影響單酶法制備核桃多肽的因素研究

王紀輝，耿陽陽，侯 娜*，胡伯凱，何佳麗，梁 美

（1.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省核桃研究所，貴州 貴陽 550005）

影響單酶法制備核桃多肽的因素研究

王紀輝1，2，耿陽陽1，2，侯 娜1，2*，胡伯凱1，2，何佳麗1，2，梁 美1，2

（1.貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550005；2.貴州省核桃研究所，貴州 貴陽 550005）

為尋求核桃多肽的最佳制備方法，以酶法水解核桃蛋白為基礎(chǔ)，通過單因素和正交試驗對核桃多肽制備工藝進行優(yōu)化。結(jié)果表明，在酶解時間3 h、酶解溫度38℃、pH 6.8、酶添加量4%、底物濃度為2.4%時，核桃多肽的抗氧化活性最佳，此時DPPH清除率可達92.35%。

核桃；多肽；酶解；制備；工藝

核桃（Juglans regia）又稱胡桃、羌桃，為胡桃科植物。核桃不僅滋味鮮美，而且營養(yǎng)豐富，核桃蛋白富含18種氨基酸，其中人體必需氨基酸有8種[1]，且精氨酸和谷氨酸含量較高，這些成分對人體內(nèi)細胞代謝至關(guān)重要，長期食用對人體具有很佳的保健功能，還能有效降低心血管疾病的發(fā)生率[2]。目前，制備食用油脂成為核桃仁主要的加工途徑，榨油以后的核桃餅粕中蛋白質(zhì)種類較為齊全、含量豐富[3]。然而核桃餅粕經(jīng)過粗放的加工處理后，主要用作肥料或飼料，餅粕利用率極其低下，造成資源浪費[4]。提高核桃附加產(chǎn)值，高效利用核桃餅粕，提取其中蛋白質(zhì)已成為后續(xù)多元功能產(chǎn)品生產(chǎn)中的首要研究任務(wù)[5]。

人體對蛋白質(zhì)進行消化的主要方式是以肽的形式進行吸收，非單一氨基酸形式的小肽類，在人類的生命活動中具有重要的生理功能[6]，如抑制炎癥發(fā)生、清除機體內(nèi)自由基、延緩衰老，是潛在的天然、安全、高效抗氧化劑[7]，一直以來備受科學(xué)家和各國政府的高度關(guān)注。隨著科技水平的提高，抗氧化肽類以一種非酶類自由基清除劑，正在食品、藥品領(lǐng)Ⅱ蓬勃發(fā)展[8]。活性多肽不含脂肪，且其中氨基酸種類豐富，具有多種生理性能，符合人們對“低脂高蛋白”的食品需求，受到了廣大消費者的喜愛[9]。近幾年，抗氧化肽作為特效添加劑被應(yīng)用于各種高檔化妝品中；美國《未來科學(xué)》雜志預(yù)測到2025年，各類活性多肽產(chǎn)品將占發(fā)達國家國內(nèi)生產(chǎn)總值的20%[10]。

目前，針對核桃榨油后核桃餅粕中多肽制備方面的科學(xué)研究較為少見。本研究以冷榨去除核桃油的核桃餅粕為原料，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率為考察指標，以酶法水解核桃餅粕蛋白為基礎(chǔ)，研究影響核桃抗氧化肽制備的因素，研究結(jié)果對充分利用核桃資源，提高核桃附加產(chǎn)值，促進核桃深加工尤為重要，而且對于助推貴州省脫貧攻堅，增加農(nóng)民收入具有重要的現(xiàn)實意義[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃冷榨餅粕：實驗室自制；正己烷（分析純）：南京化學(xué)試劑股份有限公司；木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、鄰二氮菲、氫氧化鈉（均為分析純）：四川化工有限公司；DPPH（分析純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

50T型液壓榨油機：河南貝斯德糧油機械工程公司；101-1型電熱鼓風(fēng)干燥箱：鶴壁市天冠儀器儀表有限公司；L5S型紫外可見分光光度計：上海精密儀器儀表有限公司；FD1A-50型冷凍干燥機：江陰市新申寶科技有限公司；FW-100型高速萬能粉碎機：北京成萌偉業(yè)科技有限公司；TDL-40B型離心機：常州市儀都儀器有限公司；DEITA320型酸度計：上海平軒科學(xué)儀器有限公司；85-2A型恒溫磁力攪拌器：常州金壇良友儀器有限公司；HH-54型恒溫水浴鍋：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 核桃餅粕蛋白制備

（1）核桃仁去皮：核桃去殼以后，按料液比為1∶5（g∶mL）加入一定量的0.6%NaOH溶液，65℃水浴攪拌15 min，然后用大量清水沖洗核桃仁進行去皮，60℃恒溫干燥8 h后，用高速粉碎機進行中度粉碎，粉粹后粒度為5～10mm[12-13]。

（2）核桃仁脫脂：經(jīng)過粉碎去皮后的核桃仁在30 MPa條件下進行冷榨40 min，制得核桃餅粕，粉碎后過100目篩[14]。按料液比1∶5（g∶mL）添加正己烷提取1 h后進行抽濾，收集殘渣，經(jīng)重復(fù)提取3次后，置于通風(fēng)櫥揮發(fā)溶劑，即得核桃脫脂粉，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆肹15-16]。

（3）核桃蛋白制備：經(jīng)過脫脂后核桃粉按料液比為1∶26（g∶mL）加蒸餾水配制成蛋白質(zhì)溶液，用酸度計調(diào)節(jié)溶液pH值為11.0，置于53℃恒溫水浴中攪拌1.5 h[17]，然后以3 000 r/min離心20 min，取管中上清液用酸度計調(diào)節(jié)pH值達到4.5，攪拌1 h，以3 000 r/min離心20 min棄上清液后取沉淀，冷凍干燥后得核桃蛋白粗品[18]。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測定

取2mL酶解液體、2mLDPPH溶液，混合搖勻后置于室溫條件下，避光反應(yīng)20 min，以3 000 r/min離心20 min，然后取上清液1mL加入具塞比色管中，用蒸餾水定容至10.0mL，混勻后，在波長517 nm處測其吸光度值，樣品液平行測定3次，求其平均值[19]。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：Ai為加酶解液后DPPH溶液吸光度值；Aj為不加DPPH，只加酶解液及無水乙醇的溶液吸光度值；A0為不加酶解液，只加DPPH及水的溶液吸光度值。

1.3.3 單因素試驗優(yōu)化核桃多肽制備工藝

分別選擇木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶作為水解酶類，在底物濃度分別為0.6%、1.2%、1.8%、2.4%、3.0%，酶添加量分別為1%、2%、3%、4%、5%，酶解溫度分別為28℃、33℃、38℃、43℃、48℃，pH值分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，酶解時間分別為2 h、3 h、4 h、5 h、6 h的條件下，測定DPPH清除率，考察酶種類、底物濃度、酶添加量、溫度、pH值、時間對核桃多肽清除DPPH效果的影響。

1.3.4 正交試驗優(yōu)化核桃多肽制備工藝

在單因素研究的基礎(chǔ)上，依據(jù)單因素研究結(jié)果，選擇酶解時間、pH值、酶添加量、底物濃度為研究因素，以DPPH自由基清除率為評價指標進行核桃抗氧化肽制備工藝優(yōu)化。正交試驗因素與水平見表1。

表1 核桃抗氧化肽制備工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factor and levels of orthogonal experiments for preparation conditions optimization of walnut polypeptide

1.3.5 統(tǒng)計分析

研究數(shù)據(jù)（3次數(shù)據(jù)平均值±標準偏差）采用Excel 2007制圖及SPSS17.0進行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶種類對抗氧化能力的影響

在底物濃度1.2%、酶添加量2%、酶解溫度33℃、pH值6.0、酶解時間3 h的條件下，研究酶種類對DPPH清除效果的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 酶種類對核桃多肽抗氧化能力的影響Fig.1 Effect of enzyme species on the antioxidant ability of walnut polypeptide

由圖1可知，4種蛋白酶均能酶解核桃蛋白制備核桃多肽，但酶解能力兩兩之間存在差異（P＜0.05），4種酶均在最適條件酶解相同時間后，中性蛋白酶DPPH清除率達到最高（66.3%），效果最佳，因此選擇中性蛋白酶作為酶解核桃餅粕蛋白后續(xù)水解用酶。

2.1.2 酶解時間對抗氧化能力的影響

以中性蛋白酶為水解酶，在底物濃度1.2%、酶添加量2%、酶解溫度33℃、pH值6.0的條件下，研究酶解時間對DPPH清除效果的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，在一定范圍內(nèi)，核桃多肽DPPH清除率與時間呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，隨酶解時間的延長，DPPH清除率呈逐漸上升的趨勢，酶解4 h和5 h以及3 h與4 h之間不存在差異性，但與酶解時間1h、2h均呈顯著性差異（P＜0.05），從實際操作考慮，選擇酶解時間為3 h，此時DPPH清除率為65.2%。

圖2 酶解時間對核桃多肽抗氧化能力的影響Fig.2 Effect of hydrolysis time on the antioxidant ability of walnut polypeptide

2.1.3 酶解溫度對抗氧化能力的影響

以中性蛋白酶為水解酶，在酶解3 h，底物濃度1.2%、酶添加量2%、pH值6.0的條件下，研究酶解溫度對DPPH清除效果的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 酶解溫度對核桃多肽抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on the antioxidant ability of walnut polypeptide

由圖3可知，核桃多肽DPPH清除率隨溫度升高呈現(xiàn)先升高而后逐漸降低的趨勢，在酶解溫度為38℃時，DPPH清除率達到最大值（69.3%），并且與其他溫度之間存在顯著性差異（P＜0.05），此后核桃多肽清除率逐漸下降，究其主要原因是溫度超過中性蛋白酶最適溫度，導(dǎo)致蛋白酶變性失活，因此后續(xù)研究選擇酶解溫度為38℃。

2.1.4 pH值對抗氧化能力的影響

圖4 pH值對核桃多肽抗氧化能力的影響Fig.4 Effect of pH on the antioxidant ability of walnut polypeptide

以中性蛋白酶為水解酶，酶解3 h，酶解溫度38℃，在底物濃度1.2%、酶添加量2%的條件下，研究pH值對DPPH清除效果的影響，結(jié)果見圖4。

從圖4可知，pH值對核桃多肽抗氧化能力影響顯著，核桃多肽抗氧化能力隨pH值的升高呈先升高后降低的趨勢；在pH值為7.0時，核桃多肽抗氧化能力最佳（72.4%），而且與其他梯度值之間有顯著性差異（P＜0.05），而后pH值繼續(xù)增大，DPPH清除率下降，所以選擇pH值為7.0作為后續(xù)研究所需。

2.1.5 酶添加量對抗氧化能力的影響

以中性蛋白酶為水解酶，在酶解3 h，酶解溫度38℃，pH值7.0，底物濃度1.2%的條件下，研究酶添加量對DPPH清除效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 酶添加量對核桃多肽抗氧化能力的影響Fig.5 Effect of enzyme addition on the antioxidant ability of walnut polypeptide

由圖5可知，DPPH清除率隨酶添加量的增大逐漸升高，而后呈現(xiàn)下降趨勢，其原因主要是酶解反應(yīng)屬于可逆反應(yīng)，過多的產(chǎn)物會抑制酶解反應(yīng)的進行；當酶添加量為4%時，DPPH清除效果最佳，此時DPPH清除率為71.3%，且與其他濃度梯度之間差異性顯著（P＜0.05），因此選擇酶的最適添加量為4%。

2.1.6 底物濃度對抗氧化能力的影響

圖6 底物濃度對核桃多肽抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of substrate concentration on the antioxidant ability of walnut polypeptide

以中性蛋白酶為水解酶，在酶解3 h，酶解溫度38℃，pH值7.0，酶添加量4%條件下，研究底物濃度對DPPH清除效果的影響，結(jié)果見圖6。

由圖6可知，底物濃度能顯著影響核桃多肽對DPPH的清除效果，并隨底物濃度的增加逐漸增大而后趨于平衡，而且底物濃度為2.4%、3%之間以及1.2%與1.8%之間差異性不顯著，與其他濃度梯度之間差異性顯著（P＜0.05），底物濃度過低，中性蛋白酶與底物不能充分接觸，核桃蛋白水解不充分；底物濃度過高時，酶的活性部位被底物所占據(jù)，酶解反應(yīng)趨于緩慢，因此選擇底物的最適濃度為2.4%，此時DPPH清除率為91.5%。

2.2 正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以酶解時間（A）、pH值（B）、酶添加量（C）、底物濃度（D）為試驗因素，DPPH自由基清除率為考察指標，采用L9（34）正交設(shè)計研究不同因素對DPPH自由基清除效果的影響，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 核桃多肽制備工藝條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for preparation conditions optimization of walnut polypeptides

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2、表3可知，以DPPH清除率為評價指標時，影響核桃多肽制備工藝的因素主次關(guān)系為A＞C＞B＞D，即酶解時間＞酶添加量＞pH值＞底物濃度，其最優(yōu)的試驗組合為A2B1C2D2，即酶解時間為3 h，pH值為6.8，酶添加量為4%，底物濃度為2.4%，酶解時間、pH值、酶添加量對結(jié)果影響顯著（P＜0.05），底物濃度對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）；在正交試驗優(yōu)化最佳條件下進行3次平行驗證試驗，DPPH清除率為92.35%。

3 結(jié)論

本研究對中性蛋白酶水解核桃餅粕蛋白制備核桃多肽工藝進行研究，通過單因素和正交試驗確定了制備核桃多肽最佳工藝為酶解時間3h、酶解溫度38℃、pH值6.8、酶添加量4%、底物濃度2.4%。研究結(jié)果表明，核桃多肽對DPPH自由基具有較好的清除效果，清除率高達92.35%，且表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，說明核桃多肽抗氧化能力顯著，具有作為天然抗氧化劑進一步開發(fā)利用的市場前景。

[1]姜 莉，徐懷德，陳金海.核桃多肽功能特性的研究[J].食品科技，2013，38（1）：228-231.

[2]謝翠品，敬思群，劉 帥，等.黑曲霉發(fā)酵核桃粕生產(chǎn)核桃多肽工藝優(yōu)化[J].中國釀造，2013，32（2）：53-57.

[3]呂名蕊，史宣明，張 驪，等.核桃多肽功能特性及制備工藝研究進展[J].中國油脂，2013，38（5）：34-38.

[4]孔令明，李 芳，宗玉霞，等.酶解條件對核桃多肽抗氧化活性的影響[J].食品研究與開發(fā)，2013，34（14）：106-109.

[5]李艷伏.核桃粕多肽提取分離及功能特性研究[D].楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008.

[6]康俊杰，陳樹俊，趙瑞歡，等.核桃粕組成測定及抗氧化多肽工藝優(yōu)化的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊，2014（2）：31-34，38.

[7]賈靖霖，蒲云峰，李 虎，等.核桃多肽抗疲勞作用的研究[J].食品工業(yè)科技，2014，35（7）：340-342.

[8]賈靖霖，陸健康，汪莉莉，等.核桃多肽體外抗氧化活性研究[J].中國釀造，2014，33（5）：109-112.

[9]宗玉霞.核桃粕制備多肽營養(yǎng)液的工藝研究[D].烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[10]杜蕾蕾.冷榨核桃制備核桃油和核桃蛋白的研究[D].武漢：武漢工業(yè)學(xué)院，2009.

[11]宗玉霞，楊海燕，勞 菲，等.木瓜蛋白酶水解核桃粕制備抗氧化活性多肽的研究[J].中國食品添加劑，2012（4）：170-176.

[12]張興燦.核桃蛋白多肽新型酶解制備工藝的研究[D].昆明：昆明理工大學(xué)，2012.

[13]高瑞雄，閆巧珍，岳珍珍，等.冷榨核桃粕液態(tài)發(fā)酵制備核桃多肽[J].食品科學(xué)，2016，37（19）：190-196.

[14]林 燕，陳計巒，吳繼紅.酶法制備核桃多肽研究進展[J].糧食與油脂，2009（1）：46-48.

[15]姜 莉，徐懷德，陳金海，等.核桃多肽的制備及核桃多肽酒的研制[J].食品科學(xué)，2009，30（8）：307-310.

[16]GHARIBZAHEDI S M T,MOUSAVI S M,HAMEDI M,et al.Determination and characterization of kernel biochemical composition and functional compounds ofPersian walnutoil[J].J Food Sci Technol,2014,51（1）:34-42.

[17]李建杰，榮瑞芬.復(fù)合酶解制備核桃多肽工藝條件的優(yōu)化[J].中國油脂，2011，36（1）：22-26.

[18]馬 巖，孟憲軍.核桃抗氧化多肽噴霧干燥的工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2016，37（12）：243-249.

[19]李 麗，劉 陽，張 帥，等.核桃多肽制備酶解關(guān)鍵技術(shù)研究[J].食品研究與開發(fā)，2016，37（15）：130-134.

Factors affecting the preparation of walnut polypeptide by single enzyme method

WANG Jihui1,2,GENG Yangyang1,2,HOU Na1,2*,HU Bokai1,2,HE Jiali1,2,LIANG Mei1,2
（1.Guizhou Academy of Forestry,Guiyang 550005,China;2.Guizhou Institute of Walnut,Guiyang 550005,China）

In order to seek the optimum preparation method of walnut polypeptide,on the basis of enzymatic hydrolysis of walnut protein,the walnut polypeptide preparation process was optimized by single factor and orthogonal experiments.The results showed that the walnut polypeptide had the optimum antioxidant activity,with DPPH scavenging rate of 92.35%with the conditions of hydrolysis time 3 h,temperature 38℃,pH 6.8,enzyme addition 4%,and substrate concentration 2.4%.

walnut;polypeptide;enzymolysis;preparation;technology

Q93-331

0254-5071（2017）12-0068-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.014

2017-08-21

貴州省林業(yè)廳青年基金（黔林科合J[2015]13號）；貴州省核桃研發(fā)團隊服務(wù)企業(yè)行動計劃（黔科合服企[2015]4010號）

王紀輝（1988-），男，研究實習(xí)員，碩士，主要從事食品安全及食品發(fā)酵等研究工作。

*通訊作者：侯 娜（1983-），女，高級工程師，碩士，主要從事林木遺傳育種研究工作。