的激活而起到保護(hù)作用。

HMGB1是一種非組蛋白的染色體結(jié)合蛋白，主要存在于細(xì)胞核中，參與DNA的重組、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)[12]；在細(xì)胞外可作為一個(gè)信號(hào)分子，參與調(diào)解細(xì)胞分化及炎性介質(zhì)的釋放[13]；近年來的研究發(fā)現(xiàn)HMGB1可以從細(xì)胞核向胞漿轉(zhuǎn)位，與自噬啟動(dòng)蛋白Beclin1相互作用，使得Beclin-Bcl-2復(fù)合體解聚而參與某些腫瘤細(xì)胞的自噬激活過程[14]。當(dāng)HMGB1轉(zhuǎn)移至細(xì)胞外時(shí)它通過與RAGE受體結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬[15]。EP是HMGB1的轉(zhuǎn)位抑制劑，本研究發(fā)現(xiàn)EP可以減少Rot誘導(dǎo)的HMGB1轉(zhuǎn)位，本研究推測(cè)EP的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其減少HMGB1的轉(zhuǎn)位有關(guān)。

綜上所述，本研究表明EP可能通過抑制HMGB1的轉(zhuǎn)位來減少多巴胺能神經(jīng)元的自噬損傷而起到神經(jīng)保護(hù)作用。EP作為一種無毒、穩(wěn)定且可被人們食用的物質(zhì)，研究其對(duì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制將為PD的治療提供新的視點(diǎn)。

[1] Kao KK,Fink MP.The biochemical basis for the anti-inflammatory and cytoprotective actions of ethyl pyruvate and related compounds[J].Biochem Pharmacol,2010,80(2):151-159.

[2] Cacabelos R.Parkinson's disease: from pathogenesis to pharmacogenomics[J].Int J Mol Sci,2017,18(3):551.

[3] Kim HS,Cho IH,Kim JE,et al.Ethyl pyruvate has an anti-inflammatory effect by inhibiting ROS-dependent STAT signaling in activated microglia[J].Free Radic Biol Med,2008,45(7):950-963.

[4] Yang R,Zhu S,Tonnessen TI.Ethyl pyruvate is a novel anti-inflammatory agent to treat multiple inflammatory organ injuries[J].J Inflamm (Lond),2016,13:37.

[5] Yu YM,Kim JB,Lee KW,et al.Inhibition of the cerebral ischemic injury by ethyl pyruvate with a wide therapeutic window[J].Stroke,2005,36(10):2238-2243.

[6] Demaria S,Pikarsky E,Karin M,et al.Cancer and inflammation: promise for biologic therapy[J].J Immunother,2010,33(4):335-351.

[7] Wang Y,Yin P,Huang S,et al.Ethyl pyruvate protects against lipopolysaccharide-induced white matter injury in the developing rat brain[J].Int J Dev Neurosci,2013,31(3):181-188.

[8] Cho IH,Kim SW,Kim JB,et al.Ethyl pyruvate attenuates kainic acid-induced neuronal cell death in the mouse hippocampus[J].J Neurosci Res,2006,84(7):1505-1511.

[9] Choi JS,Lee MS,Jeong JW.Ethyl pyruvate has a neuroprotective effect through activation of extracellular signal-regulated kinase in Parkinson's disease model[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,394(3):854-858.

[10] Janda E,Isidoro C,Carresi C,et al.Defective autophagy in Parkinson's disease: role of oxidative stress[J].Mol Neurobiol,2012,46(3):639-661.

[11] Cheung ZH,Ip NY.Autophagy deregulation in neurodegenerative diseases - recent advances and future perspectives[J].J Neurochem,2011,118(3):317-325.

[12] Naglova H,Bucova M.HMGB1 and its physiological and pathological roles[J].Bratisl Lek Listy,2012,113(3):163-171.

[13] Harris HE,Andersson U,Pisetsky DS.HMGB1: a multifunctional alarmin driving autoimmune and inflammatory disease[J].Nat Rev Rheumatol,2012,8(4):195-202.

[14] Tang D,Kang R,Livesey KM,et al.Endogenous HMGB1 regulates autophagy[J].J Cell Biol,2010,190(5):881-892.

[15] Kang R,Tang D,Loze MT,et al.Apoptosis to autophagy Switch triggered by the MHC class III-encoded receptor for advanced glycation endproducts (RAGE)[J].Autophagy,2011,7(1):91-93.

Theprotectiveroleofethylpyruvateindopaminergicneuronaldamageinducedbyrotenone

XiongJing,HuDan,ZhangZhentao,etal.

DepartmentofNeurology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060

ObjectiveTo investigate the protective role of ethyl pyruvate in dopaminergic neuronal damage induced by rotenone.MethodsSH-SY5Y cells were treated with rotenone, and ethyl pyruvate with different concentration were pretreated to the cells. The cell viability was determined by MTT method. The apoptotic rate of SH-SY5Y cells were analyzed by flow cytometry after Annexin V/PI staining. The protein expression of LC3 Ⅱ/Ⅰ and P62 were assessed by Western blot. The expression and location of HMGB1 were analyzed by immnofluorescence staining.ResultsEthyl pyruvate decreased the apoptotic rate of SH-SY5Y cells induced by rotenone, and increased the cell viability. Ethyl pyruvate inhibited the activation of autophage induced by rotenone, accompanied by the increased expression level of P62. Otherwise, ethyl pyruvate also inhibited cytosolic translocation of HMGB1.ConclusionEthyl pyruvate could inhibit the activation of autophagy by reducing the cytosolic translocation of HMGB1 and plays a protective role in dopaminergic cell.

Ethyl pyruvate Parkinson’s disease Autophagy High mobility group box 1

R742.5

A

1007-0478(2017)06-0485-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.06.001

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)81501107)

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)一科[熊婧 胡丹 張振濤 張兆輝(通信作者)]

(2017-04-28收稿)