大腸桿菌高密度發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化

劉國鋒

（1.湖南尤特爾生化有限公司，湖南 岳陽 414000；2.山東尤特爾生物科技有限公司，山東 鄒城 273500）

大腸桿菌高密度發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化

劉國鋒1，2

（1.湖南尤特爾生化有限公司，湖南 岳陽 414000；2.山東尤特爾生物科技有限公司，山東 鄒城 273500）

該試驗對木聚糖酶工業(yè)大生產(chǎn)條件下的接種量、pH值、培養(yǎng)溫度、溶氧、誘導(dǎo)時間、比生長速率進行了單因素優(yōu)化試驗。在此單因素試驗基礎(chǔ)上，選取對酶活影響較大的比生長速率、溶氧和pH 3個因素進行了正交試驗優(yōu)化。結(jié)果表明，優(yōu)化后的發(fā)酵條件為接種量10%，發(fā)酵過程中溶氧值30%，生長期控制pH值為7.0，生長期培養(yǎng)溫度37℃，生長期比生長速率為0.12 h-1，誘導(dǎo)期pH值為6.8，誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度為35℃，誘導(dǎo)期比生長速率為0.14 h-1，在對數(shù)生長中期（OD600nm=30）時流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。優(yōu)化后，放罐木聚糖酶活力最高可達149 000 IU/mL。該研究提升了大生產(chǎn)條件下的木聚糖酶活力，為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供了指導(dǎo)。

大腸桿菌；木聚糖酶；發(fā)酵條件；優(yōu)化

木聚糖水解酶是一種復(fù)雜的復(fù)合酶系統(tǒng)，廣泛分布于自然界的細(xì)菌和真菌中。報道的木聚糖酶的來源主要有細(xì)菌、真菌、放線菌、酵母、藻類以及動物瘤胃中的細(xì)菌[1]。國內(nèi)研究產(chǎn)木聚糖酶最多的菌株是木霉（Trichoderma）、青霉（Penicillium）、黑曲霉（Aspergillusniger）、棒曲霉（Aspergillus clavatus）等。 目前，已從20余種細(xì)菌、16種真菌、3種酵母以及8種放線菌中分離出相應(yīng)的木聚糖酶[2]。木聚糖的酶法降解在食品工業(yè)、飼料工業(yè)、制藥工業(yè)等眾多行業(yè)中有著十分誘人的應(yīng)用前景，尤其是近兩年在造紙工業(yè)中成功運用木聚糖酶進行預(yù)漂白處理，使得木聚糖酶的廠家成為了一個熱點，并取得了一系列重要的進展。

高密度發(fā)酵技術(shù)能提高菌體的發(fā)酵密度，最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率（單位體積單位時間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量），不僅可以增加放罐體積、強化下游分離提取，還可以縮短生產(chǎn)周期、減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本，能極大地提高產(chǎn)品在市場上的競爭力。這一目的的實現(xiàn)，除了重組菌本身的表達性質(zhì)外，還必須給㈣重組菌生長和產(chǎn)物表達的最適環(huán)境條件，包括適宜的培養(yǎng)基組成、合適的培養(yǎng)溫度、pH、比生長速率、適宜的溶解氧以及營養(yǎng)物的合理流加等。

目前，國內(nèi)外的研究主要側(cè)重于木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)、木聚糖酶生產(chǎn)菌株構(gòu)建、木聚糖酶應(yīng)用等方面的研究。KHANDEPARKER R等[3]通過分子改造構(gòu)建雙功能木聚糖酶，發(fā)現(xiàn)同時具備木聚糖酶和纖維素酶活性的木聚糖酶應(yīng)用前景巨大。SHEI J C等[4]從黑曲霉中分離出了一種內(nèi)切木聚糖酶，該酶對纖維素、羧甲基纖維素、幾丁質(zhì)等都有水解作用。木聚糖酶為誘導(dǎo)酶，除了受基因工程菌的構(gòu)建特性因素影響外，影響木聚糖酶發(fā)酵的因素通常有碳源、氮源、pH、溫度和通氣量等[5-6]，但是關(guān)于木聚糖酶規(guī)?；瘧?yīng)用方面的研究較少。此外木聚糖酶產(chǎn)生菌分泌的代謝酶，包括蛋白酶和糖苷轉(zhuǎn)移酶類，都會影響到木聚糖酶的產(chǎn)率，在確立木聚糖酶培養(yǎng)時間時必須要考慮到存在于培養(yǎng)基中的這些酶類的影響[7]。

為了解決木聚糖酶工業(yè)化生產(chǎn)中的實際問題，本研究采用碳氮源優(yōu)化后的培養(yǎng)基，著重研究大生產(chǎn)中接種量、pH值、培養(yǎng)溫度、溶氧、誘導(dǎo)時間、比生長速率等培養(yǎng)條件對菌體生長及木聚糖酶酶活的影響，以期為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

生產(chǎn)菌株[8]：重組大腸桿菌（Escherichia coli）：尤特爾生化有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖：河北健民淀粉糖業(yè)有限公司；乳糖、甘油：武漢萊恩化工有限責(zé)任公司；硫酸銨：中國石油化工股份有限公司巴陵分公司；磷酸二氫鉀：武漢無機鹽化工有限公司；氯化鈉：湖南省湘衡鹽化有限責(zé)任公司；蛋白胨：山東梁山蛋白胨生物制品有限公司；無水磷酸氫二鈉：云南昆陽磷肥廠有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 7.5，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、酵母浸膏10.0 g/L、NaCl 5.0g/L；聚丙二醇（polypropyleneglycol，PPG）-20000.01mL，pH 7.5，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖18.0 g/L、酵母浸膏3.0 g/L、檸檬酸3.0 g/L、硫酸銨3.5 g/L、PPG-2000 0.05 mL、MgSO4·7H2O 1 g/L、磷酸二氫鉀12.0 g/L、氯化鈣0.2 g/L和微量鹽貯液，pH值自然，121℃滅菌30 min。微量鹽貯液組成如下：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）8.4 mg/L，檸檬酸鐵100.0 mg/L，Zn（CH3COO）2·2H2O 13.0 mg/L，CoCl2·6H2O 2.5 mg/L，MnCl2·4H2O 15.0 mg/L，CuCl2·2H2O 1.5 mg/L，硼酸 3.0 mg/L，Na2MoO4·2H2O 2.5 mg/L。培養(yǎng)基滅菌條件為：115℃滅菌20 min。

補料培養(yǎng)基：甘油500.0 g/L、MgSO4·7H2O 10.0 g/L、氯化鈣1.0 g/L，pH值自然，121℃滅菌30 min。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基：甘油100.0g/L、MgSO4·7H2O2.0g/L、乳糖240.0 g/L、氯化鈣0.2g/L，pH值自然，121℃滅菌30min。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備；2 m3304不銹鋼種子罐、20 m3304不銹鋼發(fā)酵罐：岳陽龍輝檢修安裝有限公司；755S紫外可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司；Phs-3CP pH儀：上海雷磁儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)條件

小罐種子培養(yǎng)采用2 m3種子罐，初始培養(yǎng)基體積1 m3，接種搖瓶種子3 000 mL，接種時加入維生素B1和卡那霉素，培養(yǎng)溫度37℃，通氣量1.2 m3/min，罐壓0.03 MPa，待空氣量加足后開啟攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min培養(yǎng)8 h，將其作為種子液。

發(fā)酵采用20 m3發(fā)酵罐，初始培養(yǎng)基體積10 m3，調(diào)整好培養(yǎng)溫度后接種小罐種子，接種前通過小罐接種口加入維生素B1和卡那霉素，通入空氣，待空氣量加足后開啟攪拌，用20%氨水調(diào)節(jié)pH值。待還原糖降至0.3 g/100 mL，指數(shù)流加生長培養(yǎng)基。至一定OD600nm值時，指數(shù)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。至OD600nm值比最高時下降5～10個單位后停止發(fā)酵。

1.3.2 分析檢測

細(xì)胞密度的測定：取適量菌液，用分光光度計測定適當(dāng)稀釋至吸光度值0.2～0.4后，其波長在600 nm處的吸光度值（OD600nm）。

木聚糖酶酶活的定義：在50℃，pH 6.50中性條件下，每分鐘從質(zhì)量濃度為5 mg/mL的燕麥木聚糖溶液中降解釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個活力單位（IU/mL）。采用高效液相色譜法測定木糖含量，色譜條件如下：Aglient HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm）；檢測器：示差檢測器（refractiveindexdetector，RID）溫度控制在55℃；柱溫65℃；流動相5mmol/L硫酸溶液；流速：0.6mL/min；進樣量：10μL。

1.3.3 發(fā)酵條件優(yōu)化

接種量的確定：分別以3%、6%、8%、10%、12%的接種量接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)，通入空氣培養(yǎng)8 h，定時取樣測OD600nm值和酶活。

溶氧量的確定：發(fā)酵過程中，分別將溶氧控制在10%、15%、20%、25%、30%，37℃培養(yǎng)，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)52 h后測OD600nm值和酶活。

誘導(dǎo)時機的確定：分別在對數(shù)生長的前期、中期及后期指數(shù)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基（具體優(yōu)化方法見結(jié)果討論），37℃，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)52 h測OD600nm值和酶活。

pH值的確定：在OD600nm值至30時指數(shù)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)期分別將pH值控制在6.4、6.6、6.8、7.0，37 ℃培養(yǎng)，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)52 h后測OD600nm值和酶活。

比生長速率的確定：根據(jù)前期試驗摸索，生長期細(xì)胞比生長速率為0.12 h-1有利于菌體生長和產(chǎn)物積累，而誘導(dǎo)期的比生長速率需要進行優(yōu)化。誘導(dǎo)時設(shè)定不同的細(xì)胞比生長速率補料進行優(yōu)化，37℃培養(yǎng)，其他條件不變，發(fā)酵培養(yǎng)52h后測OD600nm值和酶活。

因發(fā)酵設(shè)備的限制，無法連續(xù)改變補料體積，故采用每1 h改變補料體積的階梯式的補料方式。設(shè)定比生長速率（μset），根據(jù)下列公式計算流加率：

式中：F為流加率，L/h；X（t0）為補料開始前細(xì)胞干質(zhì)量，g/L；V（t0）為補料開始前發(fā)酵液體積，L；SF為補料培養(yǎng)基葡萄糖的質(zhì)量濃度，g/L；m為保持系數(shù)0.025，（g·g/h）[9]；Yx/s為產(chǎn)出系數(shù)，即每克葡萄糖產(chǎn)生細(xì)胞干質(zhì)量，g/g。

每克葡萄糖產(chǎn)生細(xì)胞干質(zhì)量計算公式如下：

式中：ODb為補料開始前的發(fā)酵液的OD600nm值；OD0為發(fā)酵開始時的OD600nm值；0.54為1 OD600nm值相當(dāng)于1 L發(fā)酵液中含有的細(xì)胞干質(zhì)量為0.573 g；Vm為發(fā)酵合成培養(yǎng)基的初始體積，L；Vi為發(fā)酵種子液的體積，L；Vs為取樣體積，L；S為合成培養(yǎng)基中含有的葡萄糖的總量，g。

溫度優(yōu)化：在OD600nm值至30時指數(shù)流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)期分別將培養(yǎng)溫度控制在34℃、35℃、36℃、37℃、38℃，其他條件不變發(fā)酵培養(yǎng)52 h后測OD600nm和酶活。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均為3個平行實驗，所得數(shù)據(jù)為3個平行實驗平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

接種量的大小決定菌種在發(fā)酵罐中的生長速度。采用低接種量，會使菌種生長緩慢，發(fā)酵周期延長。接種量大，有利于對基質(zhì)的利用，縮短生長延滯期，并使生長菌迅速占領(lǐng)整個培養(yǎng)環(huán)境，但過度接種量會使菌體生長過快，影響后期的生長，在一定范圍內(nèi)增加接種量有利于菌體生長。不同接種量對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響結(jié)果見圖1。

圖1 不同的接種量對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.1 Effects of different inoculum on xylanase production by E.colifermentation

由圖1可知，除3%和6%的接種量外，其余接種量菌體濃度差距不大。接種量為10%時木聚糖酶酶活最高，3%接種量酶活最低?？紤]到在大規(guī)模發(fā)酵過程中，接種量過小菌體增值緩慢和接種量過大對菌體生長和酶轉(zhuǎn)化得率會產(chǎn)生一定抑制作用[10]，并出于種子罐和發(fā)酵罐消毒滅菌時操作方便及生產(chǎn)成本考慮，確定10%為最佳接種量。

2.2 溶氧對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

在微生物培養(yǎng)時，必須不斷地向培養(yǎng)液提供足夠的氧，以滿足微生物生長代謝的需要。由于微生物的新陳代謝與氧氣呼吸有關(guān)，調(diào)節(jié)通氣和攪拌可影響發(fā)酵周期時間的長短和代謝產(chǎn)物生成的高低。

大腸桿菌菌體在高密度培養(yǎng)時，耗氧劇增，發(fā)酵罐內(nèi)溶氧水平逐漸下降。當(dāng)培養(yǎng)液內(nèi)的溶解度降低到臨界濃度以下，此時再加大補料速度，將會導(dǎo)致菌體呼吸停止或厭氧發(fā)酵，并可能造成菌體自溶。在其他工藝參數(shù)不變的基礎(chǔ)上，考察不同水平的溶氧對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)52 h后測酶活，結(jié)果見圖2。

圖2 不同的溶氧量對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.2 Effects of different dissolved oxygen contents on xylanase production byE.colifermentation

由圖2可知，生產(chǎn)中溶氧＜20%時，菌體生長明顯受到抑制，酶活水平降低，溶氧＞25%酶活增長不顯著。在高密度發(fā)酵末期，發(fā)酵罐的溶氧成為限制菌體生長的制約因素[11-12]。受設(shè)備⒉件因素制約，發(fā)酵后期溶氧最大只能達到31%，未能繼續(xù)通過提高溶氧值來研究對發(fā)酵的影響。從生產(chǎn)成本上考慮，過度增加溶氧會增大生長能耗，提高了生產(chǎn)成本。因此，選用25%溶氧對發(fā)酵生產(chǎn)有利。

2.3 誘導(dǎo)時機對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

對于許多帶有誘導(dǎo)型啟動子的重組微生物，只有將生長期和產(chǎn)物形成期分開才能獲得最大生產(chǎn)率。在流加培養(yǎng)中，這兩段時期的分離可以通過延遲誘導(dǎo)直至細(xì)胞生長已達到高密度來實現(xiàn)。提早誘導(dǎo)造成菌體密度和中性木聚糖酶酶活降低，同時增加了染菌的機會，而誘導(dǎo)較晚，雖可能獲得高菌體密度，但細(xì)胞表達時間減少，導(dǎo)致木聚糖酶酶活降低。20m3發(fā)酵罐水平大腸桿菌生長曲線見圖3，不同誘導(dǎo)時機對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響見圖4。

圖3 20 m3發(fā)酵罐水平大腸桿菌生長曲線Fig.3 Growth curve ofE.coliin the 20 m3fermenter

由圖3可知，對數(shù)生長前期的OD600nm值為21，對數(shù)生長中期OD600nm值為30，對數(shù)生長后期OD600nm值為40，分別在上述3個生長期流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

圖4 不同的誘導(dǎo)時間對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.4 Effects of different induction period on xylanase production byE.colifermentation

由圖4可知，生長期時間越長，誘導(dǎo)期時間越短，雖然菌體密度越大，但酶活水平相對不高。生長期時間越短，誘導(dǎo)期時間越長，菌體密度相對較小，酶活水平也不高。因此，在對數(shù)生長中期（發(fā)酵至第13～15小時，OD600nm值=30）時流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基較好。

2.4 pH值對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

大腸桿菌生長的最適pH值為7.0～7.2，降低pH對控制較低的比生長速率有利，但會延長發(fā)酵周期。在發(fā)酵罐生長期pH控制在7.0，誘導(dǎo)期采用不同pH值進行培養(yǎng)，不同pH值對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 不同的誘導(dǎo)期pH對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.5 Effects of different pH value during induction period on xylanase production byE.colifermentation

由圖5可知，同周期條件下誘導(dǎo)期pH值越高，菌體濃度越高，但pH＞6.8后，盡管菌體濃度提高，酶活反而下降。pH值為7.0時，菌體生長速度快，但過快的生長導(dǎo)致質(zhì)粒丟失，從而影響酶活水平。pH值6.8時，有利于產(chǎn)物表達。采用pH梯度法，即生長期控制pH為7.0，誘導(dǎo)期pH為6.8，能較好地解決這一問題。

2.5 誘導(dǎo)期比生長速率對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

比生長速率是每小時單位體積的菌體所增加的菌體量，其對細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成均有重要作用。在發(fā)酵的補料分批發(fā)酵中使用指數(shù)流加補料培養(yǎng)策略被認(rèn)為是避免產(chǎn)生有毒代謝物和增加細(xì)胞密度的最有效的方法。在同周期條件下，每隔1 h取樣測定OD600nm值，計算菌體的比生長速率，考察在誘導(dǎo)期通過調(diào)整補料速度來控制不同比生長速率，進而影響發(fā)酵的酶活，結(jié)果見圖6。

圖6 不同的比生長速率對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.6 Effects of different specific growth rate on xylanase production byE.colifermentation

由圖6可知，比生長速率在0.14 h-1以下時，酶活隨比生長速率加快而增加，比生長速率在0.20 h-1以上時，酶活隨比生長速率加快導(dǎo)致質(zhì)粒被丟失而下降，比生長速率在0.30h-1以上時，菌體生長被抑制。本試驗采取指數(shù)補料流加策略進行高密度發(fā)酵，設(shè)定補料的比生長速率為0.14 h-1，低于產(chǎn)生乙酸的比生長速率，細(xì)胞密度呈指數(shù)的增長，能有效避免代謝副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)生。因此，發(fā)酵生產(chǎn)中將比生長速率控制在0.14～0.20h-1較為合適。有時細(xì)胞在低比生長速率下最終獲得重組蛋白的量反而要比高比生長速率的細(xì)胞高一些[13]。本研究的試驗結(jié)果也證明了上述觀點。

2.6 培養(yǎng)溫度對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響

大腸桿菌發(fā)酵最適生長溫度是37℃，但最適木聚糖酶生產(chǎn)溫度需要進一步優(yōu)化。在重組大腸桿菌的發(fā)酵過程中不同發(fā)酵階段采用不同溫度，在前期可將溫度調(diào)至最適菌體生長的溫度，到誘導(dǎo)階段將溫度調(diào)至最適木聚糖酶生產(chǎn)的溫度。本研究在生長期采用37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)期采用不同培養(yǎng)溫度，考察不同的培養(yǎng)溫度對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響，結(jié)果見圖7。

由圖7可知，誘導(dǎo)期溫度升高增加菌體密度，但超過35℃菌體密度增加不明顯，且酶活逐漸下降。一些大腸桿菌重組蛋白在溫和啟動子下的表達量高于強啟動子[14]，低溫誘導(dǎo)的表達量高于高溫誘導(dǎo)[15]就證實了這一觀點。培養(yǎng)溫度升高加快了菌體的生長速率，有可能導(dǎo)致質(zhì)粒被丟失。大腸桿菌生長速率降低，有利于工藝控制，同時乙酸及其它抑制性副產(chǎn)物的形成也隨之減少。生長期采用37℃培養(yǎng)，誘導(dǎo)期采用35℃培養(yǎng)，有利于中性木聚糖酶的表達。

圖7 不同的誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度對大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響Fig.7 Effects of different culture temperature during induction period on xylanase production byE.colifermentation

2.7 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

在單因素的基礎(chǔ)上，以木聚糖酶活為考察指標(biāo)，選擇對酶活影響較大的比生長速率、溶氧和pH，進行3因素3水平的正交試驗，其結(jié)果與分析見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 1 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

由表1可知，各因素對木聚糖酶活力的影響大小為溶氧＞比生長速率＞pH，最優(yōu)的發(fā)酵條件組成為A2B2C3。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為接種量為10%，發(fā)酵過程中溶氧值為30%，生長期控制pH值為7.0、生長期培養(yǎng)溫度為37℃、生長期比生長速率為0.12 h-1，誘導(dǎo)期pH值為6.8、誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度為35℃、誘導(dǎo)期比生長速率為0.14 h-1，在對數(shù)生長中期（OD600nm值=30）時流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。在此發(fā)酵條件進行優(yōu)化后，酶活力可達149 000 IU/mL。一般認(rèn)為菌體密度高于50 g/L即為高密度發(fā)酵，根據(jù)材料方法1.3.3的計算方法，獲得的菌體濃度可達65.90 g/L，達到高密度發(fā)酵水平。

3 結(jié)論

本試驗研究了大生產(chǎn)中接種量、pH值、培養(yǎng)溫度、溶氧、誘導(dǎo)時間、比生長速率等培養(yǎng)條件對菌體生長及木聚糖酶酶活的影響，并在此基礎(chǔ)上選擇比生長速率、溶氧和pH，進行了正交試驗。優(yōu)化后的發(fā)酵條件如下：接種量為10%，發(fā)酵過程中溶氧值為30%，生長期控制pH值為7.0、生長期培養(yǎng)溫度為37℃、生長期比生長速率為0.12 h-1，誘導(dǎo)期pH為6.8、誘導(dǎo)期培養(yǎng)溫度為35℃、誘導(dǎo)期比生長速率為0.14 h-1，在對數(shù)生長中期（OD600nm值=30）時流加誘導(dǎo)培養(yǎng)基。優(yōu)化后，放罐酶活力可達149 000 IU/mL。本研究為木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅實基礎(chǔ)。

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Optimization of high density fermentation conditions ofEscherichia colifor xylanase production

LIU Guofeng1,2
（1.Hunan Youtell Biochemical Co.,Ltd.,Yueyang 414000,China;2.Shandong Youtell Biochemical Co.,Ltd.,Zoucheng 273500,China）

The fermentation conditions,such as,inoculum,pH value,culture temperature,dissolved oxygen,induction time and specific growth rate in the production of xylanase industry were optimized by single factor experiments.On the basis of the single factor experiments,the specific growth rate,dissolved oxygen and pH were optimized by orthogonal experiments.The results showed that the optimum fermentation conditions were inoculum 10%,dissolved oxygen 30%during fermentation,growing period pH value 7.0,growing period culture temperature 37℃,growing period specific growth rate 0.12 h-1,induction period pH value 6.8,induction period culture temperature 35℃and induction period specific growth rate 0.14 h-1.The induction medium was added in the middle of logarithmic phase （OD600nm=30）.After optimization,the highest xylanase activity could be up to 149 000 IU/ml.The study improved the xylanase activity under the conditions of mass production,which provided guidance for the industrial production of xylanase.

Escherichia coli;xylanase;fermentation conditions;optimization

TS201.3

0254-5071（2017）12-0063-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.013

2017-08-20

科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新項目（14C26213701984）

劉國峰（1980-），男，工程師，碩士，研究方向為酶工程。