美發(fā)網(wǎng)菌子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)中甾醇類物質(zhì)含量測(cè)定方法研究

劉宇光，解 甜，唐 蘭，仲慧格，王淑敏

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

美發(fā)網(wǎng)菌子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)中甾醇類物質(zhì)含量測(cè)定方法研究

劉宇光，解 甜，唐 蘭，仲慧格，王淑敏*

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

建立利用高效液相色譜測(cè)定美發(fā)網(wǎng)菌子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇和豆甾醇含量的方法。麥角甾醇含量測(cè)定色譜條件：島津Inerlsil ODS-SP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以甲醇為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為281 nm；流速為1 mL·min-1；柱溫為28℃；進(jìn)樣量為10 μL。豆甾醇含量測(cè)定色譜條件：漢邦ODS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-水（96:4） 為流動(dòng)相；檢測(cè)波長為204 nm；流速為0.8 mL·min-1；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10 μL。麥角甾醇在進(jìn)樣量0.2004 μg～0.8016 μg范圍內(nèi)與吸收峰面積呈良好線性關(guān)系，回歸方程y=1E＋06x-9625.3，r=0.9999。豆甾醇在進(jìn)樣量0.0408 μg～0.3208 μg范圍內(nèi)與吸收峰面積呈良好線性關(guān)系，回歸方程y=4E＋06x-37149，r=0.9995。應(yīng)用高效液相色譜法建立的測(cè)定方法可以快速準(zhǔn)確地測(cè)定美發(fā)網(wǎng)菌子實(shí)體、原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇和豆甾醇的含量，可作為美發(fā)網(wǎng)菌質(zhì)量控制方法。

美發(fā)網(wǎng)菌；麥角甾醇；豆甾醇；高效液相色譜

美發(fā)網(wǎng)菌（Stemonitis splendens Rost）隸屬于發(fā)網(wǎng)菌科 （Stemonitidaceae） 發(fā)網(wǎng)菌屬 （Stemonitis）。因其個(gè)體微小、生命周期短，來源有限，目前僅在子實(shí)體化學(xué)成分分析方面有文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]。本研究旨在建立美發(fā)網(wǎng)菌子實(shí)體和發(fā)酵物原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇和豆甾醇的色譜檢測(cè)方法，并且首次對(duì)美發(fā)網(wǎng)菌目黏菌進(jìn)行麥角甾醇的含量測(cè)定。甾醇廣泛存在于真菌和黏菌內(nèi)[2-5]，研究發(fā)現(xiàn)甾醇類及其過氧化物具有顯著抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌以及降低膽固醇的生物活性[6-14]，所以本研究對(duì)美發(fā)網(wǎng)菌及其發(fā)酵產(chǎn)物中麥角甾醇和豆甾醇含量建立的高效液相色譜測(cè)定方法，不僅可以為美發(fā)網(wǎng)菌甾醇類成分質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，亦可為進(jìn)一步研究開發(fā)其醫(yī)藥價(jià)值提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

AUY220分析天平，島津國際貿(mào)易上海有限公司；KQ-500DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；島津LC-20AT高效液相色譜儀，島津國際貿(mào)易上海有限公司。麥角甾醇對(duì)照品，中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：MUST-11070601，純度＞98%；豆甾醇對(duì)照品，美國Sigma公司，批號(hào)：lot#BCBR7558V，純度約等于95%；甲醇、乙腈均為色譜純，美國Fisher公司；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 麥角甾醇含量測(cè)定試驗(yàn)方法

2.1.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Inerlsil ODS-SP C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為281 nm，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為 28℃，進(jìn)樣量為 10 μL[8]。理論塔板數(shù)按麥角甾醇峰計(jì)算不低于5 000，記錄色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖一致，見圖1～圖3。

圖1 麥角甾醇HPLC圖Fig.1 Chromatogram of ergosterol

圖2 子實(shí)體樣品麥角甾醇HPLC圖Fig.2 Chromatogram of ergosterol in fruiting body

圖3 原質(zhì)團(tuán)樣品麥角甾醇HPLC圖Fig.3 Chromatogram of ergosterol in plasmodia

2.1.2 麥角甾醇對(duì)照品溶液的制備

取麥角甾醇對(duì)照品適量，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇制成每1毫升約含0.05 mg的溶液。

2.1.3 麥角甾醇供試品溶液的制備

分別稱取美發(fā)網(wǎng)菌樣品約0.5 g（子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)），精密稱定，置具塞錐形瓶中，各加入20 mL甲醇，超聲處理30 min，濾過，回收溶劑，殘?jiān)? mL甲醇使其溶解，作為供試品溶液。

2.2 豆甾醇含量測(cè)定試驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（漢邦ODS C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈-水（96:4） 為流動(dòng)相，檢測(cè)波長為204 nm，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為 35℃，進(jìn)樣量為 10 μL[14-15]。理論塔板數(shù)按豆甾醇峰計(jì)算不低于3 000，記錄色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)譜圖一致，見圖4～圖6。

圖4 豆甾醇HPLC圖Fig.4 Chromatogram of stigmasterol

圖5 子實(shí)體樣品豆甾醇HPLC圖Fig.5 Chromatogram of stigmasterol in fruiting body

圖6 原質(zhì)團(tuán)樣品豆甾醇HPLC圖Fig.6 Chromatogram of stigmasterol in plasmodia

2.2.2 豆甾醇對(duì)照品溶液的制備

精密稱取豆甾醇對(duì)照品適量，加入無水乙醇制成每1毫升約含0.2 mg的溶液[16]。

2.2.3 豆甾醇供試品溶液的制備

分別取美發(fā)網(wǎng)菌子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)樣品約0.5 g，精密稱定，各加入氯仿20 mL，超聲處理20 min，濾過，回收溶劑，殘?jiān)蛹状? mL使其溶解，作為供試品溶液[15-16]。

3 結(jié)果

3.1 麥角甾醇含量測(cè)定結(jié)果

3.1.1 方法學(xué)考察

（1） 線性關(guān)系考察

分別取麥角甾醇對(duì)照品溶液 4 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL，注入高效液相色譜儀器，按照按照“2.1.1”項(xiàng)下條件測(cè)定吸收峰面積。以麥角甾醇質(zhì)量（μg） 為橫坐標(biāo)（x），吸收峰面積值（A）為縱坐標(biāo)（y），得線性回歸方程為：y=1E+06x-9625.3，r=0.9999，表明麥角甾醇進(jìn)樣量在0.2004 μg～0.8016 μg 范圍內(nèi)與吸收峰面積呈良好線性關(guān)系。

（2） 精密度考察

取麥角甾醇對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，每次進(jìn)樣10 μL，連續(xù)6次。結(jié)果麥角甾醇吸收峰面積值分別是660 783、660 091、660 647、660 579、660 433、661 070。RSD值為0.05%，表明儀器精密度良好。

（3） 重復(fù)性考察

精密稱取同一批子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)各6份，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)6次。結(jié)果子實(shí)體吸收峰面積值分別是643 582、636 670、644 524、649 923、647 534、648 492，RSD值為0.68%；原質(zhì)團(tuán)吸收峰面積值分別是636854、633 220、633 452、632 125、632 754、633 304，RSD值為0.24%。各樣品峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于3%，表明此方法重復(fù)性良好。

（4） 穩(wěn)定性考察

取子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)供試品溶液，分別于0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h注入高效液相色譜儀，按照“2.1.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。子實(shí)體吸收峰面積值分別是648 492、649 651、650 147、644 144、636 539、635 310，RSD值為0.94%；原質(zhì)團(tuán)吸收峰面積值分別是 635 010、634 864、638 027、636 961、633 859、636 184，RSD值為0.22%。各樣品峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于3%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

（5） 回收率考察

分別取已經(jīng)測(cè)知含量的子實(shí)體約0.2 g（約含有麥角甾醇0.17 mg）和原質(zhì)團(tuán)約0.2 g（約含有麥角甾醇0.25 mg），精密稱定，各加入質(zhì)量濃度為0.05 mg·mL-1的麥角甾醇對(duì)照品溶液4 mL，揮干溶劑，殘?jiān)凑铡?.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，計(jì)算麥角甾醇的加樣回收率。結(jié)果見表1、表2。

表2 原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇回收率試驗(yàn)（n=6）Tab.2 Recoveries of ergosterol in plasmodia（n=6）

從表1、表2可以看出，子實(shí)體中麥角甾醇平均回收率為99.51%，RSD值為3.71%。原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇平均回收率為98.28%，RSD值為1.86%。待測(cè)樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在限度范圍內(nèi)，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

3.1.2 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取3批子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)樣品，制備供試品溶液，色譜條件不變，測(cè)定吸收峰面積，計(jì)算樣品中麥角甾醇含量。結(jié)果見表3。

表3 子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇含量（n=3）Tab.3 Assay results of ergosterol in fruiting body and plasmodia（n=3）

從表3可以看出，子實(shí)體中麥角甾醇平均含量為0.8837 mg·g-1，RSD值為0.73%。原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇平均含量為1.2959 mg·g-1，RSD值為0.37%。不同待測(cè)物相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于3%，表明不同樣品中麥角甾醇的含量較穩(wěn)定且原質(zhì)團(tuán)中較高。

3.2 豆甾醇含量測(cè)定結(jié)果

3.2.1 方法學(xué)考察

（1） 線性關(guān)系考察

分別取豆甾醇對(duì)照品溶液 2 μL、6 μL、10 μL、14 μL、16 μL，注入高效液相色譜儀，按照“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，以測(cè)得吸收峰面積對(duì)應(yīng)豆甾醇質(zhì)量作圖，得回歸方程為y=4E+06x-37149，r=0.9995，結(jié)果表明豆甾醇進(jìn)樣量在0.0408 μg～0.3208 μg范圍內(nèi)與吸收峰面積呈良好線性關(guān)系。

（2） 精密度考察

取豆甾醇對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，每次進(jìn)樣10 μL，連續(xù)6次。結(jié)果豆甾醇吸收峰面積值分別是635 010、634 864、638 027、636 961、633 859、636 184。RSD值為0.08%，表明儀器精密度良好。

（3） 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)各6份，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)6次。結(jié)果表明子實(shí)體吸收峰面積值分別是675 629、666 810、662 037、678 064、664 538、657 862，RSD 值為1.17%；原質(zhì)團(tuán)吸收峰面積值分別是614 622、624 822、612 558、619 796、611 950、601 466，RSD值為0.29%。各樣品峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于3%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

（4） 穩(wěn)定性考察

取子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)供試品溶液，分別于0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h注入高效液相色譜儀，按照“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定。子實(shí)體吸收峰面積值分別是658 739、668 954、675 094、679 218、659 317、655 492，RSD值為1.46%；原質(zhì)團(tuán)吸收峰面積值分別為 675 900、669 994、667 954、664 530、678 230、685 253，RSD值為1.13%。各樣品峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于3%，結(jié)果表明樣品在24 h穩(wěn)定。

（5） 回收率考察

分別取6份已知含量的子實(shí)體約0.5 g（約含有豆甾醇0.0295 mg）和原質(zhì)團(tuán)約0.5 g（約含有豆甾醇0.0375 mg），精密稱定，各加入質(zhì)量濃度為0.0375 mg·mL-1的豆甾醇對(duì)照品溶液1 mL，揮干溶劑，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，殘?jiān)脽o水乙醇定容，依法測(cè)定，計(jì)算豆甾醇加樣回收率。結(jié)果見表4、表5。

表4 子實(shí)體中豆甾醇回收率實(shí)驗(yàn)（n=6）Tab.4 Recoveries of stigmasterol in fruiting body（n=6）

表5 原質(zhì)團(tuán)中豆甾醇回收率實(shí)驗(yàn)（n=6）Tab.5 Recoveries of stigmasterol in plasmodia（n=6）

從表4、表5可以看出，子實(shí)體中豆甾醇平均回收率為96.84%，RSD值為2.20%。原質(zhì)團(tuán)中豆甾醇平均回收率為96%，RSD值為2.97%。待測(cè)樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均在可接受范圍內(nèi)，表明該色譜方法測(cè)得值與參考值較接近。

3.2.2 樣品含量測(cè)定

分別精密稱取3批子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)樣品，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定樣品中豆甾醇含量。結(jié)果見表6。

表6 子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)中豆甾醇含量（n=3）Tab.6 Assay results of ergosterol in fruiting body and plasmodia（n=3）

從表6可以看出，子實(shí)體中豆甾醇平均含量為0.059 mg·g-1，RSD值為1.11%。原質(zhì)團(tuán)中豆甾醇平均含量為0.075 mg·g-1，RSD值為1.14%。不同待測(cè)物相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均不大于4%，表明不同樣品中豆甾醇的含量較穩(wěn)定且原質(zhì)團(tuán)中含量略高。

4 討論

采用高效液相色譜法對(duì)美發(fā)網(wǎng)菌麥角甾醇和豆甾醇的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示2種成分在子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)中的色譜條件一致，方法穩(wěn)定可靠。從整體結(jié)果可以得出如下結(jié)論：豆甾醇的提取溶劑分別為氯仿和氯仿-甲醇（1∶1），2種溶劑相比較，氯仿的提取效果最好；本研究是首次采用高效液相色譜法對(duì)美發(fā)網(wǎng)菌甾醇類成分進(jìn)行分析，子實(shí)體和原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇和豆甾醇的成分比較穩(wěn)定，提取方法和色譜條件重現(xiàn)性好、選擇性高，可以作為美發(fā)網(wǎng)菌甾醇類成分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；比較子實(shí)體與原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇和豆甾醇的含量，原質(zhì)團(tuán)中2種成分較高。推測(cè)在美發(fā)網(wǎng)菌生長發(fā)育過程中，原質(zhì)團(tuán)可能是分裂旺盛的營養(yǎng)體且麥角甾醇和豆甾醇均為結(jié)構(gòu)物質(zhì)；原質(zhì)團(tuán)中麥角甾醇和豆甾醇與子實(shí)體成分相同，含量略高。因此利用發(fā)酵產(chǎn)物可以代替野生資源，填補(bǔ)國內(nèi)黏菌生物學(xué)的研究空白，其豐富的醫(yī)藥價(jià)值值得深入探索。

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Study on Content Determination Method of Two Sterols in Stemonitis splendens Fruiting Body and Plasmodia

LIU Yu-guang,XIE Tian,TANG Lan,ZHONG Hui-ge,WANG Shu-min
(Changchun University of Traditional Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

An HPLC method were developed for determination of the content of ergosterol and stigmasterol in Stemonitis splendens Rost fruiting body and plasmodia.Chromatographic conditions of ergosterol content determination were that it was shimadzu inerlsil ODS-SP C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm),the mobile phase was methanol at a flow rate of 1.0 mL·min-1,detection wavelength was 281 nm,the column temperature was 28℃,and the injection volume was 10 μL.Chromatographic conditions of stigmasterol content determination were that it was Hanbang ODS C18 column(4.6 mm×250 mm,5 μm),the mobile phase was acetonitrile-water(96:4)at a flow rate of 0.8 mL·min-1,the detection wavelength was 204 nm,the column temperature was 35℃,and the injection volume was 10 μL.The results showed that ergosterol had good linear relationships in the range of 0.2004 μg～0.8016 μg with the linear equation(y=1E＋06x-9625.3,r=0.9999).Stigmasterol had good linear relationships in the range of 0.0408 μg～0.3208 μg with the linear equation(y=4E＋06x-37149,r=0.9995).The method of high performance liquid chromatography(HPLC)can be used to determine the content of ergosterol and stigmasterol in fruiting body and plasmodia,which can be used as a quality control method for S.splendens Rost.

Stemonitis splendens Rost;ergosterol;stigmasterol;HPLC

S646.9

A

1003-8310（2017）06-0072-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2017.06.016

劉宇光（1993-），女，在讀碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹兴幏治?。E-mail:1605860633＠qq.com

*通信作者：王淑敏（1965-），女，博士，教授，主要從事中藥分析和藥用微生物物質(zhì)基礎(chǔ)與藥效學(xué)研究。E-mail:446097156＠qq.com

2017-07-11