1株耐高溫酸性脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定與其酶學(xué)特性研究

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(重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶，401331)

1株耐高溫酸性脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定與其酶學(xué)特性研究

張?jiān)略?，汪燕，彭青春，羊秀美，馬振剛*

(重慶師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，重慶，401331)

以菜籽油為唯一碳源，經(jīng)過富集、馴化、平板分離初篩和復(fù)篩，從長期淤積油污的食堂下水道中篩選獲得1株脂肪酶產(chǎn)生菌CQNU 3-3。利用16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)與生理生化特征確定CQNU 3-3為代爾夫特菌，并將其命名為Delftiatsuruhatensisstrain CQNU 3-3。研究發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酶的影響發(fā)現(xiàn)，該菌株在初始pH為2的酸性條件下，發(fā)酵酶活力最高；發(fā)酵第1天酶活力即可達(dá)到最大，發(fā)酵溫度為32～37 ℃較為適宜。對其產(chǎn)生脂肪酶的酶學(xué)特性進(jìn)行分析，表明該酶最適反應(yīng)pH為7.0，最適反應(yīng)溫度為50 ℃，Cu2+、尿素、Mg2+和Na+對酶活力有顯著的抑制作用，而Zn2+和EDTA可以顯著提高酶活力。油脂降解率實(shí)驗(yàn)表明該菌株對樣品中油脂的降解率可高達(dá)73.54%。

脂肪酶產(chǎn)生菌；篩選鑒定；耐高溫酸性脂肪酶；酶學(xué)性質(zhì)；代爾夫特菌

隨著肉類、乳品等食品加工行業(yè)、油脂加工行業(yè)以及餐飲行業(yè)的發(fā)展，所排放的含油脂廢水不斷增加，這類含油脂廢水的成分往往較為復(fù)雜, 且富含有機(jī)物[1]，如果未經(jīng)處理就直接排放至環(huán)境中，對自然環(huán)境將產(chǎn)生極大的影響[2]。對含油脂廢水的高效處理，可以大大緩解其帶來的環(huán)境壓力[3]。目前，對含油脂廢水的主要處理方法包括化學(xué)法、物理法和生物法[4]。其中，生物處理法主要是微生物在馴化選擇過程中，利用油脂作為生長所需的能源和碳源，通過所產(chǎn)生的脂肪酶等降解酶系使廢水中的油脂水解為脂肪酸和甘油，最后分解氧化為H2O，CO2等[5]。由于生物處理法具備應(yīng)用范圍廣、簡便、能耗低、效果持久等特點(diǎn)，同時(shí)還具有避免化學(xué)處理法帶來的二次污染等優(yōu)點(diǎn)[6]，因此高產(chǎn)脂肪酶微生物的篩選越來越受到研究者的關(guān)注。

脂肪酶已被廣泛應(yīng)用于糧油食品加工、洗滌工業(yè)、生物柴油、有機(jī)合成、手性化合物合成、環(huán)境保護(hù)等方面[7-8]。其中，糧油食品加工、油脂廢水處理等諸多領(lǐng)域要求脂肪酶具備耐高溫、耐酸度的特點(diǎn)，這使得很多工業(yè)用脂肪酶在應(yīng)用過程中失活，從而使得其應(yīng)用受限。目前，國內(nèi)對脂肪酶產(chǎn)生菌的研究主要集中在高產(chǎn)、耐堿性和耐高溫菌株的分離鑒定，而工業(yè)酸性脂肪酶的來源主要還是進(jìn)口，因此，篩選耐高溫酸性脂肪酶產(chǎn)生菌，并對其發(fā)酵及酶學(xué)特性進(jìn)行分析，可為工業(yè)化生產(chǎn)耐高溫酸性脂肪酶奠定基礎(chǔ)[9]。至今，脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選樣本主要來源于長期淤積油脂的下水道[10]、長期受油脂污染的土壤[11]、生活用水排污口[12]、含油污泥的堆肥[13]等。本研究利用分子生物學(xué)鑒別法結(jié)合常見細(xì)菌鑒定法鑒定了1株從長期淤積油污的食堂下水道分離獲得的菜籽油降解細(xì)菌CQNU 3-3；通過馴化與多次傳代后，對該菌株的產(chǎn)酶發(fā)酵條件、酶的最適反應(yīng)條件和對油脂的降解率進(jìn)行了研究，這為其進(jìn)一步的開發(fā)利用研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

含油脂廢水樣品取自重慶師范大學(xué)(大學(xué)城校區(qū))學(xué)生第二食堂下水道，分3點(diǎn)取樣，每點(diǎn)50 mL。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)富集培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨 5.0 g，酵母粉2.5 g,葡萄糖10 g，菜籽油2.5 g，Tween-80 3.0 g，加蒸餾水定容至500 mL,121 ℃高溫滅菌20 min。

(2)馴化培養(yǎng)基(g/L)：K2HPO40.5 g，KH2PO40.5 g，NaHPO40.5 g，NaCl 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，菜籽油2.5 g，pH自然，加蒸餾水定容至500 mL,121 ℃高溫滅菌20 min。

(3)選擇性平板培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO40.25 g，K2HPO40.15 g，NaCl 0.25 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，酵母粉0.25 g，瓊脂 10.0 g，吐溫-80 6.0 g，菜籽油5.0 g，pH 7.0，加蒸餾水定容至500 mL, 121 ℃高溫滅菌20 min，制備成平板。

(4)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：(NH4)2SO41.0 g，K2HPO41.0 g，NaH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，NaCl 1.0 g，菜籽油 5.0 g，pH 7.0，加蒸餾水定容至500 mL, 121 ℃高溫滅菌30 min，備用。

(5) LB培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g，酵母粉0.5 g，NaCl 1.0 g，蒸餾水100 mL，121 ℃高溫滅菌30 min，備用。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

95%酒精，1%酚酞，0.05 mol/L NaOH，0.05%石油醚，菜籽油，4%聚乙烯醇。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理

采集獲得的含油脂廢水，加入適量無菌水，搖勻，3層紗布過濾收集，備用。

1.2.2 菌種的富集培養(yǎng)

取25 mL過濾樣品，接種于含150 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，置于30 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)72 h。

1.2.3 馴化培養(yǎng)

取25 mL富集培養(yǎng)后的菌液，接種于含150 mL含菜籽油5.0 g/L馴化培養(yǎng)基的三角瓶中，置于37 ℃，150 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)。4 天為1個(gè)周期，馴化培養(yǎng)28天，每個(gè)周期結(jié)束后將馴化菌液接種至含油量遞加5.0 g/L的馴化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4 篩選平板初篩

主要采用吐溫-80篩選法：取1 mL馴化培養(yǎng)后的菌液，加入9 mL滅菌蒸餾水中，混勻；隨后吸取0.1 mL涂布于選擇性平板培養(yǎng)基(含吐溫-80)上，置于37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落的生長情況及降解圈的大小。

1.2.5 篩選平板復(fù)篩

從初篩的選擇性平板基中選取抑菌圈直徑與菌落比較大的菌株進(jìn)行多次重復(fù)劃線分離，置于37 ℃培養(yǎng)72 h直至得到純菌株。挑取純化的菌株至LB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，150 r/min搖床中至搖勻渾濁，存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 菌株的形態(tài)學(xué)與生理生化特征分析

取CQNU 3-3菌種在LB固體培養(yǎng)基上劃線，隨后將平板放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，待菌落長出后觀察菌落特征，包括形狀、大小、顏色、光澤、表面狀況、質(zhì)地以及是否分泌色素等特征。生理生化特征分析主要參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊進(jìn)行。

1.2.7 菌株的16S rDNA序列分析

對所挑選的菌株進(jìn)行菌落以及細(xì)胞形態(tài)觀察后，擴(kuò)大培養(yǎng)，以16S rDNA通用引物進(jìn)行菌液PCR，PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性40 s，55.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，PCR循環(huán)數(shù)：32次，72 ℃溫育 10 min，4℃保存。切膠回收16SrDNA片段，并送至公司測序。獲取序列后，使用NCBI的在線BLAST工具對其進(jìn)行同源序列比對，并利用MEGA6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.8 脂肪酶產(chǎn)生菌產(chǎn)酶活性檢測與分析

1.2.8.1 脂肪酶產(chǎn)生菌的初步發(fā)酵

取2 mL的 LB培養(yǎng)基菌液接至100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于37 ℃，150 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h。然后使用離心機(jī)3 000 r/min 離心10 min，取上清液測定脂肪酶活力，即可以獲得脂肪酶產(chǎn)生菌CQNU 3-3初步發(fā)酵后發(fā)酵液中的酶活力。

1.2.8.2 脂肪酶產(chǎn)生菌的堿滴定法測定酶活

(1)取4個(gè)100 mL錐形瓶，進(jìn)行空白對照和平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。分別加入底物溶液4 mL和NaHPO4-KH2PO4緩沖液5 mL，再向空白對照瓶中加入95%乙醇15 mL，于40 ℃水浴鍋中預(yù)熱5 min，然后實(shí)驗(yàn)組中各加入1 mL上清酶液，空白對照瓶中加入1 mL蒸餾水，立即混勻計(jì)時(shí)。40 ℃水浴15 min后，向?qū)嶒?yàn)組中補(bǔ)加15 mL酒精終止反應(yīng)，取出。

(2)向4個(gè)錐形瓶中分別加入2～3滴酚酞，用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，直至呈現(xiàn)微紅色，并保持30 s不褪色，即為滴定終點(diǎn)，紀(jì)錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積[14]。

(3)酶活力按公式(1)計(jì)算：

(1)

式中：Y，樣品的酶活力，U/mL；V1，滴定樣品時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；V2，滴定空白時(shí)消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；c，NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；50，0.05 mol/L NaOH溶液1 mL相當(dāng)于脂肪酸50 U/mol；n，樣品的稀釋倍數(shù)；0.05，NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度換算系數(shù)；15，反應(yīng)時(shí)間15 min，以1 min計(jì)算。

(4)每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下計(jì)算獲得3組平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用SPSS11.0軟件對不同實(shí)驗(yàn)條件下所獲取的數(shù)據(jù)進(jìn)行T檢測，分析數(shù)據(jù)差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.8.3 油脂降解率的測定

根據(jù)菜籽油對光的吸收特性，采用722S可見分光光度計(jì)測定樣品在355 nm波長下的吸光度值，同時(shí)以菜籽油為溶質(zhì)，石油醚為溶劑，測定不同菜籽油質(zhì)量濃度的吸光度值。以0.01 g/mL菜籽油的石油醚溶液，分別取0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 mL，加石油醚至標(biāo)線，混勻，以零濃度為對照，在355 nm波長下測量吸光值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：Y=1.093 3x+0.002 0，R2=0.981 2。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算菌株的油脂降解率[15]。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂肪酶產(chǎn)生菌的分離與篩選

收集到的含油脂廢水樣品按方法所述進(jìn)行稀釋，涂布到選擇性平板培養(yǎng)基的平板上，37 ℃培養(yǎng)72 h，以菜籽油為唯一碳源進(jìn)行培養(yǎng)與篩選，結(jié)果如圖1A所示，共分離獲得6株不同的脂肪酶產(chǎn)生菌，其中菌株CQNU 3-3的乳白色圈和直徑比最大，達(dá)到6∶1。將其在含有吐溫-80的選擇性培養(yǎng)基上反復(fù)篩選純化，見圖1B。觀察其菌落較小，中間突起，邊緣不規(guī)則，表面光滑，不分泌色素。

圖1 脂肪酶產(chǎn)生菌的初篩(A)與CQNU 3-3菌株的純化(B)Fig.1 Screening of and re-screening of lipid degrading strains (A) and purification of CQNU 3-3 strain

2.2 CQNU3-3菌株的鑒定

2.2.1 生理生化鑒定

對CQNU3-3菌株進(jìn)行淀粉水解、葡萄糖發(fā)酵等生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。生理生化實(shí)驗(yàn)分析表明，CQNU 3-3菌株為革蘭氏陰性菌，菌體為稍彎曲的短桿狀，不能利用葡萄糖、蔗糖，不水解淀粉，七葉苷實(shí)驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V-P實(shí)驗(yàn))和甲基紅(M.R)反應(yīng)呈陰性，接觸酶實(shí)驗(yàn)、尿素分解實(shí)驗(yàn)、油脂水解實(shí)驗(yàn)反應(yīng)呈陽性。各項(xiàng)生理生化指標(biāo)結(jié)果與代夫特菌屬的代表種一致。

表1 CQNU3-3菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of CQNU 3-3 strain

“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.2.2 16S rDNA序列鑒定

采用細(xì)菌16S rDNA基因的PCR通用引物進(jìn)行CQNU3-3菌株的16S rDNA基因的擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示獲得單一的DNA條帶，分子量約為1.6 kb，結(jié)果如圖2A所示。

將獲取的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得1條1 497 bp的16S rDNA序列。使用NCBI在線BLAST工具進(jìn)行基因的多重序列比對分析。結(jié)果表明，CQNU 3-3菌株的16S rDNA序列與Delftiatsuruhatensisstrain Cl-23的16S rDNA序列同源性最高，達(dá)到99%。系統(tǒng)發(fā)育分析所需的基因序列從Genbank中下載獲得，使用Cluster X軟件對序列進(jìn)行多重序列比對，使用MEGA6軟件中的Neighbor-Joining法對序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，采用Bootstrap方法1000 個(gè)重復(fù)進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)(見圖2B)。結(jié)果表明，CQNU 3-3菌株與Delftiatsuruhatensisstrain Cl-23進(jìn)化關(guān)系最近。

A-16S rDNA的PCR擴(kuò)增；B-16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析圖2 CQNU3-3菌株的16S rDNA序列分析Fig.2 Sequence analysis of 16S rDNA of CQNU 3-3 strain

綜上分析表明，CQNU 3-3的菌落形態(tài)、生理生化特性與代爾夫特菌屬一致，16S rDNA基因序列與Delftiatsuruhatensis的同源性達(dá)到99%，系統(tǒng)發(fā)育分析表明其與Delftiatsuruhatensis的進(jìn)化關(guān)系最近。因此，確定CQNU 3-3菌株為代爾夫特菌(Delftiatsuruhatensis)，命名為Delftiatsuruhatensisstrain CQNU 3-3。目前，已報(bào)道的產(chǎn)脂肪酶微生物約來自于65個(gè)屬[16]，但尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于Delftiatsuruhatensis菌降解菜籽油的報(bào)道。代爾夫特菌屬(Delftia)是新建立的一個(gè)菌屬，屬于變形菌β亞綱、從毛單胞菌科[17]。目前已經(jīng)發(fā)表的種包括食酸代夫特菌、湖生代夫特菌和Delftiatsuruhatensis。其中食酸代夫特菌研究于臨床，為人類少見的機(jī)會致病菌[18]。

2.3 發(fā)酵條件對CQNU3-3菌株產(chǎn)酶活力的測定

2.3.1 發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)酶活力的影響

配制發(fā)酵培養(yǎng)基，置于37 ℃，150 r/min的恒溫?fù)u床上分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d。獲得的粗酶液在pH 7.0的磷酸緩沖液，40 ℃的水浴鍋中反應(yīng)，測定不同發(fā)酵天數(shù)對脂肪酶活力的影響，見圖3A。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵在第1～3天時(shí)，酶活力較好；發(fā)酵第3天以后酶活力急劇下降。因此，CQNU 3-3菌株的發(fā)酵時(shí)間應(yīng)控制在3天以內(nèi)。

2.3.2 發(fā)酵pH對產(chǎn)酶活力的影響

調(diào)節(jié)不同初始pH值的發(fā)酵培養(yǎng)基，置于37 ℃，150 r/min的恒溫?fù)u床上培養(yǎng)24 h。獲得的粗酶液在磷酸緩沖液pH=7.0，40 ℃的水浴條件下進(jìn)行酶活測定，分析不同發(fā)酵pH值對酶活力的影響，見圖3B。當(dāng)初始發(fā)酵培養(yǎng)基的pH為2時(shí)，產(chǎn)酶活力最高；當(dāng)pH=11時(shí)，酶活力最低。因此，CQNU 3-3菌株表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐酸性，其對極堿性條件的耐受能力較弱。其耐酸性水平，與經(jīng)誘變選育后的酸性脂肪酶產(chǎn)生菌相當(dāng)[9]，這表明CQNU 3-3菌株可作為誘變育種的良好素材，其具有一定的應(yīng)用開發(fā)潛力。

2.3.3 發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶活力的影響

分別在不同溫度的搖床上發(fā)酵培養(yǎng)24 h，粗酶液在磷酸緩沖液pH=7.0，40 ℃的水浴條件下反應(yīng)， 測定不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)酶活力的影響，如圖3C所示。結(jié)果表明，發(fā)酵溫度為32～37 ℃時(shí)，酶活力都較好；發(fā)酵溫度高于42 ℃時(shí)酶活力下降顯著。

圖3 發(fā)酵條件對CQNU3-3菌株產(chǎn)酶活力的影響Fig.3 Effects of fermentation conditions on enzyme activity of CQNU3-3 strain

2.4 反應(yīng)條件對CQNU3-3菌株的脂肪酶活力的影響

2.4.1 溫度對酶活力的影響

取發(fā)酵培養(yǎng)24 h后離心收集的上清液作為粗酶液，保持pH=7.0的反應(yīng)pH， 調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度， 測定不同溫度對脂肪酶活力的影響，如圖4A所示。該酶最適反應(yīng)溫度為50～60 ℃，且在溫度高達(dá)70 ℃時(shí)，仍保留約55%的脂肪酶活力。而前人報(bào)道的脂肪酶產(chǎn)生菌的最適反應(yīng)溫度主要在28～45 ℃[19-20]，這表明該酶具有較寬的溫度適用性。

2.4.2 pH對酶活力的影響

取發(fā)酵培養(yǎng)24 h后離心收集的上清液作為粗酶液，調(diào)節(jié)不同的磷酸緩沖液的pH值，在40 ℃的水浴條件下反應(yīng)，測定不同pH對脂肪酶活力的影響，見圖4B。該脂肪酶的最適反應(yīng)pH為7.0；另外，該酶在酸性條件pH=6.0時(shí)仍能保持66%左右的酶活力；而在pH達(dá)到8.5的堿性條件下，也保留了約60%的酶活力，這表明該脂肪酶在較酸和較堿條件下，均具有較好的反應(yīng)活性。

2.4.3 離子與添加物對酶活力的影響

取發(fā)酵培養(yǎng)24 h后離心收集的上清液作為粗酶液，在40 ℃下反應(yīng)，分別配制含有各種離子的反應(yīng)緩沖液，測定不同pH對脂肪酶活力的影響，見圖4C。Zn2+、EDTA對酶活力有顯著的促進(jìn)作用，而Mg2+、Cu2+、尿素、Na+對酶活力有顯著地抑制作用。K+和Ca2+對酶活力沒有顯著的影響。該菌株對EDTA的耐受性，暗示其在食品加工業(yè)及洗滌工業(yè)廢水處理過程中有良好的應(yīng)用前景。

圖4 反應(yīng)條件對CQNU3-3菌株脂肪酶活力的影響Fig.4 Effects of reaction conditions on lipase activity of CQNU3-3 strain

2.5 油脂降解率分析

將篩選到的菌株接種到選擇培養(yǎng)液中，置于37 ℃，150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)6 d。測定含油量，根據(jù)菜籽油標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算油脂降解率，結(jié)果表明該菌株對樣品中油脂的降解率達(dá)到73.54%。

3 結(jié)論

本研究通過對長期淤積油脂的食堂下水道內(nèi)廢水中的微生物進(jìn)行富集、馴化、分離培養(yǎng)，篩選得到1株耐高溫酸性脂肪酶產(chǎn)生菌株CQNU 3-3，通過對其進(jìn)行菌落形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性以及16S rDNA序列分析，鑒定其為代爾夫特菌屬(Delftia)的Delftiatsuruhatensis。研究結(jié)果顯示，菌株CQNU 3-3發(fā)酵時(shí)間在1～3 d時(shí)酶活力最佳，到第3天后酶活力急劇下降；發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH為2時(shí)酶活力最高，而當(dāng)pH為11時(shí)幾乎沒有酶活力；發(fā)酵初始最適溫度可以控制在32～37 ℃，這表明菌株能夠在較低溫度與酸性條件下發(fā)酵產(chǎn)酶；菌株CQNU 3-3分泌的脂肪酶酶活力最適pH=7.0，同時(shí)在酸性和堿性條件下均能保留60%左右的酶活力；酶反應(yīng)最適溫度為50～60 ℃，表明該酶能夠在較酸和較堿性，以及較高溫度下保持較高酶活力，篩選獲得1株性狀優(yōu)良、適合糧油食品加工、洗滌工業(yè)污水處理和醫(yī)藥生產(chǎn)等行業(yè)需求的耐高溫酸性脂肪酶產(chǎn)生菌株具有一定的應(yīng)用價(jià)值。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)在搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min，37 ℃下培養(yǎng)6 d，該菌的油脂降解率達(dá)73.54%。經(jīng)10次傳代后，菌株的油脂降解能力穩(wěn)定存在，這暗示其具有應(yīng)用于環(huán)境與食品工業(yè)等領(lǐng)域的潛力，可為生物法處理含油脂廢水，食品加工工藝等提供有用的菌株資源。

[1] 閆亞娟,秦廣雍,李宗義,等.油脂廢水的生物處理研究進(jìn)展[J].環(huán)境科學(xué)與技術(shù),2007,30(10):86-89.

[2] 劉婕,楊博.一株高效油脂降解菌的分離鑒定及其性能研究[J].中國油脂,2010,35(1):41-44.

[3] MA J,YAN G,MA W,et al. Isolation and characterization of oil-degrading microorganisms for bench-scale evaluations of autochthonous bioaugmentation for soil remediation[J].Water,Air,& Soil Pollution,2015,226(8):272.

[4] LOPERENA L,Ferrari M D,DIAZ A L, et al. Isolation and selection of native microorganisms for the aerobic treatment of simulated dairy waste waters[J]. Bioresource Technology,2009,100(5):1 762-1 766.

[5] 吳蘭,葛剛,羅玉萍.油脂廢水的生物處理研究進(jìn)展[J].江西科學(xué),2003,21(4):317-320.

[6] BAYAT Z,HASSANSHAHIAN M,HESNI MA. Study the symbiotic crude oil-degrading bacteria in the mussel Mactra stultorum collected from the Persian Gulf[J]. Marine Pollution Bulletin,2016,105(1):120.

[7] 王自社,張繼,馬君義,等.脂肪酶的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(7):3 798-3 800.

[8] JAEGER K E,EGGER T. Lipases for biotechnology[J]. Current Opinion in Biotechnology,2002,13(4):390-397.

[9] 張開平.耐高溫酸性脂肪酶產(chǎn)生菌的選育及其酶學(xué)特性研究[D].鄭州：河南工業(yè)大學(xué), 2013.

[10] 張印,薛永常.油脂降解菌種的鑒定及降解條件優(yōu)化[J].微生物學(xué)雜志,2015(2):90-94.

[11] 肖翰,劉標(biāo),尹紅梅,等.病死豬堆肥高效油脂降解菌的篩選及堆肥效果研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2017,29(1):44-50.

[12] 韓雪,童攀.一株產(chǎn)脂肪酶蠟狀芽孢桿菌的分離鑒定[J].江漢大學(xué)學(xué)報(bào):社會科學(xué)版, 2017, 45(1):68-71.

[13] ONYEDIKACHI U, HARRISON A, MAPITSI T, et al. Characterisation of oil degrading bacteria from tailored compost containing crude oil sludge[J]. Indian Journal of Biotechnology,2016, 15(2):243-245.

[14] 楊華, 婁永江. 國產(chǎn)堿性脂肪酶的測定方法及特性研究[J].中國食品學(xué)報(bào), 2006, 6(3):138-142.

[15] 沈叔平,汪小梅.廢水中動植物油脂的紫外分光光度測定法[J].中國環(huán)境監(jiān)測, 1994, 10(3):4-7.

[16] 熊杰,王仿,程模香,等.幾株脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及生長特性的研究[J].中國釀造,2009, 28(4):65-67.

[17] SHIGEMATSU T,YUMIHARA K,UEDA Y,et al.Delftiatsuruhatensissp. nov. a terephthalate-assimilating bacterium isolated from activated sludge[J].International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology,2003,53(5):1 479-1 483.

[18] 李金鐘,劉利平.代夫特菌屬的研究進(jìn)展[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2008,8(12):2 254-2 255.

[19] 雷健美,蘭時(shí)樂,曹杏芝,等.1株耐熱脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選及產(chǎn)酶條件研究[J].中國食品學(xué)報(bào),2012,12(3):61-68.

[20] 韓生義,趙淑琴,劉曉麗,等.一株堿性脂肪酶產(chǎn)生菌的篩選、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017, 52(1):119-125.

Screening,identificationandcharacterizationsofathermostableacidlipasestrain

ZHANG Yue-yue,WANG Yan,PENG Qing-chun,YANG Xiu-mei,MA Zhen-gang*

(College of Life Sciences, Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China)

Using rapeseed oil as the only carbon source, a thermostable acid lipase strain CQNU 3-3 was isolated from the sewage of the school dining hall through enrichment, domestication, screening and re-screening. The analysis of morphology, physiological and biochemical characteristics, the phylogeny of 16S rDNA sequence indicated that the strain CQNU 3-3 was as a member ofDelftiatsuruhatensisand namedDelftiatsuruhatensisstrain CQNU 3-3. The analysis on the effects of fermentation conditions to the production of enzyme showed that the enzyme activity was the highest at the initial pH 2, the suitable fermentation temperature was 32-37 ℃. The study on enzymatic properties of lipase showed that the optimum reaction pH was 7.0, the reaction temperature was 50 ℃. Zn2+and EDTA could significantly increase the enzyme activity and Cu2+, Mg2+, Na+and urea could significantly decrease the enzyme activity. Additionally, the degradation rate of the added oil in the sample was high to 73.54%.

lipase-producing bacterium; screening and identification; thermostable acid lipase; enzyme characterization;Delftiatsuruhatensis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014944

碩士研究生(馬振剛副教授為通訊作者,E-mail：mzgcqnu@126.com)。

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ1500325)

2017-06-12，改回日期：2017-06-25