產(chǎn)高分子量木聚糖酶細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

王中月，滕超，湯回花，李秀婷

1(北京工商大學(xué)，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)2(北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京，100048)

產(chǎn)高分子量木聚糖酶細(xì)菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化

王中月，滕超，湯回花，李秀婷*

1(北京工商大學(xué)，食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室，北京，100048)2(北京工商大學(xué)，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京，100048)

通過透明圈法從土壤中篩選出55株產(chǎn)木聚糖酶的細(xì)菌菌株，經(jīng)產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基復(fù)篩及SDS-PAGE酶譜分析得到1株產(chǎn)高分子量木聚糖酶細(xì)菌菌株P(guān)aenibacillussp. 39631。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析，對(duì)影響產(chǎn)酶發(fā)酵的各因素進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳產(chǎn)酶發(fā)酵條件：碳源(80目玉米芯粉)0.8%，氮源(牛肉膏)1%，初始值pH7.2，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速158 r/min，接種量2%，裝液量50 mL。在最佳培養(yǎng)條件下，經(jīng)72 h液態(tài)發(fā)酵，酶活力達(dá)到44.12 U/mL，比優(yōu)化前提高了4.36倍。

高分子量木聚糖酶；細(xì)菌菌株；液態(tài)發(fā)酵；響應(yīng)面優(yōu)化

木聚糖酶是一類重要的糖苷鍵水解酶，能夠?qū)Ｒ坏貙⒛揪厶墙到鉃楣涯揪厶?、低聚木糖和木糖[1]，根據(jù)對(duì)木聚糖主鏈作用方式的不同，分為β-1,4-外切木聚糖酶、β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、β-木糖苷酶[2]。作為一種重要的工業(yè)應(yīng)用酶制劑，木聚糖酶在食品、飼料、造紙等方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[3]，如添加適量木聚糖酶到小麥面粉中，可以有效改善面團(tuán)的質(zhì)量，其烘烤質(zhì)量得到顯著提升；在制作果汁和酒時(shí)木聚糖酶可起到澄清作用[4-5]；可以用來增加家畜對(duì)飼料的消化吸收率，提高青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[6]。

微生物是木聚糖酶的重要來源，如真菌、放線菌和細(xì)菌[7]，由于木聚糖酶在不同工業(yè)應(yīng)用上的差異，需要從自然環(huán)境中篩選具有不同特性的木聚糖酶。根據(jù)木聚糖酶分子量的差異特性，可分為兩大類，即小于30 kDa的堿性木聚糖酶和大于30 kDa的酸性木聚糖酶，通常細(xì)菌可產(chǎn)生這2種木聚糖酶。研究表明，分子量較大的木聚糖酶具有良好的酶學(xué)特性，如底物特異性廣泛，因其具有多個(gè)底物結(jié)合位點(diǎn)，能夠高效作用于小分子量的木寡糖；另外對(duì)低分子量纖維素底物，特別是對(duì)含有芳香族基團(tuán)的低聚纖維多糖具有相當(dāng)可觀的活性[8]。GUPTA[9]研究發(fā)現(xiàn)，Staphylococcussp.SG-13可有效地降解麥麩、甘蔗蔗渣、玉米芯、楊樹木材等多種農(nóng)業(yè)廢棄物。朱輝[10]對(duì)Paenibacilluspolymyxa的研究表明，該菌株所產(chǎn)高分子量木聚糖酶具有分解木聚糖和葡聚糖的能力，這和ZHANG[11]的研究結(jié)果相一致。ANTHONY[12]從造紙廠廢水篩選出1株耐堿的AspergillusfumigatusAR1，該菌株可產(chǎn)生多個(gè)從212 kDa到253 kDa的高分子量木聚糖酶，可適應(yīng)較寬廣的pH范圍，并具有較好的耐熱性。GHIO[13]等過研究發(fā)現(xiàn)，Paenibacillussp.A59所產(chǎn)木聚糖酶在50～70 ℃具有良好的穩(wěn)定性，酶解產(chǎn)物以木二糖為主。THIAGARAJAN[14]研究了AspergillusfumigatusMKU1所產(chǎn)高分子量木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其最適溫度為90 ℃。SAINZ-POLO[15]研究了分子量為120 kDa的木聚糖酶的分子機(jī)制。因此為滿足工業(yè)對(duì)具有不同特性木聚糖酶的多樣化需求，篩選不同特性的木聚糖酶極有必要。

本文通過透明圈法從土壤中篩選得到1株產(chǎn)高分子量木聚糖酶的細(xì)菌菌株，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面分析對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高其產(chǎn)酶能力。

1 材料與方法

1.1 土樣

土壤樣品采集于山東濟(jì)南千佛山山頂、北京國(guó)家森林公園、河南漯河花花牛原料間、貴州貴陽(yáng)十里河灘濕地公園等地，距離地表5～15 cm處的植被土壤。

1.2 試驗(yàn)材料

玉米芯購(gòu)自北京郊區(qū)(新鮮、無(wú)蟲蛀、無(wú)霉變、干燥)，用粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，置于干燥處貯存?zhèn)溆?；木糖、櫸木木聚?Beechwood xylan)：美國(guó)Sigma公司；玉米芯水不溶性木聚糖：實(shí)驗(yàn)室自制；其他試劑如無(wú)說明均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

超凈工作臺(tái)，AIRTECH公司；DYY-10C電泳儀，北京六一儀器廠；DYC P-31BN水平電泳槽，北京六一儀器廠；高速離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；Image Quant 300凝膠成像儀，美國(guó)GE公司；STIK生化培養(yǎng)箱，施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司；恒溫?fù)u床，美國(guó)精琪公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基及主要試劑配制

平板初篩培養(yǎng)基(%)：玉米芯木聚糖1.00、NH4NO30.50、MgSO40.05、NaCl 0.50、K2HPO40.20、(NH4)2SO40.10、酵母粉0.03、瓊脂2.00、pH 8.0，121 ℃下滅菌20 min。

斜面保藏培養(yǎng)基(%)：胰蛋白胨1.00、酵母提取物0.50、NaCl 0.50、瓊脂1.50，pH7.4，121 ℃下滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(%)：胰蛋白胨1.00、酵母提取物0.50、NaCl 0.50，pH7.4，121 ℃下滅菌20 min。

初始液體發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：玉米芯2.00、酵母膏2.00、K2HPO40.25、MgSO40.05、NaCl 0.50，pH 7.0，121 ℃下滅菌20 min。

10 μmol/mL的木糖母液：精確稱取0.150 g木糖(Sigma)，用一定pH的緩沖液溶解并定容至100 mL，即得到10 μmol/mL的木糖母液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1%木聚糖底物溶液的配制：精確稱取2.0 g櫸木木聚糖，用高純水配制2%的木聚糖底物100 mL，需要時(shí)用一定pH值的緩沖液接1∶1混合成1%木聚糖底物溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 菌株的初篩

制備菌液，即稱取土樣0.1 g，用900 μL無(wú)菌水稀釋成10-1，混勻，吸取100 μL混合液，用900 μL無(wú)菌水稀釋成10-2混勻后依次稀釋成10-3、10-4混合液，均勻涂布于平板篩選培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察菌株生長(zhǎng)狀態(tài)，挑取周邊能夠產(chǎn)生透明圈的菌株劃線分離進(jìn)行純化培養(yǎng)，斜面保存。

1.4.3 菌株的復(fù)篩

挑取入選的斜面菌種接入種子培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)14 h，將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按一定比例接入基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，裝液量為250 mL三角瓶裝液50 mL，180 r/min，37 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)物經(jīng)4 000 r/min離心10 min取上清，即為粗酶液。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

將配置好的木糖母液分別稀釋成濃度為0.0、2.0、3.3、5.0、10.0 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)糖液組，在10 mL試管中用移液槍精確加入0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)糖液、0.9 mL木聚糖底物和1 mL DNS試劑(用前加入無(wú)水亞硫酸鈉，每100 mL加0.05 g)，在沸水中煮沸15 min，煮沸完畢加入1 mL 40%酒石酸鉀鈉護(hù)色，涼水冷卻，充分搖勻后，在540 nm下測(cè)吸光值A(chǔ)。以木糖含量為縱坐標(biāo)，A為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出回歸方程。

1.4.5 木聚糖酶酶活力的測(cè)定方法

木聚糖酶活力的測(cè)定參照DNS法[16]：0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液，加入到0.9 mL用0.05 mol/L、pH5.5乙酸緩沖液配制的10 g/L櫸木木聚糖底物溶液中，55 ℃反應(yīng)5 min，加入1 mL DNS試劑終止反應(yīng)，后續(xù)處理參照1.4.4。利用木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)生成還原糖(以木糖計(jì))的量。木聚糖酶活力單位定義為：在上述條件下，每分鐘生成1μmol木糖所需要的酶量(U)。

1.4.6 SDS-PAGE酶譜分析[17]

對(duì)粗酶液進(jìn)行酶譜分析：在12.5%的聚丙烯酰胺凝膠中加入0.5%的櫸木木聚糖制備底物膠，在冰浴中進(jìn)行常規(guī)蛋白電泳(濃縮膠80 V恒壓，分離膠100 V恒壓)。電泳結(jié)束后，先用25%異丙醇洗滌凝膠4次使酶蛋白復(fù)性，每次15 min；然后用0.05 mol/L、pH7.0 Tris-HCl緩沖液洗滌凝膠4次，每次18 min，洗滌完畢在55 ℃條件下保溫1 h；凝膠用0.5%的剛果紅染液染色15 min，最后用1 mol/L NaCl溶液脫色直至出現(xiàn)透明條帶，用0.5%的醋酸溶液進(jìn)行護(hù)色。

1.4.7 產(chǎn)木聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)產(chǎn)木聚糖酶活性的影響

在初始液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別改變碳源和氮源的種類，初始含量均為20 g/L，搖瓶培養(yǎng)72 h，測(cè)定酶活，確定最佳碳源和氮源，然后改變碳源和氮源的濃度，進(jìn)行碳源、氮源濃度的產(chǎn)酶發(fā)酵優(yōu)化，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

(2)培養(yǎng)條件對(duì)木聚糖酶活性的影響

確定最佳碳源和氮源后，考察初始pH值、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量5個(gè)因素對(duì)產(chǎn)酶發(fā)酵的影響，分別測(cè)定各單因素條件下的酶活性，確定各因素適宜的范圍，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

(3)Box-Behenken響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，運(yùn)用DPS軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Box-Behenken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以木聚糖酶酶活為響應(yīng)值，選取對(duì)發(fā)酵影響最為顯著的pH值、轉(zhuǎn)速、碳源濃度3個(gè)因素，設(shè)計(jì)因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析及顯著性檢驗(yàn)，以確定產(chǎn)酶發(fā)酵的最佳組合，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)重復(fù)3次，取試驗(yàn)結(jié)果的平均值，其中各自變量的因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factorsand levels of response surface experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)木聚糖酶細(xì)菌的篩選

土壤是重要的微生物獲取途徑，存在豐富多樣的微生物，通過透明圈法從土壤中進(jìn)行產(chǎn)木聚糖酶細(xì)菌的平板篩選，共獲得目的菌株55株，通過產(chǎn)酶發(fā)酵得到粗酶液，測(cè)定酶活，產(chǎn)酶情況見表2。

表2 土樣中木聚糖酶產(chǎn)生菌的分離情況Table 2 Screening of xylanase produced strains

粗酶液經(jīng)SDS-PAGE電泳酶譜分析，得到細(xì)菌菌株產(chǎn)木聚糖酶分子量情況，經(jīng)酶譜分析，菌株 39631所產(chǎn)木聚糖酶可以產(chǎn)生4條木聚糖酶透明條帶，如圖1所示，且分子量均在60 kDa以上，這在目前文獻(xiàn)的報(bào)道中是比較少見的，具有良好的理論研究?jī)r(jià)值，作為目標(biāo)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。經(jīng)鑒定 39631為類芽孢桿菌屬，命名為Paenibacillussp. 39631，可在初篩平板上產(chǎn)生明顯透明圈，如圖2所示。

M-高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1-粗酶液圖1 Paenibacillus sp. 39631SDS-PAGE酶譜分析Fig.1 SDS-PAGE andzymogram of xylanase samples

圖2 Paenibacillus sp. 39631的透明圈Fig.2 Transparent zone of Paenibacillus sp. 39631(注：培養(yǎng)基為初篩平板；培養(yǎng)時(shí)間48 h)

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

2.2.1 碳源對(duì)Paenibacillussp. 39631產(chǎn)酶的影響

木聚糖酶屬于誘導(dǎo)性酶，不同碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶均有影響。實(shí)驗(yàn)選取玉米芯、玉米秸稈、麩皮、玉米芯木聚糖、玉米秸稈木聚糖、麩皮木聚糖為碳源底物進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯鲈诎l(fā)酵培養(yǎng)基中以玉米秸稈木聚糖、麩皮木聚糖為碳源時(shí)酶活相對(duì)較低，在5 U/mL左右；以玉米芯、玉米芯木聚糖為底物時(shí)，酶活分別為10.96 U/mL、11.84 U/mL，酶活相對(duì)較高且相差不大。考慮到成本問題，選擇玉米芯為發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)碳源。

a-玉米芯；b-麩皮玉米；c-秸稈；d-玉米芯木聚糖；e-玉米秸稈木聚糖；f-麩皮木聚糖圖3 碳源種類對(duì)Paenibacillus sp. 39631液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.3 The effect of different carbon source on Paenibacillus sp. 39631 xylanase production

在確定最適碳源后，考察碳源質(zhì)量濃度對(duì)木聚糖酶酶活的影響，實(shí)驗(yàn)選取 10、20、30、40、50 g/L 5個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，隨著玉米芯粉添加量的增加，木聚糖酶酶活呈逐漸下降的趨勢(shì)，可知在單因素改變的條件下，10 g/L的玉米芯粉添加量為最適質(zhì)量濃度。

圖4 玉米芯質(zhì)量濃度對(duì)菌株P(guān)aenibacillus sp. 39631液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of corncob concentration on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.2.2 氮源對(duì)Paenibacillussp. 39631產(chǎn)酶的影響

在產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，以10%的70目玉米芯粉為培養(yǎng)基的碳源，添加20 g/L的不同氮源進(jìn)行產(chǎn)酶發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

a-安琪酵母浸粉；b-酵母膏；c-胰蛋白胨；d-大豆蛋白胨；e-牛肉膏；f-硝酸銨；g-硝酸鈉；h-磷酸氫二氨；i-尿素圖5 不同氮源對(duì)Paenibacillus sp. 39631液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of nitrogen sources on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

由圖5可知，牛肉膏作為氮源時(shí)，酶活最高達(dá)到12.43 U/mL，酵母膏、大豆蛋白胨次之，總體來說有機(jī)氮源優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源，因?yàn)橛袡C(jī)氮成分復(fù)雜，能夠?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)提供更加豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[18]，最終選取牛肉膏作為后續(xù)產(chǎn)酶發(fā)酵的基礎(chǔ)氮源。

在確定最適氮源后，考察氮源質(zhì)量濃度對(duì)木聚糖酶活的影響，實(shí)驗(yàn)選取5、10、15、20、25、30、35、40 g/L 八個(gè)梯度進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖6所示。隨著氮源質(zhì)量濃度的增加，木聚糖酶活呈先上升后逐漸下降的趨勢(shì)，在10 g/L時(shí)酶活最高達(dá)到16.68 U/mL，由此可知在單因素改變的條件下，10 g/L的氮源添加量為最適質(zhì)量濃度。

圖6 氮源質(zhì)量濃度對(duì)Paenibacillus sp. 39631液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of nitrogen sources concentration on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.2.3 初始pH對(duì)菌株P(guān)aenibacillussp. 39631產(chǎn)酶的影響

在最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別設(shè)置4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0共7個(gè)pH梯度考察其對(duì)液體發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。在恒溫震蕩箱中培養(yǎng)72h后，取發(fā)酵液進(jìn)行酶活測(cè)定，共測(cè)3組，取平均值，結(jié)果見圖7。

圖7 發(fā)酵液初始pH值對(duì)Paenibacillus sp. 39631產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of fermentation liquor pH value on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

由圖7可知，在pH4.0～10.0的范圍內(nèi)木聚糖酶活性呈先增大后下降的趨勢(shì)，在pH7.0的中性條件下酶活力最高，達(dá)到19.11 U/mL，而在酸性或堿性較強(qiáng)的條件下酶活較低，這主要是因?yàn)榘l(fā)酵液的初始pH影響菌株對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用效率，通過改變細(xì)胞膜的通透性達(dá)到影響代謝產(chǎn)物的形成和分泌[19]，而較強(qiáng)的酸性或堿性pH條件下菌體的生長(zhǎng)狀況不好，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)酶降低。故選擇pH7.0為最佳初始pH。

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株P(guān)aenibacillussp. 39631產(chǎn)酶的影響

在以上最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別設(shè)置20、25、30、35、40、45 ℃共6個(gè)溫度梯度考察其對(duì)液體發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶活性的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 發(fā)酵溫度對(duì)Paenibacillus sp. 39631液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of temperature on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

由圖8可知，產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)最適反應(yīng)溫度范圍為25～30 ℃，其中30 ℃最有利于該菌株產(chǎn)酶發(fā)酵，此時(shí)產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，而溫度過低或過高的條件均不利于產(chǎn)酶發(fā)酵。這是因?yàn)檫^低的溫度造成菌體生長(zhǎng)緩慢，從而影響菌體產(chǎn)酶的速度；溫度過高，菌體雖然生長(zhǎng)旺盛，但是培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被過多的用于菌體自身生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)酶速率則會(huì)相對(duì)降低[20]。因此，對(duì)菌株P(guān)aenibacillussp. 39631而言，最適宜的發(fā)酵溫度為30 ℃。

2.2.5 接種量對(duì)Paenibacillussp. 39631產(chǎn)酶的影響

由圖9可知，在接種量為2%時(shí)，Paenibacillussp. 39631產(chǎn)木聚糖酶活力最高，接種量大于2%后，酶活開始降低。接種量較大時(shí)，酶活降低的原因可能是菌體生長(zhǎng)過快導(dǎo)致發(fā)酵液的黏度增加，在供氧量不變的情況下，會(huì)造成溶氧不足而影響到木聚糖酶的生成[21]，所以選擇2%為最適接種量。

圖9 接種量對(duì)Paenibacillus sp. 39631液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of inoculum dosage on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.2.6 轉(zhuǎn)速對(duì)Paenibacillussp. 39631產(chǎn)酶的影響

由圖10可知，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株P(guān)aenibacillussp. 39631的產(chǎn)酶活力影響比較明顯。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min時(shí)，產(chǎn)酶活力最低，僅有9.0 U/mL，在搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí)具有最高酶活24.66 U/mL。故將產(chǎn)酶發(fā)酵最佳轉(zhuǎn)速設(shè)定為150 r/min。

圖10 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)Paenibacillus sp. 39631液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of rotating speed on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.2.7 裝液量對(duì)Paenibacillussp. 39631產(chǎn)酶的影響

在以上條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，考察裝液量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，發(fā)酵液中溶氧量與氧氣的傳遞效率和搖瓶裝液量直接相關(guān)，進(jìn)而影響發(fā)酵液中菌體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用速率，從而影響木聚糖酶的生產(chǎn)效率[22]。Paenibacillussp. 39631為需氧微生物，所以裝液量的大小直接影響著它的生長(zhǎng)和木聚糖酶的產(chǎn)生，由圖11可知，在250 mL錐形瓶中加入20～80 mL的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，木聚糖酶活力呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在裝液量為50 mL時(shí)產(chǎn)木聚糖酶活力為最高，達(dá)到36.12 U/mL。故選取50 mL為最適裝液量。

圖11 裝液量對(duì)Paenibacillus sp. 39631液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effect of liquid volume on xylanase production by Paenibacillus sp. 39631

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

利用統(tǒng)計(jì)軟件DPS進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，根據(jù)表3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，以木聚糖酶活力(Y)為響應(yīng)值進(jìn)行回歸擬合得到響應(yīng)值(Y)對(duì)pH值(A)、轉(zhuǎn)速(B)、碳源濃度(C)的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=-788.43+169.16A+2.17B+8.82C-12.69A2-0.01B2-0.29C2+0.11AB-0.46AC-0.01BC

對(duì)回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和方差分析結(jié)果如表4和表5所示。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)所用模型經(jīng)Fr檢驗(yàn)：p=0.000 9<0.01，擬合回歸方程有意義，達(dá)到極顯著水平；并且該模型的擬合度指數(shù)R2=0.980 7，失擬項(xiàng)p=0.145 8>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，這說明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)純誤差較小，實(shí)驗(yàn)精度較高，能夠較好地描述本次試驗(yàn)的結(jié)果。

根據(jù)方差分析結(jié)果繪制各因素間響應(yīng)面立體分析圖，它們反映了pH值(A)、轉(zhuǎn)速(B)、碳源質(zhì)量濃度(C)這3個(gè)因素之間對(duì)響應(yīng)值(Y)的影響。由圖12～14可知，pH和轉(zhuǎn)速的交互作用最為顯著，pH和轉(zhuǎn)速之間，當(dāng)轉(zhuǎn)速一定時(shí)，木聚糖酶的酶活隨著pH的增大呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。

由統(tǒng)計(jì)軟件分析可知，Y預(yù)測(cè)最大值為44.601 8 U/mL，pH值7.219 7、轉(zhuǎn)速158.806 5 r/min，碳源質(zhì)量濃度8.104 1 g/L。此時(shí)響應(yīng)值值經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)酵得到的實(shí)際酶活為44.12 U/mL，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值基本相符，說明預(yù)測(cè)模型可應(yīng)用于該木聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。

表3 Box-Behenken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 3 Design and result of Box-Behnken experiment

表4 模擬回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和結(jié)果Table 4 Test and result of significance for simulated regression coefficient

表5 模型方程的方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis result of model eqution

圖12 pH值和轉(zhuǎn)速對(duì)木聚糖酶酶活的響應(yīng)面分析圖Fig.12 Response surface showing the effects of pH and speed on xylanase production

圖13 碳源質(zhì)量濃度和轉(zhuǎn)速對(duì)木聚糖酶酶活交互作用的的響應(yīng)面分析圖Fig.13 Response surface showing the effects of carbon concentration and speed on xylanase production

圖14 pH值和碳源質(zhì)量濃度對(duì)木聚糖酶酶活的響應(yīng)面分析圖Fig.14 Response surface showing the effects of carbon concentration and pH on xylanase production

3 結(jié)論

通過透明圈法從土壤中篩選出了1株產(chǎn)高分子量木聚糖酶的細(xì)菌菌株，并對(duì)該菌株的木聚糖酶產(chǎn)酶條件進(jìn)行了單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和響應(yīng)面分析，得到該菌株木聚糖酶發(fā)酵最佳產(chǎn)酶條件：碳源(80目玉米芯粉)0.8%，氮源(牛肉膏)1%，初始pH值7.2，培養(yǎng)溫度30 ℃，轉(zhuǎn)速158 r/min，接種量2%，裝液量50 mL。該菌株所產(chǎn)木聚糖酶活力雖不是處于較高水平，但其所產(chǎn)的木聚糖酶分子量較高，具有很好的研究?jī)r(jià)值，且以玉米芯為最佳碳源，培養(yǎng)基原料成本低，為該酶的理論研究和工業(yè)應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。

[1] 吳萍,李正鵬,何慶元,等.金針菇固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的純化及其性質(zhì)研究[J].藥物生物技術(shù),2012(1):31-34.

[2] 葉波,周婭琴.木聚糖酶綜述[J].輕工科技,2012(7):14-16.

[3] 付冠華,李端,周晨妍,等.木聚糖酶的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(35):21566-21568.

[4] CUI Feng-jie,ZHAO Li-ming.Optimization of Xylanase Production fromPenicilliumsp.WX-Z1 by a Two-Step Statistical Strategy:Plackett-Burmanand Box-Behnken Experimental Design[J].International Journal of Molecular Sciences,2012,13(8):10630.

[5] COURTIN C,DELCOUR J.Arabinoxylans and Endoxylanases in Wheat Flour Bread-making[J].Journal of Cereal Science,2002,35(3):225-243.

[6] TCHAOUN C,POOSARAN N,WATANABE M,et al.Thermostable and alkaline-tolerant microbial cellulase-free xylanasesproduced from agricultural wastes and the properties required for use in pulp bleaching bioprocesses: a review[J].Process Biochemistry,2003, 38(9):1 327-1 340.

[7] 馬煥,權(quán)淑靜,劉德海,等.產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選、鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究[J].中國(guó)釀造,2016,35(12):123-128.

[8] 王國(guó)增.不同環(huán)境中木聚糖酶基因多樣性分析及宏基因組來源的新基因克隆與表達(dá)[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2011.

[9] GUPTA S,KUHAD R,BHUSHAN B,et al.Improved xylanase production from a haloalkalophilicStaphylococcussp. SG-13 using inexpensive agricultural residues[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2001,17(1):5-8.

[10] 朱輝,丁延芹,田方,等.多粘類芽孢桿菌SC2 xynD和gluB的克隆及序列分析[J].生物技術(shù)通報(bào),2008,(4):171-174.

[11] ZHANG Qing-hua,LI Hang-guang,ZHU Xina-dong,et al.Exploration of the key functional proteins from an efficient cellulolytic microbial consortium using dilution-to-extinction approach[J].Journal of Environmental Sciences,2015,43(5):199-207.

[12] ANTHONY T, RAJ K.High molecular weight cellulase-free xylanase from alkali-tolerantAspergillusfumigatusAR1[J].Enzyme & Microbial Technology,2003,32(6):647-654.

[13] GHIO S,INSANI E,PINNINNY F,et al.GH10 XynA is the main xylanase identified in the crude enzymatic extract ofPaenibacillussp. A59 when grown on xylan or lignocellulosic biomass[J].Microbiological Research,2016,186:16-26.

[14] THIAGARAJAN S,JEYA M,GUNASEKARAN P.Purification and characterization of a high molecular weight endoxylanase from the solid-state culture of an alkali-tolerantAspergillusfumigatusMKU1[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2006,22(5):487-492.

[15] SAINZ M,GONZALEZ B,MENENDEZ M,et al.Exploring multimodularity in plant cell wall deconstruction: structural and functional analysis of xyn10C containing the CBM22-1-CBM22-2 tandem[J].Journal of Biological Chemistry,2015,290(28):17 116.

[16] 沈誠(chéng),李戎,胡婷莉,等.木聚糖酶活力的二硝基水楊酸(DNS)測(cè)定法[J].印染,2011,37(2):35-39.

[17] HUA Yun,HONG Tian.Novel cold-adaptivePenicilliumstrain FS010 secreting thermo-labile xylanase isolated from Yellow Sea[J].Acta Biochimica Et Biophysica Sinica,2006,38(2):142-149.

[18] 劉程程,劉波,藍(lán)江林,等.產(chǎn)木聚糖酶芽胞桿菌的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,29(8):757-767.

[19] UEDA M,KOO H.Cellulase treatment of cotton fabrics. II. Inhibitory effect of surfactants on cellulase catalytic reaction.[J].Textile Research Journal,1994,64(64):615-618.

[20] 李雪龍.細(xì)菌性木聚糖酶高產(chǎn)菌株的篩選及其酶學(xué)性質(zhì)研究[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學(xué),2008.

[21] 李群良,韓玉璐,張欣英,等.產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J].可再生能源,2011,29(2):89-91.

[22] 馬建盧.降解木糖渣真菌的篩選及其發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)的研究[D].鄭州:鄭州大學(xué),2012.

Screeningofhighmolecularweightxylanase-producingbacteriaandoptimizationoffermentationconditions

WANG Zhong-yue,TENG Chao, TANG Hui-hua, LI Xiu-ting*

1(Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Beijing 100048, China)2(Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives, Beijing 100048, China)

55 Xylanase-producing bacteria from the different sources of soil samples through the transparent circle method a high molecular weight xylanase-producing bacteriaby liquid fermentation and SDS-PAGE zymogramanalysis.Through single factor experiment and response surface analysis,the factors affecting the enzyme production fermentation optimizedthe best enzyme production fermentation conditions : carbon source (corn cob powder)0.8%, nitrogen source (beef paste) 1%, initial pH value of 7.2, culture temperature 30 ℃, rotational speed of 158 r/min, of 2%, the fluid volume 50 mL. Under the optimized condition, the enzyme activity reached 44.12 U/mL after fermentation,which 4.36 times higher than before optimization.

high molecular weight xylanase; bacterial strains; liquid fermentation; the response surface optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014537

碩士研究生(李秀婷教授為通訊作者,E-mail：lixt@th.btbu.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31671793;1201449)

2017-04-15, 改回日期：2017-06-12