東方伊薩酵母FJ-J-3發(fā)酵特性的研究

姚淑敏，徐凱峰，宋晴晴，陳 珊，王 萍

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

東方伊薩酵母FJ-J-3發(fā)酵特性的研究

姚淑敏，徐凱峰，宋晴晴，陳 珊，王 萍

（曲阜師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 曲阜 273165）

該實(shí)驗(yàn)研究了東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3菌株在不同初始葡萄糖含量、培養(yǎng)溫度條件下細(xì)胞生長、葡萄糖利用及產(chǎn)乙醇情況。結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中含有50 g/L葡萄糖時菌體生長量較高，生長速率最快；且乙醇產(chǎn)量較高，產(chǎn)率最高。在培養(yǎng)溫度為28℃時菌體生長量最高，且乙醇產(chǎn)量最高。菌株FJ-J-3能夠耐受16%vol的乙醇，且在72 h時細(xì)胞仍能正常存活。

純種發(fā)酵；東方伊薩酵母；釀酒酵母；生長特性；初始培養(yǎng)條件

生物乙醇是一種可再生的清潔能源，受到人們廣泛的關(guān)注。但酵母的耐受性決定著乙醇產(chǎn)量和生產(chǎn)效率[1]。乙醇對酵母細(xì)胞存在很大毒害作用[2]，同時在發(fā)酵的過程中不斷增加的乙醇所產(chǎn)生的壓力也是限制乙醇生產(chǎn)和最終阻止乙醇發(fā)酵的重要因素[3]。乙醇含量為60 g/L的情況下，季也蒙有孢漢遜酵母被完全抑制[4]；乙醇含量120 g/L的情況下，日本清酒酵母被完全抑制[5]；張強(qiáng)等[6]在研究釀酒酵母的乙醇耐受性的結(jié)果表明，室溫條件下培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，其中能在30～60 g/L乙醇含量條件下生長的菌株，乙醇耐受性為差，60～100 g/L為耐受性中等，而100～130 g/L則為耐受性高。酵母的溫度耐受性是乙醇產(chǎn)量的基本保障，溫度的變化會引起酵母細(xì)胞內(nèi)的脂肪酸、磷脂、麥角固醇等成分的變化，從而影響細(xì)胞本身正常生理活動[7]。溫度越高越易引起酵母早衰、死亡，同時高溫也增加了乙醇對酵母細(xì)胞的毒害作用[8]。甜酒釀發(fā)酵不是一種微生物單獨(dú)起作用，實(shí)際上是多種菌群的混合發(fā)酵，發(fā)酵過程中存在菌相的變化[9-10]。近年來，已有學(xué)者開始了東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）的研究，覃香香等[11]發(fā)現(xiàn)，東方伊薩酵母能降解木糖醇發(fā)酵抑制物；張慕明等[12]證實(shí)，東方伊薩酵母YP-1對活性艷紅K-2BP有較好的脫色作用；TONDEE T等[13]得出結(jié)論，東方伊薩酵母SF9-246對廢水有脫色作用。王風(fēng)芹等[14]新分離一株耐高溫東方伊薩酵母HN-1，探究出其乙醇產(chǎn)量較高；KWON Y J等[15]新分離出一株耐熱東方伊薩（Issatchenkia orientalis）IPE 100，探究其在不同甜高粱莖稈固態(tài)發(fā)酵（solid state fermentation，SSF）時的產(chǎn)乙醇量，并證實(shí)其有相應(yīng)的酶水解木質(zhì)纖維素[16]。

本實(shí)驗(yàn)利用從甜酒釀中分離出一株東方伊薩酵母FJ-J-3，研究該菌株在培養(yǎng)基不同初始葡萄糖含量和不同培養(yǎng)溫度條件下的發(fā)酵特性，為該菌株的進(jìn)一步利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑[17]

東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）FJ-J-3：分離自甜酒釀。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：葡萄糖50g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH，115℃滅菌15 min。

YPD固體培養(yǎng)基：YPD培養(yǎng)基中加入瓊脂20 g/L。1.2儀器與設(shè)備

GC-2010氣相色譜儀（配氫火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）檢測器、微機(jī)工作站及色譜柱）：日本島津公司。GN-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HNY-2102c恒溫培養(yǎng)振蕩器：天津歐諾儀器股份有限公司；H.H.S-214B電熱恒溫水浴鍋：上海醫(yī)療器械五廠；H2050R臺式高速冷凍離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-5500可見光分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化[4]

挑取一環(huán)菌株FJ-J-3，接種在含有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28℃、170 r/min培養(yǎng)36 h，離心去上清，將菌體用無菌水洗滌2次，最后懸于2 mL無菌水中，作為種子液。

1.3.2 不同初始葡萄糖含量對菌株FJ-J-3生長的影響

分別取0.3 mL種子液接種于葡萄糖含量為20 g/L、50 g/L、80 g/L、120 g/L、150 g/L的YPD液體培養(yǎng)基中，在28℃、170 r/min條件下培養(yǎng)，每隔6 h取樣，測定菌株FJ-J-3的生長情況、葡萄糖利用量、乙醇產(chǎn)生情況。

1.3.3 不同培養(yǎng)溫度對FJ-J-3生長的影響

分別取0.3 mL種子液分別接種于5組相同的YPD液體培養(yǎng)基中，分別在溫度為25℃、28℃、33℃、37℃、42℃的條件下170 r/min搖床培養(yǎng)，每隔12 h取樣，測定菌株FJ-J-3的生長情況、葡萄糖利用量、乙醇產(chǎn)生情況。

1.3.4 菌株FJ-J-3的乙醇耐受性

取0.3 mL種子液分別接種于乙醇含量為0、40 g/L、80g/L、120g/L、160g/L、200g/L的YPD液體培養(yǎng)基中28℃、170 r/min條件下培養(yǎng)，每隔12 h取樣，測定菌株FJ-J-3的生長情況和死活細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 測定方法

菌體生長情況測定：利用分光光度計(jì)法，在波長600nm處測定吸光度值。

葡萄糖含量的測定：按照參考文獻(xiàn)[18]的方法測定。

乙醇產(chǎn)量的測定：按照參考文獻(xiàn)[19]的方法測定。

菌體的比生長速率=OD600nm值/初始葡萄糖含量

降糖率=剩余糖的量/時間

乙醇產(chǎn)率=乙醇產(chǎn)量/初始葡萄糖含量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同初始葡萄糖含量對菌株FJ-J-3生長的影響

從圖1可看出，當(dāng)培養(yǎng)基中初始葡萄糖含量為20g/L時，細(xì)胞生長量偏低，最大OD600nm值為17.77。初始葡萄糖含量為50g/L時，培養(yǎng)40h時菌體濃度達(dá)到最大，OD600nm值為26.065。初始葡萄糖含量為80 g/L時OD600nm值最大為23.9，比初始葡萄糖含量50 g/L時低。當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖含量為120 g/L和150 g/L時，細(xì)胞的最大生長量OD600nm值分別為31.73和33.74，但此時菌體的比生長速率從初始葡萄糖含量50 g/L時的536 h-1下降至265 h-1和224 h-1，因此，培養(yǎng)基中添加50 g/L的葡萄糖是YPD培養(yǎng)基的最佳含糖量。

圖1 不同初始葡萄糖含量條件下FJ-J-3菌株的生長曲線Fig.1 Growth curve of strain FJ-J-3 at different initial glucose concentrations

圖2 不同初始葡萄糖含量對菌株FJ-J-3利用葡萄糖的影響Fig.2 Effects of different initial glucose concentrations on glucose utilization of strain FJ-J-3

由圖2可知，培養(yǎng)至40h時初始葡萄糖含量50g/L的培養(yǎng)基中殘留葡萄糖已經(jīng)接近為零，降糖率達(dá)到0.125 g/（L·h），其細(xì)胞生長也接近穩(wěn)定期。而在初始葡萄糖含量120 g/L、150 g/L的培養(yǎng)基中，40 h時培養(yǎng)基中細(xì)胞的降糖率分別為0.015 g/（L·h）和0.016 g/（L·h）。這說明5%的葡萄糖含量是細(xì)胞生長最佳濃度，高濃度的葡萄糖會對酵母菌的生長有抑制作用。

圖3 不同初始葡萄糖含量對菌株FJ-J-3乙醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of different initial glucose concentrations on ethanol production of strain FJ-J-3

由圖3可知，初始葡萄糖含量為150 g/L時，培養(yǎng)40 h

時所產(chǎn)的乙醇量達(dá)到最大值0.027 mL/mL，其乙醇產(chǎn)率為18%。而在初始葡萄糖含量為50 g/L時，菌株在40 h時乙醇量達(dá)到最大為0.026 mL/mL，其產(chǎn)率為52%。由此可見東方伊薩酵母FJ-J-3在低濃度葡萄糖含量的情況下的乙醇產(chǎn)率高于高含量葡萄糖培養(yǎng)條件。從圖1～圖3可以看出，菌株FJ-J-3在培養(yǎng)基中含有50 g/L葡萄糖時菌體生長量較高，生長速率最快；且乙醇產(chǎn)量較高，產(chǎn)率最高。因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇培養(yǎng)基中葡萄糖含量為50 g/L。

2.2 不同培養(yǎng)溫度對菌株FJ-J-3生長的影響

圖4 不同培養(yǎng)溫度條件下菌株FJ-J-3的生長曲線Fig.4 Growth curves of strain FJ-J-3 at different culture temperatures

由圖4可知，培養(yǎng)溫度在28℃時酵母菌FJ-J-3的生長狀況最好。隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株的生長狀況明顯下降，當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到42℃時，細(xì)胞生長嚴(yán)重受到影響，由此可以推測菌株FJ-J-3不能耐受高溫，28℃是最適生長溫度。

圖5 不同培養(yǎng)溫度對菌株FJ-J-3利用葡萄糖的影響Fig.5 Effects of different culture temperatures on glucose utilization of strain FJ-J-3

由圖5可知，28℃時葡萄糖消耗的速度最快，這與28℃時細(xì)胞生長狀況最好相對應(yīng)。在28℃時菌株FJ-J-3在24 h時菌體濃度達(dá)到最大，其利用糖的量也達(dá)到最大，所以殘留的糖接近與零。

由圖6可知，菌株FJ-J-3的產(chǎn)乙醇量在不同的溫度梯度下不同，28℃時產(chǎn)乙醇量最多，42℃時產(chǎn)乙醇量最小，這與其生長狀況及糖的利用相對應(yīng)。從圖4～圖6可以看出，菌株FJ-J-3在培養(yǎng)溫度為28℃時菌體生長量最高，且乙醇產(chǎn)量最高。因此選擇培養(yǎng)溫度為28℃。

圖6 不同培養(yǎng)溫度對菌株FJ-J-3乙醇產(chǎn)量的影響Fig.6 Effects of different culture temperatures on ethanol production of strain FJ-J-3

2.3 菌株FJ-J-3的乙醇耐受性

圖7 菌株FJ-J-3在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)條件下的生長曲線Fig.7 Growth curves of strain FJ-J-3 at different ethanol concentrations

由圖7可知，菌株FJ-J-3具有良好的乙醇耐受性。菌株FJ-J-3耐受最大乙醇含量為16%vol，此條件下在菌株FJ-J-3培養(yǎng)72h仍能正常存活，OD600nm值達(dá)到6。在12%vol乙醇含量下生長狀況良好，這與報道[5]的其他酵母菌乙醇耐受性相當(dāng)。

3 結(jié)論

分離自甜酒釀的東方伊薩酵母FJ-J-3在培養(yǎng)基中含有50 g/L葡萄糖時菌體生長量較高，生長速率最快；且乙醇產(chǎn)量較高，產(chǎn)率最高。這將有大大提高設(shè)備的利用率，在工業(yè)生產(chǎn)上有一定的優(yōu)勢。在培養(yǎng)溫度為28℃時菌體生長量最高，且乙醇產(chǎn)量最高。能夠耐受16%vol的乙醇，且在72 h時細(xì)胞仍能正常存活。是一株頗具工業(yè)開發(fā)潛力的酵母菌株。

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Fermentation characteristics ofIssatchenkia orientalis FJ-J-3

YAO Shumin,XU Kaifeng,SONG Qingqing,CHEN Shan,WANG Ping
（College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273165,China）

The cell growth,glucose utilization and ethanol production ofIssatchenkia orientalisFJ-J-3 were studied at the conditions of different initial glucose contents and culture temperatures.Results showed thatI.orientalisgrew well and the growth rate was the fastest in the medium containing glucose 50 g/L,and the ethanol production and productive rate were the highest.At the condition of culture temperature 28℃,the cell growth and the ethanol production were the highest.The ethanol tolerance of strain FJ-J-3 was good;it could tolerate 16%vol ethanol and grew well for 72 h.

pure fermentation;Issatchenkia orientalis;Saccharomyces cerevisiae;growth characteristics;initial culture condition

Q935

0254-5071（2017）12-0092-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.019

2017-07-15

國家青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31200400）；曲阜師范大學(xué)本科科研訓(xùn)練項(xiàng)目

姚淑敏（1967-），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源和利用。