透明質(zhì)酸發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型

丁 永，趙郁聰*

（1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

透明質(zhì)酸發(fā)酵過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型

丁 永1，趙郁聰2*

（1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021；2.陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

構(gòu)建透明質(zhì)酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型可反⒊發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)量、基質(zhì)消耗量及透明質(zhì)酸產(chǎn)量之間的變化規(guī)律。采用獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，利用MATLAB軟件對(duì)透明質(zhì)酸含量、還原糖殘量、菌體量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了非線性規(guī)劃，建立了透明質(zhì)酸生成動(dòng)力學(xué)的模型。對(duì)擬合值與實(shí)驗(yàn)值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其吻合度較好，相對(duì)誤差＜5%。本模型適用于培養(yǎng)基初糖質(zhì)量濃度＜30 g/L的分批發(fā)酵，為透明質(zhì)酸的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)放大、發(fā)酵過(guò)程的工藝設(shè)計(jì)和管理控制提供科學(xué)的依據(jù)。

透明質(zhì)酸；獸疫鏈球菌；發(fā)酵動(dòng)力學(xué)

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸以β-1,3-糖苷鍵和β-1,4-糖苷鍵連接而成的二糖單位重復(fù)構(gòu)成的直鏈粘多糖[1]。廣泛存在于高等動(dòng)物的結(jié)締組織和微生物莢膜中。HA的生理功能多種多樣，如其良好的粘彈性在關(guān)節(jié)腔中可起到潤(rùn)滑和保護(hù)的作用；可使細(xì)胞之間黏合在一起，保證了正常的細(xì)胞代謝及組織保水作用，并保護(hù)細(xì)胞不受病原菌的侵害，在皮膚中起到保持水分的作用，使皮膚具有良好的彈性和韌性。近年來(lái)用HA治療骨關(guān)節(jié)疾病以及HA對(duì)疼痛和炎癥的緩解作用，預(yù)防術(shù)后粘連和對(duì)軟組織修復(fù)的顯著效果[2]。透明質(zhì)酸-納米銀復(fù)合凝膠在臨床創(chuàng)傷包縛材料領(lǐng)Ⅱ有潛在的應(yīng)用價(jià)值[3]，透明質(zhì)酸在癌癥轉(zhuǎn)移控制藥物及新⒈藥物載體設(shè)計(jì)有廣泛應(yīng)用[4]。

傳統(tǒng)獲得HA的方法是動(dòng)物組織提取法，但該方法存在原料不足、工藝復(fù)雜、純度低、生產(chǎn)成本昂貴等缺點(diǎn)。1983年日本資生堂成功開(kāi)發(fā)出微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的HA，從此克服了組織提取法的諸多缺點(diǎn)，成為現(xiàn)下國(guó)外主流的生產(chǎn)方法[5]。目前國(guó)內(nèi)的HA生產(chǎn)廠家大多還采取組織提取法，但收率低、提純難、成本高、質(zhì)量差、難以大規(guī)模生產(chǎn)，無(wú)法滿足國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的需求，還需從國(guó)外大量進(jìn)口。本研究通過(guò)對(duì)獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）ATCC-39920生產(chǎn)透明質(zhì)酸的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，旨在為透明質(zhì)酸的放大實(shí)驗(yàn)、發(fā)酵過(guò)程的工藝設(shè)計(jì)和管理控制提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus）：陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院誘變保藏（原始菌株編號(hào)：ATCC-39920，來(lái)源于美國(guó)國(guó)家菌種保藏中心），實(shí)驗(yàn)室保藏號(hào)Sz560。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，瓊脂20g/L，滅菌前調(diào)整pH7.0、121℃滅菌20min；血瓊脂平板（70 mm血平板）：華美生物有限公司；

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，NaCl 5 g/L，蛋白胨15 g/L，酵母膏10 g/L，牛肉膏10 g/L，KH2PO40.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，K2HPO41.5g/L，滅菌前調(diào)整pH7.0、121℃滅菌20min，冷卻至溫度低于50℃，無(wú)菌條件下加入1%優(yōu)級(jí)小牛血清；

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，酵母浸粉20 g/L，小牛血清1%，MgSO42.0 g/L，KH2PO41.6 g/L，F(xiàn)eSO40.005 g/L。調(diào)pH 7.0、121℃滅菌20 min備用。

1.1.3 材料

氫氧化鈉、葡萄糖（均分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨、酵母浸粉（均生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸（均為分析純）：美國(guó)Amresco公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RDX-280型不銹鋼電熱手提式滅菌消毒器：上海申安醫(yī)療器械廠；Q/BKYY10-91型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠；HQL300柜式恒溫?fù)u床：中國(guó)科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；TDH-1恒溫空氣搖床：江蘇太倉(cāng)儀器廠；J2-Mc高速冷凍離心機(jī)、DU640紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：美國(guó)Beckman公司；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

取10 mL液體培養(yǎng)基于試管中，滅菌后加入1%的小牛血清，菌種用接種環(huán)挑取一環(huán)接種于試管中，置于37℃靜置培養(yǎng)24～36 h；重復(fù)操作活化兩次。

1.3.2 種子培養(yǎng)

用接種環(huán)從斜面上挑取一環(huán)菌體，接于裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中培養(yǎng)，200 r/min、37℃培養(yǎng)12～24 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

將培養(yǎng)好的種子接入裝有50 mL發(fā)酵液的500 mL三角瓶中，接種量為5%，200 r/min、37℃培養(yǎng)14 h。1.3.4取樣檢測(cè)

每2 h取一次樣品，在10 000 r/min條件下離心10 min，離心后分離上清液與沉淀分別置于4℃冰箱中保存，待檢測(cè)備用并作好記錄[6]。

1.3.5 計(jì)算公式

在平衡生長(zhǎng)條件下，微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)速率rX的計(jì)算公式為：

式中：X為微生物細(xì)胞濃度，g/L；μ為微生物比生長(zhǎng)速率，h-1。

由表４可以看出，解釋變量與解釋變量和，以及解釋變量和之間都存在高度線性相關(guān)性．盡管方程整體線性回歸擬合很好，但變量的參數(shù)t值并不顯著，表明模型確實(shí)存在嚴(yán)重的多重共線性．

1.3.6 測(cè)定方法

菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定：按照參考文獻(xiàn)[7]的方法測(cè)定。還原糖濃度測(cè)定：采用DNS法[6]。透明質(zhì)酸濃度檢測(cè)方法：采用CTAB濁度法[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 獸疫鏈球菌菌落和菌體特征

圖1 發(fā)酵菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of fermentation strains

2.1.1 菌落形態(tài)由圖1可知，菌落形態(tài)為圓形、表面干燥、褶皺、邊緣粗糙、顏色為乳白色并有凸起。

2.1.2 菌體發(fā)酵過(guò)程形態(tài)變化

圖2 不同發(fā)酵階段的菌體形態(tài)Fig.2 Mycelial morphology of different fermentation phases

由圖2可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體數(shù)量逐漸增加，并且由最初的單個(gè)菌體變成之后的多個(gè)個(gè)體相連的長(zhǎng)鏈形式，培養(yǎng)初期菌體莢膜比較明顯，從9 h之后莢膜明顯的消失，其主要原因可能是菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后透明質(zhì)酸釋放到周?chē)h(huán)境中，莢膜也隨之消失。

2.2 獸疫鏈球菌發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究[9]

圖3 獸疫鏈球菌發(fā)酵過(guò)程曲線Fig.3 Fermentation curve ofStreptococcus zooepidemicus

由圖3可知，在0～1 h期間，菌體處于適應(yīng)期，菌體數(shù)量沒(méi)有顯著增加，葡萄糖的消耗也很?。辉?～5 h期間，菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體體積及數(shù)量急劇增加，葡萄糖殘量急劇下降；在6 h以后的時(shí)間段里，菌體進(jìn)入穩(wěn)定期及衰退期，殘?zhí)橇孔兓静蛔兞?。透明質(zhì)酸含量曲線為鐘形曲線，中間會(huì)有一個(gè)峰值。在前期，隨著菌體量的增加，HA含量逐漸增加；在8～12 h期間，含量達(dá)到最大值，此時(shí)期菌體正好進(jìn)入穩(wěn)定期，莢膜中的HA基本都已釋放到培養(yǎng)基中去，隨后的時(shí)間段里，HA分子降解，分子量降低，HA含量降低。由此可知，透明質(zhì)酸主要是在穩(wěn)定期產(chǎn)生。

2.2.1 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型的建立[10-12]

在獸疫鏈球菌發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的過(guò)程中，產(chǎn)物包括透明質(zhì)酸、乳酸、乙酸等，乙酸的濃度相當(dāng)?shù)?，已忽略不?jì)。在發(fā)酵過(guò)程中，葡萄糖為唯一限制性底物，乳酸為唯一限制性產(chǎn)物。由圖3可知，HA和乳酸的生成與菌體的生長(zhǎng)相偶聯(lián)，但當(dāng)乳酸積累到一定濃度時(shí)，HA的合成速度明顯變慢，說(shuō)明乳酸對(duì)HA的合成具有強(qiáng)烈的抑制作用。同時(shí)，乳酸的產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞繼續(xù)合成乳酸也會(huì)產(chǎn)生抑制作用[13]。所以結(jié)合Andrew和Hinshelwood模型，發(fā)現(xiàn)下面的動(dòng)力學(xué)模型能較好的擬合：

式中：μmax為菌體最大比生長(zhǎng)速率，h-1；KS為底物半飽和常數(shù)，g/L；Ki為底物抑制常數(shù)，g/L；K1為乳酸對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制常數(shù)；PLA為乳酸濃度，g/L。

2.2.2 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

發(fā)酵過(guò)程中底物的消耗主要用于以下3個(gè)方面：一是用于菌體細(xì)胞生長(zhǎng)；二是合成代謝產(chǎn)物；三是用于維持細(xì)胞生長(zhǎng)代謝所需的基本能量。底物的消耗與微生物菌體生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的形成有著密切的關(guān)系。以此，建立動(dòng)力學(xué)模型為：

式中：YX/S為細(xì)胞生成得率系數(shù)，即細(xì)胞生成速率與底物消耗速率之比；YP/S為產(chǎn)物形成得率系數(shù)，即產(chǎn)物形成速率與底物消耗速率之比；mS為維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)所需能量的細(xì)胞維持系數(shù)，g/（g·s）。

2.2.3 透明質(zhì)酸產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型

由圖3可知，透明質(zhì)酸的發(fā)酵為生長(zhǎng)偶聯(lián)型過(guò)程，可以用下面的動(dòng)力學(xué)模型對(duì)其進(jìn)行模擬：

式中：PHA為HA的質(zhì)量濃度，g/L；PLA為乳酸的質(zhì)量濃度，g/L；αHA為HA的偶聯(lián)常數(shù)；K2為乳酸對(duì)HA合成的抑制常數(shù)。

2.3 模型參數(shù)求解

根據(jù)測(cè)定結(jié)果，應(yīng)用MATLAB軟件對(duì)其進(jìn)行非線性規(guī)劃，求得模型參數(shù)。

表1 動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)模擬值Table 1 Simulation values of kinetics model parameters

由此，得到本實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型：

（1）菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型為：

（2）底物消耗動(dòng)力學(xué)模型為：

（3）透明質(zhì)酸生成動(dòng)力學(xué)模型為：

2.4 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型的擬合值與實(shí)驗(yàn)值的比較[14-15]

模型建立后，其適用性還有待通過(guò)進(jìn)一步的發(fā)酵結(jié)果對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，菌體生長(zhǎng)曲線為典型的S型曲線。0～4h為適應(yīng)期；4～16 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，HA含量峰值就出現(xiàn)在此時(shí)期；16 h之后為穩(wěn)定期，菌體數(shù)量變化不大，HA的含量也不再增加。

圖4 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值比較Fig.4 Comparison of fitted values of kinetics model and experimental values of biomass

圖5 透明質(zhì)酸含量動(dòng)力學(xué)模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值比較Fig.5 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of hyaluronic acid production

圖6 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值的比較Fig.6 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of substrate consumption

圖7 乳酸生成動(dòng)力學(xué)模型擬合值與實(shí)驗(yàn)值比較Fig.7 Comparison of kinetics model fitted values and experimental values of lactic acid production

由圖5～圖7可知，所建模型能較好地反應(yīng)出獸疫鏈球菌發(fā)酵產(chǎn)透明質(zhì)酸的過(guò)程，底物的消耗，乳酸生成的擬合值與實(shí)驗(yàn)值吻合度好，相對(duì)誤差＜5%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于大量的發(fā)酵數(shù)據(jù)，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件對(duì)透明質(zhì)酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行了非線性規(guī)劃，建立了透明質(zhì)酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的模型。除少量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)偏差較大之外，擬合值與實(shí)驗(yàn)值較吻合，達(dá)到了實(shí)驗(yàn)的目的。

菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型顯示菌體生長(zhǎng)受到兩方面的抑制因素，一項(xiàng)為底物抑制，另一項(xiàng)為產(chǎn)物乳酸的抑制。透明質(zhì)酸生成動(dòng)力學(xué)模型可知在乳酸產(chǎn)量較低時(shí)，透明質(zhì)酸的量與生物量呈正比例關(guān)系；當(dāng)乳酸量與透明質(zhì)酸量積累到一定濃度時(shí)，HA的合成速度明顯變慢，說(shuō)明HA的合成與菌體的生長(zhǎng)相偶聯(lián)并受到乳酸的抑制作用。

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Kinetic model of the hyaluronic acid fermentation process

DING Yong1,ZHAO Yucong2*
（1.School of Food and Bioengineering,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an,710021,China;2.School of Light Industry,Shaanxi University of Science and Technology,Xi'an,710021,China）

The construction of hyaluronic acid fermentation kinetics model can reflect the change rules between the biomass variation,substrate consumption and hyaluronic acid production in the fermentation process.The hyaluronic acid was fermented in shake flask byStreptococcus zooepidemicus,the hyaluronic acid content,reducing sugar residue content and bacterial amount were conducted with nonlinear programme,and the kinetic model of hyaluronic acid production was established by MATLAB software.The fitted value was coincided with the experimental value,and the relative error was less than 5%.The model was applicable to the batch fermentation in the medium with initial glucose concentration less than 30 g/L,and it could provide scientific basis for the industrial production amplification of hyaluronic acid,fermentation technology design and operation management.

hyaluronic acid;Streptococcus zooepidemicus;fermentation kinetics

TQ929.2

0254-5071（2017）12-0126-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.026

2017-10-04

陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目（14JK1089）

丁 永（1974-），男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：趙郁聰（1975-），女，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。