從腸道菌群多樣性探討越鞠丸對ApoE-/-小鼠血脂的影響?

李玉波，郝改梅，賈海驊，王國為，黃 媛，李志更△

(1. 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700； 2. 廣西藥用植物園，南寧 530023)

【實驗研究】

從腸道菌群多樣性探討越鞠丸對ApoE-/-小鼠血脂的影響?

李玉波1，郝改梅1，賈海驊1，王國為1，黃 媛2，李志更1△

(1. 中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所，北京 100700； 2. 廣西藥用植物園，南寧 530023)

目的：觀察治療六郁的代表方越鞠丸對血脂的影響，為臨床應用和實驗研究提供參考依據(jù)。方法：采用高脂飼料飼養(yǎng)ApoE-/-小鼠的方法建立動脈粥樣硬化斑塊模型，用越鞠丸和辛伐他汀分別對高脂飼料飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠進行干預，ELISA法檢測小鼠血清血脂含量，基于16S rDNA基因測序技術分析小鼠腸道菌群。結果：越鞠丸組、辛伐他汀組和模型對照組小鼠血清膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白(LDL-C)含量明顯高于正常對照組，高密度脂蛋白(HDL-C)含量明顯低于正常對照組；越鞠丸組小鼠TC和LDL-C含量明顯低于模型對照組且與辛伐他汀組比較差異無統(tǒng)計學意義，TG和HDL-C含量與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。越鞠丸組與正常對照組、模型對照組、辛伐他汀組小鼠糞便樣本菌群存在顯著性差異，模型對照組與辛伐他汀組小鼠糞便樣本菌群比較差異無統(tǒng)計學意義。結論：越鞠丸能降低TC和LDL-C，其機制與辛伐他汀不同，越鞠丸可能通過抑制紅蝽菌科等4類細菌和促進雙歧桿菌科等5類細菌的生長來降低TC和LDL-C。

腸道菌群；越鞠丸；血脂

近年來，中醫(yī)學對動脈粥樣硬化斑塊的研究提出了“瘀”“脂”“熱毒”學說以及“陰虛毒瘀”“風邪內(nèi)動、血脈痙攣”等假說[1-3]，但未能形成共識的治療方法，如何用中藥穩(wěn)定斑塊仍是當前研究的熱點。有學者認為，早期氣郁可導致高脂血癥，病位在肝膽脾，日久而見濕痰瘀熱食郁，從而形成動脈粥樣硬化斑塊[4-5]。也有學者認為，動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生與氣、血、痰、濕、食、火六邪郁滯(六郁)相關[6-7]?，F(xiàn)代醫(yī)學已研究發(fā)現(xiàn)，腸道菌群可以代謝磷脂類和膽堿類產(chǎn)生膽堿、氧化三甲胺和甜菜堿，而這些代謝產(chǎn)物能夠引發(fā)動脈粥樣硬化[8]。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE基因敲除小鼠的方法建立動脈粥樣硬化斑塊模型，觀察治療六郁的代表方越鞠丸對其血脂的影響，并基于腸道菌群多樣性研究初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

6周齡SPF級雄性APOE-/-小鼠60只，體質量15～20 g，由北京維通利華生物技術有限公司提供，高脂飼料也由此公司提供。小鼠按隨機數(shù)字表法分成正常對照組、模型對照組、越鞠丸組、辛伐他汀組4組各15只。本試驗經(jīng)過中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎理論研究所倫理審查委員會的許可。

1.2 藥物劑量及給藥方法

越鞠丸組成：醋香附10 g，川芎10 g，炒梔子10 g，炒蒼術10 g，炒神曲10 g。人(60 kg)與小鼠(0.02 kg)間用藥劑量折算系數(shù)為9.01，按照成人60 kg/d的用藥劑量醋香附、川芎、炒梔子、炒蒼術、炒神曲各10 g，轉化為0.02 kg/d小鼠原始劑量為醋香附、川芎、炒梔子、炒蒼術、炒神曲各0.03 g。根據(jù)每味中藥免煎顆粒劑量與原始劑量之間的換算關系，按照每只大鼠體質量分別稱取醋香附、川芎、炒梔子、炒蒼術、炒神曲免煎顆粒若干，混合后用20 ml無菌純凈水溶解，免煎顆粒由北京同仁堂東四十條藥店提供。

辛伐他汀(舒降之)由杭州默沙東制藥有限公司提供，按照成人60 kg/d的用藥劑量20 mg轉化為0.02 kg/d小鼠原始劑量0.06 mg，將20 mg辛伐他汀片劑研磨成粉后用66.66 ml無菌純凈水制成懸濁液。

正常對照組小鼠正常飼料飼養(yǎng)，每日每只灌胃0.2 ml生理鹽水；模型對照組小鼠高脂飼料飼養(yǎng)，每日每只灌胃0.2 ml生理鹽水；越鞠丸組小鼠高脂飼料飼養(yǎng)，每日每只灌胃0.2 ml越鞠丸免煎顆粒；辛伐他汀組小鼠高脂飼料飼養(yǎng)，每日每只灌胃0.2 ml辛伐他汀懸濁液。

1.3 動脈粥樣硬化斑塊模型的確立

高脂飼料飼養(yǎng)模型對照組、越鞠丸組和辛伐他汀組小鼠14周后，從每組中隨機抽取5只小鼠取材，觀察其主動脈竇部和頭臂干動脈是否有粥樣硬化斑塊，如果全部都有則認為動脈粥樣硬化斑塊模型確立，根據(jù)課題組前期預實驗的結果，高脂飼料喂養(yǎng)14周后模型可確立。

1.4 收集糞便和血清樣本

4組小鼠飼養(yǎng)14周后取材，取材前1 d收集各組大鼠的新鮮糞便，每組每次選取10個樣本，重復3次(早7點至晚23點，每次間隔8 h)共計120個樣本。取材時鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血1 ml，離心后取血清，共計40個樣本。所有糞便和血清樣本均置于-80 ℃冰箱保存。

1.5 DNA提取

糞便標本解凍以后，按照糞便基因組DNA快速提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)的操作手冊逐步操作，提取細菌DNA。使用紫外分光光度計測定DNA的濃度，吸取5 μL所提取的DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分析其質量和數(shù)量。

1.6 PCR擴增

進行細菌16SrDNA V3-V4可變區(qū)PCR擴增，引物選擇16S-F/16S-R(5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’ / 5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’，北京奧維森基因科技有限公司合成)。PCR采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfu DNA Polymerase。全部樣本按照正式實驗條件進行，每個樣本3次重復，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris_HCl洗脫,2%瓊脂糖電泳檢測。

1.7 熒光定量

參照電泳初步定量結果，將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量。

1.8 Miseq文庫構建和上機測序

由北京奧維森基因科技有限公司完成。

1.9 ELISA法檢測3組小鼠血清血脂含量

小鼠血脂4項(血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白)ELISA試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司，ELISA具體流程按試劑盒說明進行。

1.10 統(tǒng)計學方法

小鼠血清血脂含量采用隨機區(qū)組方差分析。alpha多樣性指數(shù)采用秩和檢驗，群落結構分析采用Anosim相似性分析。Anosim[9]相似性分析也是一種非參數(shù)檢驗，用來檢驗組間( 2組)的差異是否顯著大于組內(nèi)差異以及差異是否具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組小鼠高脂飼料喂養(yǎng)14周后血清血脂含量

正常對照組小鼠TC、TG、LDL-C和HDL-C含量明顯低于其他3組。辛伐他汀組小鼠血清TC、TG、LDL-C含量明顯低于模型對照組，HDL-C含量明顯高于模型對照組。越鞠丸組小鼠血清TC和LDL-C含量明顯低于模型對照組，與辛伐他汀組比較差異無統(tǒng)計學意義，TG和HDL-C含量與模型對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 腸道菌群多樣性分析

2.2.1 優(yōu)質序列長度分布 圖1顯示，本試驗共采集到120個小鼠糞便樣品，所測序列長度大多分布在360～480 bp，與所測的16S rDNA的V3-V4區(qū)條帶長度大致相符。

2.2.2 Specaccum物種累積曲線 Specaccum物種累積曲線結果反映了持續(xù)抽樣下新OTU(新物種)出現(xiàn)的速率。在一定范圍內(nèi)，隨著樣本量的加大，若曲線表現(xiàn)為急劇上升，則表示群落中有大量物種被發(fā)現(xiàn)；當曲線趨于平緩，則表示此環(huán)境中的物種并不會隨樣本量的增加而顯著增多。根據(jù)圖2可知，本次試驗選擇的樣本量是充足的。

表1 3組小鼠高脂飼料喂養(yǎng)14周后血清血脂含量(mmol/L)

注：與正常對照組比較：△P<0.05；與模型對照組比較：▲P<0.05；與辛伐他汀組比較:★P<0.05

圖1 優(yōu)質序列長度分布(橫坐標為tags梯度，縱坐標為tag數(shù)量)

圖2 Specaccum物種累積曲線(橫坐標：樣本量；縱坐標：抽樣后OTU數(shù)目。)

2.2.3 alpha多樣性指數(shù) 群落生態(tài)學中研究微生物多樣性，通過單樣品的多樣性分析(Alpha多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計學分析指數(shù)估計環(huán)境群落的物種多樣性。表2圖3顯示，經(jīng)過最低序列數(shù)樣本數(shù)抽平分析，越鞠丸組和辛伐他汀組小鼠腸道菌群多樣性明顯多于模型對照組，其中越鞠丸組小鼠腸道菌群多樣性還明顯多于辛伐他汀組。

表2 alpha多樣性指數(shù)

注：與正常對照組比較：△P<0.05；與模型對照組比較：▲P<0.05；與辛伐他汀組比較:★P<0.05

圖3 alpha多樣性指數(shù)box圖注：Chao1即菌種豐富度指數(shù)，用以估計群落中的OTU數(shù)目；goods_ coverage反映的是本次測序結果是否代表了樣本中微生物的真實情況；observed_species指實際觀測到OTU的個數(shù)；PD_Whole_Tree是基于系統(tǒng)發(fā)生樹來計算的一種多樣性指數(shù)；Shannon用來估算樣品中微生物多樣性指數(shù)，shannon值與群落多樣性成正相關

2.2.4 Anosim分析結果 表3顯示，4組數(shù)據(jù)經(jīng)兩兩比較，R值均大于0，說明組間差異顯著。從P值來看，正常對照組與模型對照組、越鞠丸組和辛伐他汀組小鼠糞便樣本菌群存在差異，模型對照組與辛伐他汀組小鼠糞便樣本菌群比較差異無統(tǒng)計學意義。

表3 3組數(shù)據(jù)兩兩Anosim分析比較

注：R-value介于(-1，1)之間，R值大于0，說明組間差異大于組內(nèi)差異；R值小于0，說明組內(nèi)差異大于組間差異，統(tǒng)計分析的可信度用P值表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義

2.2.5 群落結構分析 表4顯示,經(jīng)過Anosim分析，將3組樣本中存在差異的菌群進行歸納，越鞠丸組小鼠糞便樣本的微生物菌群數(shù)量在放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門、柔磨菌門、疣微菌門的部分綱、目、科與模型對照組和辛伐他汀組比較差異顯著。與模型對照組比較，越鞠丸組小鼠腸道紅蝽菌科、擬桿菌科、普雷沃氏菌科、S24-7科、動性球菌科、肉桿菌科、丹毒絲菌科、產(chǎn)堿桿菌科、氣單胞菌科、疣微菌科菌群數(shù)量明顯減少，雙歧桿菌科、理研菌科、乳桿菌科、毛螺菌科、消化鏈球菌科、瘤胃菌科、脫硫弧菌科、產(chǎn)氫細菌目菌群數(shù)量明顯增多，其中紅蝽菌科、普雷沃氏菌科、S24-7科、氣單胞菌科菌群數(shù)量明顯低于辛伐他汀組，雙歧桿菌科、理研菌科、乳桿菌科、毛螺菌科、產(chǎn)氫細菌目菌群數(shù)量明顯高于辛伐他汀組。

表4 OTU分類學綜合信息表(單位：個)

3 討論

從3組小鼠高脂飼料喂養(yǎng)14周后血清血脂含量來看，辛伐他汀的效果最好，對TG、TC、LDL-C、HDL-C均有積極作用，但2013年中國食品藥品監(jiān)督總局(CFDA)發(fā)布修訂他汀類藥品說明書通知，提醒中國醫(yī)生和患者關注他汀安全性[10]。目前辛伐他汀潛在的不良反應主要有肌病[11-12]、轉氨酶升高[10]、增加新發(fā)糖尿病風險[13-14]等。相比較而言，越鞠丸雖然只對TC和LDL-C有積極作用，且與辛伐他汀比較差異無統(tǒng)計學意義，但是越鞠丸在臨床應用上未見不良反應報道，具有一定的優(yōu)勢。

辛伐他汀為羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶抑制劑，抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，為血脂調節(jié)劑，其作用的通路和靶點較為明確。但從本實驗結果來看，其對腸道菌群的影響不明顯。越鞠丸是治療六郁的代表方劑，六郁常因飲食不節(jié)、寒溫不適、喜怒無常、憂思無度、氣機運行失常而發(fā)病。肝喜條達，怒氣傷肝，氣郁則胸膈痞悶；肝藏血，氣郁者血瘀出現(xiàn)胸脅痛或月經(jīng)不調、痛經(jīng)等；肝與膽互為表里，為相火寄居之所；氣郁化火則口苦泛酸，此氣、血、火郁在肝膽，肝病及脾，使脾失運化，導致濕郁、痰郁；不能運化水谷則食郁；食、痰、濕三者壅滯中焦，則脹滿不食、吞酸嘔吐諸癥叢生；此證雖有氣、血、火、濕、痰、食六郁，而實際多為肝脾郁結為病。中醫(yī)學的肝脾與現(xiàn)代醫(yī)學的消化系統(tǒng)內(nèi)涵相近，而腸道菌群在消化過程中發(fā)揮著重要作用。越鞠丸的作用通路和靶點雖然尚不明確，但本研究表明其對腸道菌群有明顯的改變，說明辛伐他汀和越鞠丸降低血脂的作用機制是不同的。

人類腸道微生物菌群超過3500種[15]，腸道細菌中95%以上可歸為厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門[16]。越來越多的循證研究表明，AS患者的腸道菌群失衡，其中雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌明顯減少，而大腸桿菌、鏈球菌、幽門桿菌等明顯增加[17-19]?，F(xiàn)代基礎研究中， Xie等[20]研究表明乳桿菌能顯著降低高脂飼料喂養(yǎng)鼠的血總膽固醇水平；陳麗華[21]的研究結果發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌能降低ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成面積；Chen等[22]研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇大鼠模型喂飼雙歧桿菌與低聚糖14 d后，動物血清TC、TG降到基本正常水平。本研究從腸道菌群分析結果看，越鞠丸能促進雙歧桿菌科、乳桿菌科和毛螺菌科細菌的生長，從而對動脈粥樣硬化產(chǎn)生有益作用，這與文獻報道一致。對于越鞠丸作用的其他菌科，放線菌通過產(chǎn)生各種生物活性物質參與宿主代謝以及維持宿主腸道微生態(tài)平衡等一系列重要的生理活動；擬桿菌對多糖的利用方面作用尤為突出；厚壁菌門中芽孢桿菌綱中的芽孢桿菌目和肉桿菌科包含致病菌，但乳桿菌科細菌能發(fā)酵分解糖代謝，終產(chǎn)物中50%以上是乳酸罕見致病，其梭菌綱細菌可以水解糖和蛋白質，其丹毒絲菌綱細菌糖發(fā)酵能力較弱且包含致病菌；變形菌門的形狀具有極為多樣的形狀，β變形菌和γ變形菌均為致病菌，但δ變形菌能脫硫或者還原硫、還原三價鐵罕見致病。柔膜菌門細菌對動植物殘體分解起著十分重要的作用，有益生菌也有致病菌，其產(chǎn)氫細菌目中的細菌能夠利用分子態(tài)氫和氧之間反應所產(chǎn)生的能，在動物腸道中的具體作用尚不明確；疣微菌門對肥胖癥和2型糖尿病的發(fā)病具有重要作用。關于以上細菌的相關文獻，目前報道較少，因此本研究的結果具有一定的開拓性。

腸道微生態(tài)與中醫(yī)理論存在相關性。生物與環(huán)境統(tǒng)一論是微生態(tài)學的基本觀點，這與中醫(yī)學的核心觀點整體觀具有統(tǒng)一性。同時微生態(tài)平衡理論與中醫(yī)學陰陽平衡理論、微生態(tài)學的微生態(tài)調節(jié)論與中醫(yī)學的調整陰陽扶正祛邪理論具有相通性[23]，因此腸道微生態(tài)原理與中醫(yī)基礎理論的一致性可以使其成為中醫(yī)理論與現(xiàn)代醫(yī)學研究的切入點。本研究表明，中醫(yī)基礎理論指導下的經(jīng)典方越鞠丸降血脂的機制與辛伐他汀不同，越鞠丸可能通過抑制紅蝽菌科、普雷沃氏菌科、S24-7科、氣單胞菌科細菌和促進雙歧桿菌科、理研菌科、乳桿菌科、毛螺菌科、產(chǎn)氫細菌目細菌的生長起到降低TC和LDL-C的作用，且越鞠丸無不良反應報道，安全性較辛伐他汀高，充分體現(xiàn)出中醫(yī)治病的優(yōu)勢，同時證明在降脂方面中草藥的應用能減少他汀類化學藥物的使用，降低他汀類化學藥物的風險。

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EffectsofYueJuPillontheBloodLipidsofApoE-/-micefromIntestinalFloraDiversity

LI Yu-bo1, HAO Gai-mei1, JIA Hai-hua1, WANG Guo-wei1, HUANG Yuan2, LI Zhi-geng1△

(1.InstituteofBasicTheoryforChineseMedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalScience,Beijing100700,China; 2.GuangxiBotanicalGardenofMedicinalPlants,Nanning530023,China)

Objective: To observe the effect on blood lipids of Yueju pills, a representative formula of the SixYu, thus provide reference for clinical application and experimental study. Methods: The model of atherosclerotic plaque was established by feeding ApoE-/-mice with high-fat diet. Interventions include Yueju pills and simvastatin. Elisa was used to detect the serum lipid content in mice. The intestinal microflora was analyzed based on 16S rDNA gene sequencing. Results: Mice in Yueju pills group, simvastatin group as well as the model control group experienced higher level of serum cholesterol (TC), triglyceride (TG), low density lipoprotein (LDL-C) and lower level of high-density lipoprotein (HDL-C) than those in the normal diet control group. TC and LDL-C levels of mice in Yueju pills group were lower than those in model control group but showed no significant difference compared with simvastatin group. In terms of triglyceride (TG) and high-density lipoprotein (HDL-C), Yueju pills group showed no statistically difference compared with model control group. There was a significant difference in the stool samples between Yueju pills group and the other groups, while the difference between the model control group and the simvastatin group was not significant. Conclusion: Yueju pills can reduce TC and LDL-C, whose mechanism is different from simvastatin. Yueju pills may reduce TC and LDL-C by inhibiting the growth of four kinds of bacteria such as Coriobacteriaceae, while promoting the growth of Bifidobacteriaceae and promoting growth of five other kinds of bacteria such as bifidobacterium.

Intestinal microflora; Yueju pills; Blood lipids

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金資助項目(YZ-1539;YZ-1541)-加味越鞠丸對動脈粥樣硬化的作用機制研究;越鞠保和丸對ApoE-/-小鼠消化功能及高脂血癥的調節(jié)作用

李玉波(1986-)，男，湖北荊州人，助理研究員，醫(yī)學博士，從事心血管及情志類疾病的中醫(yī)藥防治研究。

△通訊作者：李志更(1979-)，男，河北石家莊人，副研究員，醫(yī)學博士，從事中醫(yī)治則治法及養(yǎng)生學研究，Tel：010-64089032，E-mail：li-zhi-geng@163.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)11-1559-05

2017-04-17