直投式發(fā)酵劑制備工藝對(duì)乳酸菌存活率的影響

任香蕓， 何志剛,*， 李維新， 林曉姿， 梁璋成

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所， 福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350013)

直投式發(fā)酵劑制備工藝對(duì)乳酸菌存活率的影響

任香蕓1,2， 何志剛1,2,*， 李維新1,2， 林曉姿1,2， 梁璋成1,2

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所， 福建 福州 350003；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350013)

為明確直投式發(fā)酵劑制備過(guò)程中菌體細(xì)胞存活率的變化，選擇植物乳桿菌R23為實(shí)驗(yàn)菌，采用掃描電鏡、透射電鏡和正交試驗(yàn)等手段對(duì)收集條件、預(yù)凍條件和凍干時(shí)間等進(jìn)行研究。結(jié)果表明，植物乳桿菌R23優(yōu)化收集時(shí)間為15 h，此時(shí)菌量達(dá)到最大且活力較高；在優(yōu)化的離心條件下菌體細(xì)胞存活率達(dá)92.4%，其中離心力起關(guān)鍵作用；采用梯度預(yù)凍即-20，-40，-80 ℃各1，2，3 h，可使物料達(dá)到較優(yōu)凍結(jié)效果；發(fā)酵劑物料凍干至水質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.20%時(shí)最有利于貯藏。研究在明確菌劑制備關(guān)鍵因素對(duì)菌體細(xì)胞干預(yù)機(jī)制的基礎(chǔ)上，還獲得了適宜的制備條件，對(duì)直投式發(fā)酵劑的規(guī)模化生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

直投式發(fā)酵劑； 細(xì)胞存活率； 植物乳桿菌R23； 干預(yù)機(jī)制； 制備條件

菌種高密度培養(yǎng)、菌體濃縮收集和真空冷凍干燥等過(guò)程均是高活力直投式發(fā)酵劑(direct vat set,DVS)制備的重要環(huán)節(jié)[1]。前期研究確定了適宜植物乳桿菌R23高密度增殖的工藝參數(shù)，菌量達(dá)1.0×1010CFU/mL以上，為后期菌劑制備工藝奠定了良好基礎(chǔ)[2]。目前菌體濃縮主要有超濾法和離心法等[3]。超濾法對(duì)設(shè)備要求較高，條件不易控制，菌種容易被污染；離心雖然對(duì)菌體有所損傷，但此法簡(jiǎn)便、快速、處理量大，菌種純度容易控制，適用于商業(yè)化生產(chǎn)[4]。離心濃縮中菌種活性、離心條件等均可影響菌株對(duì)冷凍及干燥的敏感度。目前已有乳酸菌離心分離條件的相關(guān)研究[5-6]，但各離心因素對(duì)細(xì)胞活力的具體影響機(jī)制尚無(wú)實(shí)際證據(jù)，因此有必要深入探討影響菌體細(xì)胞存活率的主要因子及其干預(yù)機(jī)制，提高菌體的離心濃縮效果。

真空冷凍干燥過(guò)程主要分為預(yù)凍、升華干燥和解析干燥3個(gè)步驟。預(yù)凍是將物料中游離態(tài)水凍結(jié)成冰的過(guò)程，預(yù)凍效果對(duì)于凍干物質(zhì)形態(tài)的維持非常關(guān)鍵，但相比于其他凍干過(guò)程，預(yù)凍參數(shù)的優(yōu)化在乳酸菌菌劑制備工藝研究中尤為欠缺。已有研究表明，預(yù)凍環(huán)節(jié)中降溫速度、凍結(jié)溫度和凍結(jié)時(shí)間都是重要的工藝參數(shù)，它們相互作用，共同影響著凍結(jié)物質(zhì)的結(jié)晶情況[7]。其中，降溫速度是目前研究的焦點(diǎn)，大部分研究認(rèn)為快速凍結(jié)有利于菌體存活，也有研究認(rèn)為快速凍結(jié)或慢速凍結(jié)皆有其利弊[8]；因此，在保證較高存活率的前提下，需顧及菌劑物理性狀和溶解性能等。有關(guān)凍結(jié)溫度和凍結(jié)時(shí)間的研究相對(duì)較少，但其合理選擇可保證物料的適度預(yù)凍，使干燥后的物料很好地保持原有性質(zhì)并縮短干燥時(shí)間[9]。

研究以植物乳桿菌R23為實(shí)驗(yàn)菌，著重對(duì)離心濃縮條件及真空冷凍干燥過(guò)程的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，旨在提高凍干菌體細(xì)胞存活率，同時(shí)改善菌劑理化性狀和降低能耗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌種

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) R23，由福建省農(nóng)產(chǎn)品(食品)加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

1.1.2培養(yǎng)基

LHR20參見文獻(xiàn)[2]。改良TJA培養(yǎng)基參見文獻(xiàn)[10]。

1.1.3保護(hù)劑配方

甘油2.8%，谷氨酸鈉2.1%，海藻糖1.4%，山梨醇0.7%，脫脂乳10%，均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.1.4主要試劑

脫脂乳粉(優(yōu)級(jí)純)，美國(guó)BD公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250BS-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ZQLY-180S型立式雙層恒溫振蕩器，上海知楚儀器有限公司；SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；GI54DW型高壓滅菌器，美國(guó)致微公司；TGL-18C型高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；LD PLUS型真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司；HT7700型透射電鏡，日立公司；6380LV型掃描電鏡，日本電子公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將活化的植物乳桿菌R23接種于LHR20液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)，每隔3 h取樣測(cè)定菌量，繪制菌體生長(zhǎng)量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)圖。

1.3.2植物乳桿菌R23收集條件優(yōu)化

選擇離心力、離心溫度和離心時(shí)間為考察對(duì)象，以細(xì)胞存活率為指標(biāo)，作L9(34)正交試驗(yàn)，各因素水平如表1。將所得數(shù)據(jù)用DPS軟件進(jìn)行處理分析，并通過(guò)掃描電鏡和透射電鏡觀察菌體超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，深入探討主體影響因素對(duì)菌體細(xì)胞存活率的作用機(jī)制。

1.3.3預(yù)凍條件對(duì)菌體存活率影響的測(cè)定

按照V保護(hù)劑∶V菌泥=4∶1將保護(hù)劑與植物乳桿菌R23菌泥混合、分裝，并作以下預(yù)凍處理： 1)單溫預(yù)凍ⅰ為-40 ℃，6 h；2)單溫預(yù)凍ⅱ為-80 ℃，6 h；3)梯度預(yù)凍ⅲ為-20，-40，-80 ℃各1，2，3 h；4)梯度預(yù)凍ⅳ為-20，-40，-80 ℃各2 h；5)梯度預(yù)凍ⅴ為-20，-40，-80 ℃各3，2，1 h。檢測(cè)處理前后的活菌量，分析確定適宜的預(yù)凍條件。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表

離心力603，2 414，9 659g分別代表的轉(zhuǎn)速為3 000，6 000，9 000 r/min。

1.3.4凍干時(shí)間對(duì)菌劑水質(zhì)量分?jǐn)?shù)及菌體存活率影響的測(cè)定

在1.3.3基礎(chǔ)上，將預(yù)凍好的樣品放入真空冷凍干燥機(jī)，分別于0，5，10，15，24 h取出檢測(cè)菌量和水質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并以凍干前樣品為對(duì)照進(jìn)行菌體存活率計(jì)算，分析凍干過(guò)程中菌量及水質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化規(guī)律。

1.4 計(jì)算方法

1.4.1菌量測(cè)定方法

采用平板菌落計(jì)數(shù)法，參照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行。

1.4.2細(xì)胞存活率的計(jì)算

菌體細(xì)胞存活率的計(jì)算，參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，計(jì)算公式見式(1)：

細(xì)胞存活率=S2/S1×100%。

(1)

式(1)中：S1為處理前活菌總數(shù)，CFU/mL；S2為處理后殘留活菌數(shù)，CFU/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種適宜收集時(shí)間分析

在優(yōu)化的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件下，植物乳桿菌R23的生長(zhǎng)曲線如圖1。0～3 h為菌體生長(zhǎng)延滯期，菌量略有下降；3 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，15 h后進(jìn)入穩(wěn)定期。為獲得高菌量且高活力的菌種，宜選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期15 h作為R23的收集時(shí)間。

2.2 離心條件對(duì)菌體收集效果的影響及作用機(jī)制

菌體離心收集在保證高濃度菌量的同時(shí)，可避免代謝產(chǎn)物乳酸鹽等對(duì)菌體的毒害。各因素對(duì)菌體細(xì)胞存活率的影響主次順序?yàn)殡x心力>溫度>時(shí)間，其中離心力的影響達(dá)顯著水平(見表2、表3)。

圖1 植物乳桿菌R23的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus plantarum R23

圖2 不同離心處理?xiàng)l件下的菌體超微形態(tài)Fig.2 Bacterial ultra-morphology of different treatments

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與極差分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

F0.01(2,2)=99,*** ;F0.05(2,2)=19,** ;F0.1(2,2)=9,*。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出最佳離心條件為A2B1C3，即離心力2 414g，溫度4 ℃，時(shí)間15 min。由于溫度、時(shí)間對(duì)細(xì)胞存活率的影響均不顯著，因此從離心機(jī)的能耗角度考慮，宜選擇A2B3C1組合，即離心力2 414g，溫度16 ℃，時(shí)間5 min。

對(duì)理論最佳工藝與所選工藝的驗(yàn)證結(jié)果表明，2種組合獲得的細(xì)胞存活率無(wú)顯著差異，且與正交試驗(yàn)結(jié)果一致(見表4)。因此在優(yōu)化的離心力條件下，可以適當(dāng)縮短離心時(shí)間，提高離心溫度，進(jìn)而降低菌體濃縮成本，簡(jiǎn)化制備工序。

表4 理論最佳工藝與所選工藝驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

小寫字母表示差異顯著，顯著值p<0.05；大寫字母表示差異極顯著，顯著值p<0.01；下同。

為充分明確主要影響因子即離心力的作用機(jī)制，以2 414g為對(duì)照(CK)，觀察9 659g高速離心處理(H)后菌體的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖2。與對(duì)照相比，高速處理后的植物乳桿菌R23細(xì)胞變化明顯。菌體細(xì)胞失去原有的飽滿程度，多數(shù)細(xì)胞表面發(fā)生皺縮、坍陷等現(xiàn)象(掃描電鏡，CK1與H1)；高速處理后，細(xì)胞外圍包被的一層透明狀胞外多糖類物質(zhì)被不同程度地離散為棉絮狀(透射電鏡，CK2與H2)；菌體表面粗糙度增加，細(xì)胞壁、細(xì)胞膜出現(xiàn)破裂(透射電鏡，CK3與H3)。由此可見，高離心力可導(dǎo)致菌體細(xì)胞形態(tài)及部分結(jié)構(gòu)的變化，從而影響到菌體的存活。

2.3 預(yù)凍條件對(duì)菌體存活率的影響

不同預(yù)凍處理對(duì)菌體細(xì)胞存活率的影響如表5。同等時(shí)間內(nèi)，梯度預(yù)凍的效果明顯優(yōu)于單溫預(yù)凍處理；而3種梯度處理中ⅲ的細(xì)胞存活率最高，且與其他處理間存在顯著差異，提示預(yù)凍溫度和時(shí)間的合理搭配，可在保證物料充分凍結(jié)前提下，最大程度減小菌體的機(jī)械損傷，預(yù)凍效果達(dá)到最佳狀態(tài)。

表5 不同預(yù)凍處理?xiàng)l件下菌體細(xì)胞存活率

2.4 凍干時(shí)間對(duì)菌體存活率的影響

菌劑殘余水分含量是影響其保藏穩(wěn)定性的因素之一，不同凍干時(shí)間下植物乳桿菌R23菌劑水質(zhì)量分?jǐn)?shù)和細(xì)胞存活率如表6。初步凍干的5 h內(nèi)水質(zhì)量分?jǐn)?shù)迅速下降，細(xì)胞存活率無(wú)顯著變化；之后水質(zhì)量分?jǐn)?shù)基本維持在1.0%左右，細(xì)胞存活率極緩慢下降，但仍無(wú)顯著差異。為保證菌體表面親水基團(tuán)受到持續(xù)性保護(hù)，避免與氧的結(jié)合而破壞DNA結(jié)構(gòu)，宜選擇10 h為適宜的凍干時(shí)間，即菌劑w(水)為1.20%。

表6 不同凍干時(shí)間下菌劑水質(zhì)量分?jǐn)?shù)及細(xì)胞存活率

3 結(jié) 論

菌齡直接影響著菌種收集過(guò)程中菌體的生存能力，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期或穩(wěn)定初期菌量達(dá)到頂峰，胞外多糖等物質(zhì)也開始大量分泌，菌體細(xì)胞顯示出較高活性[12-13]；而在穩(wěn)定期末期或衰亡期，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流或營(yíng)養(yǎng)貧乏導(dǎo)致的細(xì)胞饑餓均會(huì)使菌體結(jié)構(gòu)發(fā)生塌陷甚至死亡[14]。研究選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期15 h作為植物乳桿菌R23的收集時(shí)間，將最大限度地保證菌體在離心濃縮中的活力。有研究認(rèn)為，離心強(qiáng)度(離心力和時(shí)間)與離心效果成正比[4]；研究發(fā)現(xiàn)，在以細(xì)胞存活率為指標(biāo)的前提下，這一正比關(guān)系需在一定的范圍方可成立，離心力與時(shí)間過(guò)大或過(guò)小，均不能獲得理想的離心效果，這與吳滿剛等[15]對(duì)植物乳桿菌L2的研究結(jié)果類似。在排除細(xì)胞饑餓或內(nèi)容物外滲的狀況下，植物乳桿菌R23細(xì)胞存活率的降低，一方面可能是低離心強(qiáng)度下上清液中殘留的菌體過(guò)多；另一方面可能是高離心力增強(qiáng)了細(xì)胞的剪切作用，長(zhǎng)時(shí)間離心增加了菌體在壓力沉降中彼此之間的相互壓力，加上不適宜的溫度影響，共同導(dǎo)致細(xì)胞皺縮、坍陷、胞外物質(zhì)離散、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破壞等現(xiàn)象。而細(xì)胞皺縮和坍陷皆是由于細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的不同而出現(xiàn)內(nèi)容物外滲的結(jié)果。另外，有研究認(rèn)為胞外多糖或莢膜多糖等成分具有耐干燥、黏附、抗氧化[16-17]等作用，此類物質(zhì)的離散會(huì)導(dǎo)致其部分功能喪失；這些均可降低細(xì)胞的活性導(dǎo)致菌體死亡率增加。

菌體收集條件的優(yōu)化及各參數(shù)對(duì)菌體細(xì)胞影響的深入探討，可為后期DVS菌劑的凍干過(guò)程提供高濃度、高活力的菌種，有效降低能耗，對(duì)于菌劑的規(guī)?；a(chǎn)具有實(shí)際指導(dǎo)意義。在冷凍干燥過(guò)程中，物料預(yù)凍的最終溫度以其共晶點(diǎn)為依據(jù)，為保證物料完全凍結(jié)，預(yù)凍溫度要比物料的共晶點(diǎn)低5～10 ℃[18-19]。研究證實(shí)乳酸菌的共晶點(diǎn)在-20 ℃左右[20]，即-25～-30 ℃可滿足乳酸菌凍結(jié)的要求。研究中植物乳桿菌R23完全凍結(jié)的溫度為-40 ℃，提示該菌的共晶點(diǎn)在-20 ℃以下，具體溫度尚待實(shí)驗(yàn)證實(shí)。而梯度預(yù)凍優(yōu)于單溫預(yù)凍的原因，可能是梯度凍干物質(zhì)形成的晶體結(jié)晶度較好，實(shí)現(xiàn)了真正意義上的最佳凍結(jié)濃縮狀態(tài)，菌體得到最大程度的保護(hù)。進(jìn)一步得出，菌體預(yù)凍效果是受多因素共同作用的。李代禧等[8]在丙氨酰谷氨酰胺溶液預(yù)凍方式對(duì)凍干樣品影響的研究中，使用多次變溫退火預(yù)凍方式獲得了粒度均一的丙氨酰谷氨酰胺晶體，而梯度降溫預(yù)凍方式在乳酸菌上的應(yīng)用鮮有報(bào)道。另外，在最佳凍干時(shí)間10 h條件下，物料水質(zhì)量分?jǐn)?shù)略低于常規(guī)的研究范圍，說(shuō)明適宜水質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小還要考慮到保護(hù)劑組成及菌體特性。同時(shí)，在發(fā)酵劑的制備中，可通過(guò)測(cè)定樣品的水質(zhì)量分?jǐn)?shù)來(lái)判斷凍干終點(diǎn)，簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝。

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EffectsofDVSPreparationConditionsonCellViabilityofLactobacillus

REN Xiangyun1,2， HE Zhigang1,2,*， LI Weixin1,2， LIN Xiaozi1,2， LIANG Zhangcheng1,2

(1.InstituteofAgriculturalEngineeringTechnology，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou350003，China; 2.FujianKeyLaboratoryofAgriculturalProduct(Food)Processing，F(xiàn)ujianAcademyofAgriculturalSciences，F(xiàn)uzhou350013，China)

In this study,LactobacillusplantarumR23 was used as the tested bacteria, and the effects of collecting conditions, pre-freezing conditions and freeze-drying time on cell viability were studied by scanning electron microscope，transmission electron microscope，and the orthogonal test. The results showed that the amount of bacteria reached the maximum and higher activity at the 15th hour during the process of incubation, which might be considered as the suitable harvest time. The cell survival could reach 92.4% under optimum conditions, of which the centrifugal force played a key role. The optimum temperature and duration of gradient pre-freezing were -20, -40, -80 ℃ and 1, 2, 3 h, respectively. And the optimum moisture content ofLactobacillusplantarumR23 to be storaged was 1.20%. Based on this study, the interference mechanism of the key factors for DVS preparation on cells was explicited, and the suitable preparation conditions were obtained, which was a guidance to the large scale production of high efficient DVS.

DVS; cell viability;LactobacillusplantarumR23; intervention mechanism; preparation conditions

張逸群)

10.3969/j.issn.2095-6002.2017.06.006

2095-6002(2017)06-0036-06

任香蕓，何志剛，李維新，等. 直投式發(fā)酵劑制備工藝對(duì)乳酸菌存活率的影響[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2017,35(6):36-41.

REN Xiangyun，HE Zhigang，LI Weixin, et al. Effects of DVS preparation conditions on cell viability ofLactobacillus[J]. Journal of Food Science and Technology, 2017,35(6):36-41.

TS201.3; TS201.1; Q939.1

A

2017-04-18

福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015J01101)。

任香蕓，女，助理研究員，碩士，主要從事食品微生物選育及食品發(fā)酵方面的研究；*何志剛，男，研究員，主要從事食品發(fā)酵與釀造方面的研究，通信作者。