偽制紅薯粉條中非法添加3種合成色素的檢測方法

符春花，吳澤君，林芳，劉水平，包敏，劉芳

(株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲，412000)

偽制紅薯粉條中非法添加3種合成色素的檢測方法

符春花*，吳澤君，林芳，劉水平，包敏，劉芳

(株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲，412000)

建立了二極管陣列高效液相色譜法(HPLC-DAD)及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定偽制紅薯粉條中非法添加人工合成色素檸檬黃、日落黃、亮藍的檢測方法。樣品經(jīng)粉碎后加0.25 mL氨水(氨水和水體積比為1∶1)、50 mL水渦旋2 min，超聲20 min，加水定容后進行檢測。結(jié)果表明：3種合成色素在添加濃度范圍均有良好的線性關系，HPLC-DAD的相關系數(shù)(R2)為0.999 2～0.999 3，HPLC-MS/MS的相關系數(shù)(R2)為0.996 1～0.997 9，HPLC-DAD和HPLC-MS/MS的檢出低限分別為0.08～0.3 mg/kg和0.02～0.05 mg/kg，在低、中、高3個水平進行加標回收實驗，HPLC-DAD 和HPLC-MS/MS 回收率分別為83.5%～89.9%和84.2%～92.5%，相對標準偏差分別為0.62%～4.10%和0.96%～4.92%。方法準確、靈敏度高、回收率高，適用于偽制紅薯粉條中非法添加合成色素的檢測。

人工合成色素；偽制紅薯粉條；二極管陣列高效液相色譜法(HPLC-DAD)；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)

色素作為食品添加劑可分為天然色素和合成色素兩種，天然色素是從天然的動植物、微生物中提取得到，色澤自然，但生產(chǎn)成本高，穩(wěn)定性差，在加工和儲存過程中易褪色和變色。合成色素人工化學合成方法制得的有機色素，色彩鮮艷，性質(zhì)穩(wěn)定，著色力強，價格低廉，更能增強食品外觀美感，提升人們的購買欲和食欲，已廣泛應用于食品工業(yè)[1]。為降低生產(chǎn)成本，改善感官性能，一些不法商販采用廉價的淀粉添加各種合成色素偽制成紅薯粉條牟取暴利。過量的合成色素在人體內(nèi)積聚，引發(fā)人體的毒性包括致癌、致畸，影響機體的正常生長發(fā)育[2-3]。GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》規(guī)定紅薯粉條不得添加合成色素。

目前，合成色素的檢測方法有薄層色譜法[4]、極譜法[5]、分光光度法[6]、毛細管電泳法[7]、高效液相色譜法[8-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-16]，應用較多的是高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。高效液相色譜法檢測成本較低，同時靈敏度也較低，定性準確性較差，一般用于樣品的初篩工作。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測靈敏度高，定性準確性強，但是設備較貴，適用于陽性樣品的確證。本實驗選擇日落黃、檸檬黃和亮藍3個合成色素作為檢測指標，采用添加0.25 mL氨水(氨水和水體積比為1∶1)的水溶液渦旋、超聲提取的方法制備樣品溶液，簡化了前處理條件，建立了HPLC-DAD和HPLC-MS/MS測定紅薯粉中3種合成色素的檢驗方法，達到理想的回收水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

一級水(自制，電阻率值為18.2 MΩ·cm)、氨水(色譜純)，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(色譜純)，德國MERCK公司；乙酸銨(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

檸檬黃(批號：51004-201401，含量：91.0%)，中國食品藥品檢定研究院；日落黃(批號：51005-201401，含量：89.0%)，中國食品藥品檢定研究院；亮藍(批號：C10665200，含量：93.4%)德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司。

空白粉樣，自制；其余紅薯粉樣均為市售。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀(配有G1315D二極管陣列檢測器)，美國Agilent 公司；1200LC/6410A MS 高效液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(配有電噴霧離子源(ESI))，美國Agilent 公司；TGL16M型高速冷凍離心機，長沙湘麓儀器廠；MS-205DU電子分析天平(感量為0.1 mg和0.01 mg),瑞士梅特勒托利多公司；上海雷磁 PHSJ-3F酸度計，上海精密科學儀器有限公司；XW-80A 漩渦振蕩器，寧波新芝生物科技有限公司；KH3200B型超聲波清洗機，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 儀器工作條件

HPLC-DAD：色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；柱溫30 ℃；進樣體積10 μL；流動相A甲醇；流動相B0.02 mol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫條件：t=0 min，5% A，95% B；t=4 min時，5% A，95% B；t=7 min時，20% A，80% B；t=22 min時，55% A，45% B；t=24 min時，55% A，45% B；t=26 min時，90% A，10% B；t=32 min時，5% A，95% B；t=38 min時，5% A，95% B；二極管陣列檢測器檢測波長：0～15 min選擇425 nm；15～22 min選擇485 nm；22～38 min選擇630 nm；流速：1.0 mL/min； DAD檢測器波長掃描范圍：190～700 nm。

HPLC-MS/MS：色譜柱為XtimateTMC18(4.6 mm×150 mm,5 μm)；柱溫30 ℃；進樣體積5 μL；流動相A甲醇；流動相B0.01 mol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫條件：t=0 min，40% A，60% B；t=6 min時，40% A，60% B；t=6.1 min時，60% A，40% B；t=11 min時，60% A，40% B；t=11.5 min時，40% A，60% B；流速：0.4 mL/min；t=15 min時，40% A，60% B；流速：0.4 mL/min；離子源：電噴霧ESI離子源；電離模式：正離子電離模式，多反應監(jiān)測模式(MRM)；毛細管電壓：+4 kV；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速為9 L/min；駐留時間：500 ms。每種標準品優(yōu)化后的碰撞能量、源內(nèi)碎裂電壓、定性離子、定量離子等參數(shù)見表1。

表1 優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 The parameters optimized of fragmentation energy, collision energy, qualitative pair ion and quantitative ion pair for analytes

注：*為定量離子。

1.3.2 標準貯備液和工作溶液的制備

分別準確稱取10.0 mg(精確至0.01 mg)檸檬黃、日落黃、亮藍標準品于20 mL容量瓶，加水溶解稀釋，制得的500 μg/mL檸檬黃、日落黃和亮藍標準儲備溶液于4 ℃存儲。精密量取500 μg/mL檸檬黃、日落黃和亮藍標準儲備溶液各5 mL，置同一25 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，得到濃度分別為100 μg/mL的混合標準溶液，于4 ℃存儲。HPLC-DAD檢測用混合標準溶液：根據(jù)需要配制成0.1、0.2、0.5、2、10、50、100 μg/mL的系列混合標準溶液，于4 ℃存儲；HPLC-MS/MS檢測用混合標準溶液：根據(jù)需要配制成5、10、20、30、40、50、100 ng/mL的系列混合標準溶液，于4 ℃條件下存儲。

1.3.3 樣品處理

樣品經(jīng)粉碎后稱10 g于比色管中，加入0.25 mL氨水(氨水和水體積比為1∶1)，加水50 mL，渦旋2 min，超聲20 min，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，取5 mL于離心管中，10 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，即為樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件優(yōu)化

2.1.1 HPLC-DAD分段檢測波長的選擇

檸檬黃、日落黃、亮藍均為水溶性酸性染料，結(jié)構(gòu)中含有數(shù)量不等的苯磺酸基團，在紫外區(qū)有較強的特征吸收，GB/T 5009.35—2003食品中合成著色劑的測定方法中檸檬黃、日落黃、亮藍均采用254 nm波長檢測，而該波長亮藍的峰面積響應值很小，影響該化合物的檢測靈敏度。本文采用DAD檢測器在190～700 nm對3個成分色譜峰進行掃描，以其紫外光譜最大吸收波長作為監(jiān)測波長，根據(jù)各色素成分的保留時間，變換實時監(jiān)測波長的方法，以保證各化合物的響應值達到最大，增加靈敏度，減少背景干擾。表2為HPLC-DAD分段檢測條件。未采用分段檢測波長的標準溶液色譜圖見圖1，采用分段檢測波長的標準溶液色譜圖見圖2。采用DAD掃描3個對照品峰的頂點光譜圖見圖3。

表2 HPLC-DAD分段檢測條件Table 2 Segment detection condition of HPLC-DAD

圖1 檸檬黃、日落黃和亮藍混合對照品溶液未分段檢測液相色譜圖Fig.1 Theliquid chromatography of unsegmented detective standards(1-檸檬黃;2-日落黃;3-亮藍圖2、圖4、圖5、圖7、圖8同。)

圖2 檸檬黃、日落黃和亮藍混合對照品溶液采用分段檢測波長的液相色譜圖Fig.2 The liquid chromatography of segmented detective standards

A:檸檬黃光譜圖;B:日落黃光譜圖;C:亮藍光譜圖圖3 混合對照品溶液采用DAD掃描峰的最大吸收波長Fig.3 Maximum absorption wavelengths of the standards

2.1.2 提取方法的選擇

分別取空白樣品適量加標準品溶液做加樣回收，考察了無水乙醇-氨水-水混合溶液(體積比為7∶2∶1)直接提取法[18](方法1)、70%乙醇超聲提取法[19](方法2)、聚酰胺粉吸附法[20](方法3)、滴加氨水溶液渦旋加超聲提取法(方法4)4種方法不同提取條件的提取效果，優(yōu)化了提取條件，確定 “方法1”提取方法為稱取樣品10 g于比色管中，加入無水乙醇-氨水-水混合溶液(體積比為7∶2∶1)100 mL超聲提取，超聲頻率為40 kHz,超聲時間為30 min，吸取上清液50 mL置蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，以水溶解殘渣并轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，定容至刻度，取濾液過濾膜進樣；“方法2”提取方法為稱取樣品10 g于比色管中，加入70%乙醇100 mL超聲提取，超聲頻率為40 kHz，超聲時間為25 min，取濾液過濾膜進樣；“方法3”提取方法為稱取10 g樣品于比色管中，加水30 mL溶解樣品，試樣溶液加檸檬酸溶液調(diào)pH值至6，加熱至60 ℃，將1 g聚酰胺粉調(diào)成粥狀，倒入試樣溶液中，攪拌片刻，以G3垂融漏斗抽濾，用60 ℃pH=4的水洗滌5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗滌5次，每次5 mL，收集解析液，加乙酸中和，蒸發(fā)至近干，加水溶解，定容至5 mL，取濾液過濾膜進樣；“方法4”提取方法見“1.3.3樣品處理”。

比較上述4種提取方法，“方法1”檸檬黃、日落黃、亮藍的回收率均低；“方法2”檸檬黃未檢測出、日落黃回收較低；“方法3”和“方法4”提取效果接近，回收率均大于80%，但“方法3”操作步驟繁瑣，工作效率低，檢測成本高。本實驗建立的“方法4”，即滴加氨水溶液渦旋加超聲提取法操作簡便，極大地節(jié)省了檢驗時間，提取效率高，回收率滿意。不同提取方法的影響見表3。

2.2 專屬性實驗

取檸檬黃、日落黃、亮藍質(zhì)量濃度均為2 μg/mL的混合溶液作為HPLC-DAD對照品溶液，20 ng/mL的混合溶液作為HPLC-MS/MS對照品溶液。取對照品溶液、陽性樣品和空白樣品分別進樣，實驗結(jié)果表明，HPLC-DAD實驗中，紅薯粉條陽性樣品溶液的色譜峰保留時間與對照品溶液一致，其DAD光譜也與對照品溶液光譜一致，空白樣品在相應的保留時間無明顯色譜峰；HPLC-MS/MS實驗中紅薯粉條陽性樣品溶液的離子流色譜峰保留時間與對照品溶液一致，空白樣品在相應保留時間無色譜峰，當出現(xiàn)檸檬黃、日落黃及亮藍的特征離子對并且相對豐度在允許變化范圍內(nèi)時，可以判定檢出檸檬黃、日落黃及亮藍。圖4～圖6分別為混合對照品、陽性樣品及空白樣品的液相色譜圖，圖7～圖9為多反應監(jiān)測色譜圖。

表3 不同提取方法的影響Table 3 The influence of different extraction method

圖4 檸檬黃、日落黃和亮藍混合對照品溶液HPLC色譜圖Fig.4 The liquid chromatography of standards

圖5 紅薯粉條陽性樣品的HPLC色譜圖Fig.5 The liquid chromatography of positive sweet potato vermicelli sample

圖6 紅薯粉條空白樣品的HPLC色譜圖Fig.6 The liquid chromatography of blank sample

2.3 線性范圍與檢測限

將混合對照品儲備溶液分別稀釋成1.3.2中系列混合對照品溶液，按濃度從低至高依次進行測定，記錄HPLC-DAD譜圖和HPLC-MS/MS譜圖。分別以峰面積(y)對質(zhì)量濃度(x)做校正曲線，得到線性范圍、線性回歸方程及相關系數(shù)(R2)如表4所示。取空白紅薯粉樣品10 g，準確加入適量的混合對照品溶液，制成適當濃度的空白樣品加標溶液，以3倍信噪比為檢出限、10倍信噪比為定量限，分別計算檸檬黃、日落黃、亮藍的檢出限和定量限。HPLC-DAD和HPLC-MS/MS兩種檢測方法，檸檬黃、日落黃及亮藍在實驗線性濃度范圍內(nèi)均呈良好線性關系，HPLC-MS/MS較HPLC-DAD靈敏度高。

表4 檸檬黃、日落黃、亮藍的HPLC、HPLC-MS/MS線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 4 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of HPLC and HPLC-MS/MS for tartrazine, sunset yellow and brilliant blue

2.4 精密度及回收率

取適當濃度的對照品溶液，連續(xù)進樣5針，記錄譜圖，計算峰面積相對標準偏差(RSD)。在HPLC-DAD和HPLC-MS/MS實驗中，檸檬黃的峰面積相對標準偏差(RSD)分別為0.58%和4.20%，日落黃的峰面積相對標準偏差(RSD)分別為1.37%和3.38%，亮藍的峰面積相對標準偏差(RSD)分別為1.44%和3.54%。表明HPLC-DAD和HPLC-MS/MS兩種檢測方法，檸檬黃、日落黃及亮藍均具有良好的精密度。

圖7 三種合成色素對照品溶液(20 ng/mL)多反應監(jiān)測色譜圖Fig.7 MRM chromatogram of standard solution (20 ng/mL) of three synthetic pigments

精確移取3種濃度的混合對照品溶液各6份，分別置100 mL比色管內(nèi)，加入10.0 g空白樣品，按1.3.3樣品處理方法制備空白樣品加標溶液，進樣測定，計算回收率，見表5。HPLC-DAD：檸檬黃回收率為85.1%～89.9%，相對標準偏差(RSD)為1.47%～4.10%，日落黃回收率為83.5%～89.5%，相對標準偏差(RSD)為0.94 %～1.81%，亮藍回收率為87.8%～89.7%，相對標準偏差(RSD)為0.62 %～1.34%；HPLC-MS/MS：檸檬黃回收率為84.2%～90.4%，相對標準偏差(RSD)為2.23%～4.92%，日落黃回收率為89.8%～92.5%，相對標準偏差(RSD)為1.55 %～2.19%，亮藍回收率為86.8%～89.8%，相對標準偏差(RSD)為0.96 %～1.92%。表明HPLC-DAD和HPLC-MS/MS兩種檢測方法，檸檬黃、日落黃及亮藍均具有良好的回收率(見表5)。

圖8 紅薯粉條陽性樣品溶液中3種合成色素多反應監(jiān)測色譜圖Fig.8 MRM chromatogram of positive sweet potato vermicelli sample solution of three synthetic pigments

表5 兩種不同方法回收率及相對標準偏差Table 5 Recovery rate and relative standard deviations (RSDs) of the two different methods

2.5 穩(wěn)定性

取陽性紅薯粉條樣品溶液，分別于制備后的0、2、4、6、8、12 h進樣測定，記錄譜圖，以峰面積計算相對標準偏差，HPLC-DAD的峰面積相對標準偏差(RSD)結(jié)果為：檸檬黃的RSD為3.89%，日落黃的RSD為1.62%，亮藍的RSD為0.17%。HPLC-MS的定量離子峰面積相對標準偏差(RSD)結(jié)果為：檸檬黃的RSD為4.19%，日落黃的RSD為2.82%，亮藍的RSD為2.12%。表明HPLC-DAD和HPLC-MS/MS 兩種檢測方法樣品溶液在12 h 內(nèi)均保持穩(wěn)定。

2.6 重復性

分別稱取陽性紅薯粉樣品約8.0，10.0，12.0 g各3份，按1.3.3樣品處理方法制備樣品，記錄峰面積，計算樣品平均含量以及相對標準偏差，結(jié)果顯示，HPLC-DAD方法中，檸檬黃的平均含量為1.244 mg/kg，RSD=0.58%(n=9)；日落黃的平均含量為3.363 mg/kg，RSD=1.37% (n=9)；亮藍的平均含量為2.767 mg/kg，RSD=1.44% (n=9)；HPLC-MS方法中，檸檬黃的平均含量為1.228 mg/kg，RSD=3.56% (n=9)；日落黃的平均含量為3.424 mg/kg，RSD=3.42% (n=9)；亮藍的平均含量為2.581 mg/kg，RSD=3.61% (n=9)。表明HPLC-DAD和HPLC-MS/MS 兩種檢測方法均具有良好的重復性。

圖9 空白樣品溶液中3種合成色素多反應監(jiān)測色譜圖Fig.9 MRM chromatogram of blank sample of three synthetic pigments

2.7 樣品含量測定

取紅薯粉條樣品，按1.3.3制備樣品溶液后采用HPLC-DAD進行篩查，陽性樣品后采用HPLC-MS/MS進行進一步確證。樣品包括在批發(fā)市場、農(nóng)貿(mào)市場、超市、個體門店采集的樣品92批，其中標注生產(chǎn)企業(yè)的樣品33批，未標注來源的無證作坊樣品59批。92批樣品檢出色素成分19批，不合格率為20.7%，其中檢出檸檬黃17批、日落黃10批、亮藍14批。陽性樣品含量測定結(jié)果見表6。含量測定結(jié)果表明，HPLC-DAD和HPLC-MS/MS兩者的含量接近，兩者均適用于紅薯粉中非法添加檸檬黃、日落黃及亮藍的檢測。HPLC-MS/MS較HPLC-DAD靈敏度高，定性定量更準確。

表6 陽性樣品測定結(jié)果Table 6 Determination results of positive sweet potato vermicelli samples

注：N.D為未檢出。

3 結(jié)論

本實驗建立了二極管陣列高效液相色譜法(HPLC-DAD)及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測定偽制紅薯粉條中非法添加人工合成色素檸檬黃、日落黃、亮藍的檢測方法。采用滴加氨水溶液渦旋加超聲提取制備樣品溶液，通用性強，提取過程避免了有機溶劑使用，提取效率高，廉價且操作簡便。HPLC-DAD和HPLC-MS/MS兩種方法線性關系、精密度、重復性、穩(wěn)定性均好，靈敏度高；HPLC-DAD法檸檬黃、日落黃和亮藍,3種色素回收率為83.5%～89.9%，RSD為0.62%～4.10%，HPLC-MS/MS法回收率為84.2%～92.5%，RSD為0.96%～4.92%，方法準確，均適用于偽制紅薯粉條中非法添加合成色素的檢測。在日常檢驗工作中，先采用HPLC-DAD法進行篩查，操作簡單、快捷、成本較低；對陽性樣品采用HPLC-MS/MS法確證，實現(xiàn)對化合物的準確定性定量，確保檢驗結(jié)果的準確可靠。

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DeterminationofthreesyntheticpigmentsillegallyaddedintosweetpotatobyHPLC-DADandHPLC-MS/MS

FU Chun-hua*,WU Ze-jun,Lin Fang,LIU Shui-ping,BAO Min,LIU Fang

(Zhuzhou Institute for Food and Drug control,Zhuzhou 412000,China)

Two methods, high-performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD) and high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) were developed for the determination of synthetic pigments such as tartrazine, sunset yellow, brilliant blue which were illegally added into sweet potato noodles. The crushed samples were extracted by ultrasound for 20 min and vortex blending assisted extraction 2 min in 0.25 mL ammonia solution (1∶1,v/v). The HPLC-DAD and HPLC-MS/MS methods were used. The calibration curves of each synthetic pigment showed good linear relationships. The Square correlation coefficients of all pigments were from 0.999 2-0.999 3 by HPLC-DAD and from 0.996 1-0.997 9 by HPLC-MS/MS. The determination limits of 3 synthetic pigments were 0.08-0.3 mg/kg by HPLC-DAD and 0.02-0.05 mg/kg by HPLC-MS/MS. The recovery tests were performed at the low, middle and high level with mixed standard solution of 3 synthetic pigments. The recoveries of HPLC-DAD and HPLC-MS/MS were 83.5%-89.9% and 84.2%-92.5% respectively. Meanwhile, the relative standard deviations of HPLC-DAD and HPLC-MS/MS were 0.62%-4.10% and 0.96%-4.92% respectively. The method of HPLC-DAD and HPLC-MS/MS were accurate, sensitive and accurate for validation of positive samples.

synthetic pigments; counterfeit sweet potato vermicelli; high-performance liquid chromatography with diode array detector (HPLC-DAD); high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013998

碩士，工程師(本文通訊作者,E-mail:184814944@qq.com)。

湖南省食品藥品監(jiān)督管理局食品藥品安全科技項目(湘食藥科R201523)

2017-02-08，改回日期：2017-04-12