影響產(chǎn)土味素鏈霉菌生長(zhǎng)及代謝的白酒釀造相關(guān)環(huán)境因素

杜海，杜小威，趙景龍，張?chǎng)?，徐巖*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)釀酒科學(xué)與酶技術(shù)中心，江蘇 無(wú)錫，214122)2(山西杏花村汾酒廠股份有限公司，技術(shù)中心，山西 汾陽(yáng)，032205)

影響產(chǎn)土味素鏈霉菌生長(zhǎng)及代謝的白酒釀造相關(guān)環(huán)境因素

杜海1，杜小威2，趙景龍2，張?chǎng)?，徐巖1*

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)釀酒科學(xué)與酶技術(shù)中心，江蘇 無(wú)錫，214122)2(山西杏花村汾酒廠股份有限公司，技術(shù)中心，山西 汾陽(yáng)，032205)

產(chǎn)土味素(geosmin)的鏈霉菌對(duì)白酒釀造菌群及風(fēng)味造成嚴(yán)重影響。該研究目的是發(fā)現(xiàn)白酒釀造中限制土味素生物合成的特征環(huán)境因子。針對(duì)白酒群體微生物固態(tài)釀造體系的特征，系統(tǒng)地研究了釀造環(huán)境因素(溫度、水分、乙醇含量、pH等)對(duì)產(chǎn)土味素鏈霉菌生長(zhǎng)及代謝的影響規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn)土味素的產(chǎn)量與菌體的生物量和生長(zhǎng)速率是呈正相關(guān)的關(guān)系。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)土味素鏈霉菌最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，最適生長(zhǎng)的基質(zhì)含水量為50%。乙醇體積分?jǐn)?shù)高于10%的釀造環(huán)境中，產(chǎn)土味素鏈霉菌菌體生長(zhǎng)會(huì)受到完全抑制。菌體在中性偏堿性(pH7～8)的環(huán)境中可以大量繁殖。在酸性(pH3～5)環(huán)境中，產(chǎn)土味素鏈霉菌菌體生長(zhǎng)受到抑制，并進(jìn)而減少土味素的產(chǎn)生。研究結(jié)果對(duì)有效控制白酒中土霉異味提供了可靠的理論依據(jù)。

土味素；鏈霉菌；環(huán)境因子；白酒

中國(guó)白酒以釀造過(guò)程復(fù)雜，香氣成分豐富而聞名于中外[1]。目前，從白酒中檢測(cè)到的香氣成分種類(lèi)均達(dá)到百種以上[1]。然而，白酒中除了香氣成分以外，還存在著許多令人不悅的異味物質(zhì)，而土霉味、澀味、酸味等是中國(guó)白酒中常見(jiàn)的異味[2-3]。尤其是土霉味，更是給白酒界帶來(lái)了很大的困擾。

目前，在國(guó)內(nèi)外得到廣泛關(guān)注的土霉味物質(zhì)有兩種：2-甲基異莰醇(2-MIB)和土味素(geosmin)。這類(lèi)物質(zhì)出現(xiàn)頻率最多的領(lǐng)域是在飲用水和水產(chǎn)養(yǎng)殖方面。產(chǎn)土霉味的微生物主要有放線菌(主要是鏈霉菌)和浮游藻類(lèi)等。自GERBER[4]分離到土霉味物質(zhì)土味素以來(lái)，關(guān)于土霉味物質(zhì)的研究進(jìn)展一直很快，從分離、檢測(cè)、鑒定、生物合成及降解方面都取得了顯著的成效[5-9]。目前土味素的合成途徑已基本清楚，在天藍(lán)鏈霉菌中的sco6073基因的功能得到確認(rèn)，由其編碼兩種關(guān)鍵酶，進(jìn)而催化法尼焦磷酸(FPP)環(huán)化合成geosmin[10]。在降解方面目前采用的方法主要有膜過(guò)濾、活性炭吸附、生物降解等[11]，這些方法都能有效地去除掉水中的土霉味物質(zhì)。

雖然土霉味是中國(guó)白酒中常見(jiàn)的異味，但是中國(guó)白酒界對(duì)其研究卻很少。以前研究并不能明確中國(guó)白酒中土霉味的化學(xué)本質(zhì)及其來(lái)源。白酒釀造行業(yè)內(nèi)一般認(rèn)為土霉味來(lái)源于糠殼，由于糠殼發(fā)霉或蒸煮不徹底以致進(jìn)入白酒中。然而最近的研究表明，土霉味的化學(xué)本質(zhì)是土味素[2]。該物質(zhì)并非產(chǎn)自糠殼，而是來(lái)源于大曲。是通過(guò)大曲中微生物的新陳代謝而產(chǎn)生的，通過(guò)發(fā)酵進(jìn)而進(jìn)入酒醅，通過(guò)蒸餾過(guò)程進(jìn)入原酒中。

本研究團(tuán)隊(duì)前期從白酒大曲中分離出4株產(chǎn)土霉異味的鏈霉菌，并發(fā)現(xiàn)所產(chǎn)土味素為分離得到的鏈霉菌的共性代謝物[6]。雖然在長(zhǎng)期的微生物學(xué)及發(fā)酵工程研究中，鏈霉菌的代謝特征及其相關(guān)生理生化特性已經(jīng)有很多相關(guān)報(bào)道[12-15]，然而，產(chǎn)土味素鏈霉菌在我國(guó)傳統(tǒng)白酒釀造環(huán)境中的生長(zhǎng)特性以及對(duì)環(huán)境的抗逆性并不清晰。因此，從微生物源頭控制角度出發(fā)，有必要了解這一類(lèi)微生物的生長(zhǎng)特性。從而，利用工藝參數(shù)調(diào)節(jié)達(dá)到有針對(duì)性地控制該類(lèi)微生物的生長(zhǎng)及代謝。

本研究將通過(guò)考察影響產(chǎn)土味素鏈霉菌的白酒釀造過(guò)程環(huán)境因素，從中發(fā)現(xiàn)制約土味素生物合成的限制性環(huán)境因子。從而對(duì)白酒中土味素含量進(jìn)行有針對(duì)性的，有效的控制。這對(duì)于豐富我國(guó)白酒釀造機(jī)理和傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的升級(jí)改造都將具有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

鏈霉菌菌株(StreptomycesfradiaeHX，StreptomycesalbusFXJ，StreptomycesradiopugnansQC-1和StreptomycessampsoniiQC-2)均分離自白酒大曲，利用質(zhì)譜分析菌種代謝產(chǎn)物，確定其為土味素生產(chǎn)菌株后保存其孢子于甘油管中。大曲樣品均取自某清香型白酒廠，其制曲最高溫度為40～48 ℃。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基

磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，檸檬酸，均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司。

馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基(液態(tài)培養(yǎng)基)：10 g馬鈴薯煮熟，得500 mL液體。添加10 g葡萄糖。115 ℃滅菌20 min。

麩皮培養(yǎng)基(固態(tài)培養(yǎng)基)：稱(chēng)取含水量為50%的麩皮，向其中添加20 g/kg的葡萄糖。115 ℃滅菌20 min。

將分離得到的產(chǎn)土味素菌株按照1011CFU/g的接種量分別接種于滅菌后的上述固態(tài)/液態(tài)培養(yǎng)基中，30 ℃下培養(yǎng)。其中，固態(tài)培養(yǎng)為培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，液態(tài)培養(yǎng)基設(shè)置搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min。

1.3 生物量的測(cè)定

采用梯度稀釋涂布法測(cè)定固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的生物量。取10 g固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)物，向其中添加50 mL無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)袷幊浞趾笪∫后w并稀釋到合適梯度，涂布于含馬鈴薯葡萄糖瓊脂的培養(yǎng)基平板上。30 ℃倒置培養(yǎng)涂布后的平皿，待菌落形成后計(jì)數(shù)。單一稀釋梯度重復(fù)3次，取其平均值。

采用烘干法[1]測(cè)定液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的生物量。取10 mL發(fā)酵液，8 000 r/min離心收集菌體。分別用5 mL無(wú)菌生理鹽水洗滌2次。置于100～105 ℃烘箱內(nèi)3 h，冷卻30 min。再烘1 h至恒重。稱(chēng)量干燥后的菌體質(zhì)量，計(jì)算單位體積發(fā)酵液中菌體干重。

1.4 水分含量的測(cè)定

采用烘干法[1]測(cè)定。在100～105 ℃烘箱里放入已稱(chēng)重量的待測(cè)樣品，烘干3 h，于干燥皿冷卻30 min，再烘1 h至恒重。稱(chēng)量烘干樣品質(zhì)量。計(jì)算樣品烘干后失去水分的質(zhì)量，除以樣品烘干前質(zhì)量得出結(jié)果為樣品的含水量。

1.5 pH值的測(cè)定

固態(tài)麩皮培養(yǎng)物與酒醅pH值的測(cè)定：稱(chēng)取5 g固態(tài)麩皮培養(yǎng)物或酒醅，加入50 mL滅過(guò)菌的生理鹽水，150 r/min振蕩30 min，pH計(jì)測(cè)定。

液態(tài)培養(yǎng)基：取50 mL發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min后棄沉淀。用pH計(jì)直接測(cè)上清液的pH值。

1.6 不同pH值緩沖液的配制

pH 3～7的緩沖液參照《工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)》中磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制方法配制。pH8～9的緩沖液參照該書(shū)磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液配制方法配制。

1.7 耐酒精能力測(cè)定

向滅菌后的馬鈴薯葡萄糖瓊脂中加入終體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%的乙醇，在凝固后的平板中點(diǎn)接種產(chǎn)土味素鏈霉菌FXJ，HX，QC-1和QC-2。30 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，每個(gè)測(cè)試樣設(shè)3次重復(fù)。定時(shí)查看菌體生長(zhǎng)情況。

1.8 土味素含量的測(cè)定

采用頂空固相微萃取技術(shù)(HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)方法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析[16]。固態(tài)麩皮培養(yǎng)物與酒醅土味素含量的測(cè)定：稱(chēng)取5 g固態(tài)麩皮培養(yǎng)物或酒醅，加入50 mL滅過(guò)菌的超純水，冰浴超聲30 min后，吸取8 mL到預(yù)先稱(chēng)有3 g NaCl的頂空瓶中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)后進(jìn)行HS-SPME-GC-MS的檢測(cè)分析。液態(tài)培養(yǎng)基中土味素含量的測(cè)定：取10 mL發(fā)酵液于10 000 r/min離心10 min后，棄沉淀。吸取8 mL上清液到預(yù)先稱(chēng)有3 g NaCl的頂空瓶中，加入10 μL內(nèi)標(biāo)后進(jìn)行HS-SPME-GC-MS的檢測(cè)分析。

GC條件：色譜柱為 DB-Wax (30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，Agilent)。進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣 He，流速 2 mL/min，檢測(cè)器溫度 250 ℃。程序升溫：初始溫度 50 ℃ 保持 2 min，以10 ℃/min 的速度升溫至160 ℃，然后以5 ℃/min 的速度升溫至230 ℃ 保持35 min，溶劑延遲5 min。

MS條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍 33.00 ～ 500.00 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)土味素鏈霉菌生長(zhǎng)及土味素代謝規(guī)律

在白酒復(fù)合微生態(tài)系統(tǒng)中，不同微生物的生長(zhǎng)有其獨(dú)特的特征。微生物生長(zhǎng)速率的快慢，直接影響該物種在微生態(tài)體系中分布權(quán)重與構(gòu)造。如圖1所示，在液體培養(yǎng)條件下，所考察的鏈霉菌從1.0～3.5 d開(kāi)始有明顯的增殖趨勢(shì)，培養(yǎng)至4.0～4.5 d后達(dá)到生長(zhǎng)穩(wěn)定期。QC-2增殖速度最快，且在培養(yǎng)過(guò)程中最大菌體量可達(dá)19.8 g/L，是所篩鏈霉菌在相同培養(yǎng)條件下菌體生長(zhǎng)量最高的。

圖1 土味素產(chǎn)量與鏈霉菌菌體生長(zhǎng)關(guān)系Fig.1 Relationship between geosmin yield and cell growth of Streptomyces

同時(shí)，由圖1可知，在液態(tài)發(fā)酵2.5～3.0 d時(shí)，各培養(yǎng)基中均開(kāi)始出現(xiàn)土味素含量快速升高的現(xiàn)象，其中，F(xiàn)XJ與QC-2的變化最為明顯。在發(fā)酵4.5 d后，該物質(zhì)含量呈逐漸下降趨勢(shì)。根據(jù)總體的觀察現(xiàn)象可知，土味素的產(chǎn)生與菌體生長(zhǎng)主要呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系。土味素檢出的時(shí)間段要滯后于菌體的指數(shù)生長(zhǎng)期。生長(zhǎng)速率快的菌體，具有相對(duì)更高的最高土味素濃度數(shù)值。

圖2 四株產(chǎn)土味素菌株在不同溫度下培養(yǎng)120 h菌體量比較Fig.2 Biomass comparisons of the four geosmin-producing strains incubated at different temperatures for 120 h

在20、30、40 ℃的溫度條件下，利用這4株產(chǎn)土味素鏈霉菌于馬鈴薯-葡萄糖培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。發(fā)酵120 h后，取10 mL發(fā)酵液，預(yù)處理后進(jìn)行HS-SPME-GC-MS檢測(cè)分析。將離心得到的細(xì)胞，用5mL生理鹽水洗滌2遍，所得菌體120 ℃下烘至恒重，稱(chēng)量細(xì)胞干重。如圖2所示，這4株鏈霉菌均在30 ℃培養(yǎng)條件下的菌體培養(yǎng)量最高。

圖3 四株菌不同溫度培養(yǎng)120 h產(chǎn)土味素量比較Fig.3 Geosmin productions of four geosmin-producing strains incubated at different temperatures for 120 h

進(jìn)一步考察這4株菌分別在20、30、40 ℃培養(yǎng)時(shí)土味素的產(chǎn)量。由圖3可知，在30 ℃條件生長(zhǎng)的菌體產(chǎn)生的土味素含量最高，約為在20 ℃時(shí)培養(yǎng)生長(zhǎng)的1 000倍。由此可知，30 ℃為菌體生長(zhǎng)并代謝土味素的最適溫度，且溫度對(duì)于菌體生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物中土味素的含量有明顯的影響。在20和40 ℃條件下培養(yǎng)，由于菌體生長(zhǎng)受到抑制，土味素的代謝量也明顯減少。值得注意的是，在30 ℃條件下生長(zhǎng)的QC-2菌株產(chǎn)土味素能力與繁殖能力遠(yuǎn)強(qiáng)于其他菌株。

2.2 水分對(duì)產(chǎn)土味素鏈霉菌生長(zhǎng)的影響

通過(guò)考察產(chǎn)土味素鏈霉菌生長(zhǎng)繁殖對(duì)水分的要求，從而分析在制曲過(guò)程中容易污染產(chǎn)土味素鏈霉菌的原因。本研究配制初始含水量為30%、40%、50%、60%的固態(tài)培養(yǎng)基，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察。將4株產(chǎn)土味素鏈霉菌分別接種于上述不同初始含水量的培養(yǎng)基中，同時(shí)通過(guò)空氣加濕裝置保持培養(yǎng)箱中相對(duì)濕度為90%，于30 ℃恒溫培養(yǎng)120 h，測(cè)定菌體生長(zhǎng)情況。

結(jié)果如圖4所示，相比含水量為30%組別的菌體生長(zhǎng)情況，菌體在含水量為50%的固態(tài)麩皮培養(yǎng)基中增殖更為明顯。由此說(shuō)明，較低含水量的物料不利于鏈霉菌的生長(zhǎng)，菌體生長(zhǎng)受到抑制。

圖4 產(chǎn)土味素鏈霉菌在不同含水量固態(tài)麩皮培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of geosmin-producing Streptomyces on solid-state bran cultures with different water contents

2.3 乙醇含量對(duì)產(chǎn)土味素鏈霉菌生長(zhǎng)的影響

通過(guò)考察在固態(tài)基質(zhì)中，乙醇含量對(duì)產(chǎn)土味素鏈霉菌的影響情況。以不含乙醇的培養(yǎng)基為對(duì)照，分別考察含有5%、10%、15%、20%乙醇的固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基中產(chǎn)土味素的4株鏈霉菌的生長(zhǎng)情況。

由圖5可知，與對(duì)照相組比較，在含5%乙醇的培養(yǎng)基中，4株鏈霉菌的生長(zhǎng)受到了一定的抑制。在含10%以上的乙醇的培養(yǎng)基中，這些微生物的生長(zhǎng)被完全抑制(含15%，20%乙醇的情況未列出)。這表明產(chǎn)酒率較高的釀造環(huán)境有利于抑制鏈霉菌的生長(zhǎng)。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)產(chǎn)土味素鏈霉菌生長(zhǎng)抑制情況Fig.5 Growth inhibitions of geosmin-producing Streptomyces by different ethanol contents

2.4 pH對(duì)產(chǎn)土味素鏈霉菌生長(zhǎng)及土味素代謝的影響

環(huán)境pH與微生物的生長(zhǎng)代謝有著密切的關(guān)系。通過(guò)考察產(chǎn)土味素鏈霉菌在固、液態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)下對(duì)pH變化對(duì)其生長(zhǎng)和代謝土味素的影響狀況，以明確產(chǎn)土味素鏈霉菌在釀造環(huán)境中的適應(yīng)能力。

為研究不同產(chǎn)土味素菌株生長(zhǎng)繁殖最適的pH條件，分別考察了用緩沖溶液確定不同初始pH(pH 3、4、5、6、7、8、9)下菌體的生長(zhǎng)情況。由圖6可知，在酸性條件下，這些菌株生長(zhǎng)較慢或不生長(zhǎng)繁殖。在pH為7和8條件下，各菌株生長(zhǎng)普遍較好。

圖6 四株菌在不同初始pH培養(yǎng)基中生長(zhǎng)情況Fig.6 Growth of four strains in media with different initial pH

隨后又考察了發(fā)酵起始和結(jié)束時(shí)，各發(fā)酵液pH變化。由圖7可知，在pH為3、4、5時(shí)，發(fā)酵前后pH變化不大。分析其原因?yàn)樗嵝詶l件(pH3～5)不適合4株菌的生長(zhǎng)，所以代謝較為緩慢，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物較少，因而對(duì)發(fā)酵液pH的影響也較小。在中堿性條件下，尤其是pH為8、9時(shí)，發(fā)酵前后pH變化較大，且都為降低趨勢(shì)，其中HX降幅最為明顯。

圖7 不同初始pH培養(yǎng)基中4株產(chǎn)土味素菌株發(fā)酵120 h后pH變化Fig.7 pH changes of media incubated with four geosmin-producing strains in 120 hours

利用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液與利用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液分別配制pH為3、4、5、6、7、8、9的固態(tài)麩皮培養(yǎng)基。接入4株鏈霉菌后培養(yǎng)120 h，檢測(cè)其中土味素含量。由圖8可知，4株產(chǎn)土味素的菌株在液態(tài)培養(yǎng)基(圖8A)和固態(tài)培養(yǎng)基(圖8B)中，不同pH下產(chǎn)生土味素的濃度情況較為一致。除QC-1在pH為6的條件下產(chǎn)明顯的土味素外，其他3株菌均在中堿性環(huán)境中產(chǎn)生較為明顯的土味素。在pH為3、4、5的情況下，實(shí)驗(yàn)各批次幾乎都沒(méi)有土味素產(chǎn)生，pH較低的釀造環(huán)境有利于降低土味素的產(chǎn)生。

圖8 固/液態(tài)培養(yǎng)4種菌株土味素含量比較(A，液態(tài)；B，固態(tài))Fig.8 Comparison of geosmin contents produced by four strains incubated with different pH in liquid-state culture (A) and solid-state culture (B)

3 討論

土味素的產(chǎn)出主要集中于各菌指數(shù)生長(zhǎng)期的中后期到穩(wěn)定期前期。相比菌體生長(zhǎng)情況，土味素的大量檢出要比菌體大量增殖平均滯后0.5～1.0 d。由此可知，土味素與所述鏈霉菌的生長(zhǎng)存在一定相關(guān)性。土味素可作為這類(lèi)微生物檢測(cè)的標(biāo)記物，并且土味素的含量可以一定程度地反映生物量的多少。

KOMATSU[14]的研究中也發(fā)現(xiàn)，大部分菌株發(fā)酵產(chǎn)出土味素的含量在5 d后達(dá)到最高，隨后土味素的濃度會(huì)有所下降。但該文獻(xiàn)并沒(méi)有解釋濃度降低的原因。GERBER[4]在其發(fā)表的文中也提到土味素的最大產(chǎn)量時(shí)期。POLLAK[12]等人研究了2.5L實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器中StreptomycescitreusCBS 109.60的生長(zhǎng)情況及土味素產(chǎn)生過(guò)程。與抗生素生產(chǎn)相比，在瓊脂平板培養(yǎng)的放線菌土味素的產(chǎn)量往往與菌體的生長(zhǎng)呈正相關(guān)。在液態(tài)培養(yǎng)情況下，Streptomycescitreus與線性生長(zhǎng)階段緊密相關(guān)。在最初的20 h內(nèi)，胞內(nèi)的土味素含量逐級(jí)升高。隨后土味素開(kāi)始通過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)而在培養(yǎng)基中可以檢測(cè)到土味素。胞外的土味素含量總是要高于胞內(nèi)的含量。目前，還不清楚土味素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。但是，與濃度梯度相反的積累現(xiàn)象可以推論該轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制屬于主動(dòng)運(yùn)輸。

白酒釀造過(guò)程中的微生物生物區(qū)系以中溫菌為主，這類(lèi)菌的生長(zhǎng)溫度在20～45 ℃。在此溫度范圍內(nèi)，能夠保證細(xì)胞內(nèi)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，從而維持微生物的生命活動(dòng)。在所考察溫度條件下，所有菌株的最優(yōu)生長(zhǎng)溫度均為30 ℃。在該溫度條件下，菌體生長(zhǎng)最快，產(chǎn)土味素的量也最高。而在20 ℃和40 ℃下培養(yǎng)，菌體的生長(zhǎng)均受到抑制。由此可知產(chǎn)土味素鏈霉菌耐受的溫度范圍較窄。

水分不僅是組成微生物細(xì)胞的重要物質(zhì)，而且是生命體中維持各種生化反應(yīng)并完成正常代謝必需的物質(zhì)。培養(yǎng)物中可以被微生物利用水分的多少直接關(guān)系到微生物的生長(zhǎng)狀態(tài)。在糧食貯存過(guò)程中通常將糧食的水含量控制在“安全水分”以下，抑制微生物的生長(zhǎng)引起的霉變。谷物類(lèi)糧食的“安全水分”約為14%[17]。在這種低水分含量的環(huán)境中，大部分的微生物是很難生長(zhǎng)繁殖的。另一方面，在傳統(tǒng)釀造過(guò)程中，通常通過(guò)控制物料中的水分含量來(lái)活化菌種，完成自然接種。我國(guó)白酒大曲采用自然接種的方式，其中主要的微生物來(lái)源之一就是小麥、豌豆和大麥等糧食原料中原有的微生物。這些微生物在糧食貯存時(shí)，由于水分含量較低，菌體處于休眠狀態(tài)。制曲原料經(jīng)過(guò)粉碎和加水，壓制形成曲坯。冬季曲坯含水量控制在38%～40%，夏季曲坯含水量控制在39%～41%[1]。在此過(guò)程中制曲原料的碳源、氮源等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被釋放。從而，營(yíng)造出適合微生物生長(zhǎng)的環(huán)境。此時(shí)，附著在制曲原料中的微生物被活化，形成大曲微生態(tài)的“雛形”。我們前期的研究中發(fā)現(xiàn)，白酒中的土味素的形成主要是由于制曲過(guò)程中污染產(chǎn)土味素的鏈霉菌。如前所述曲坯的含水量通?？刂圃?0%左右，此時(shí)的含水量比較適宜產(chǎn)土味素鏈霉菌的生長(zhǎng)。而且，這類(lèi)菌廣泛地存在于大曲“自然接種”的環(huán)境中，這就可以解釋在制曲過(guò)程中為何容易污染產(chǎn)土味素的鏈霉菌。同時(shí)，40%的含水量也適合白酒釀造過(guò)程中主要功能微生物的生長(zhǎng)繁殖。因此，水分的控制不能作為避免白酒釀造過(guò)程中污染產(chǎn)土味素鏈霉菌的控制點(diǎn)。在含水量達(dá)到60%時(shí)，固態(tài)靜置培養(yǎng)條件下氧氣的傳遞受到限制，因此菌體生長(zhǎng)同樣也會(huì)受到抑制。

白酒釀造過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)酒醅中的氧氣逐漸被消耗，形成微氧環(huán)境和局部的厭氧環(huán)境。此時(shí)，主要的功能釀造微生物會(huì)不斷產(chǎn)生并積累酒精，酵母菌逐漸成為酒醅中的主要微生物。正常的白酒發(fā)酵會(huì)在釀造后期產(chǎn)生明顯帶有乙醇香氣的“醩香”。酒醅發(fā)酵到中后期，其中的乙醇體積分?jǐn)?shù)可以達(dá)到10%。由此可知，在酒醅發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)乙醇這一釀造環(huán)境因素可抑制產(chǎn)土味素的鏈霉菌生長(zhǎng)。所以，在正常的白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中，產(chǎn)土味素的鏈霉菌是不能大量繁殖生長(zhǎng)的。該結(jié)論也與之前的酒醅發(fā)酵研究結(jié)果相吻合，即酒醅發(fā)酵中后期土味素的含量幾乎沒(méi)有變化[6]。然而，由于白酒釀造為生料制曲，且在較為開(kāi)放的體系中進(jìn)行，因此在制曲過(guò)程中污染該類(lèi)微生物的可能性較大。

pH不僅會(huì)影響微生物細(xì)胞膜上電荷的狀態(tài)，引起細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)交換改變，而且還會(huì)影響到外界有機(jī)質(zhì)的離子化程度，間接影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的吸收。雖然經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化，大多微生物能在較寬的pH范圍內(nèi)生長(zhǎng)，但是不同微生物具有不同的最適生長(zhǎng)pH。在最適的pH范圍內(nèi)，微生物的生長(zhǎng)代謝最為活躍。本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)土味素菌株合適在偏堿性的環(huán)境中生長(zhǎng)。

在堿性條件下，產(chǎn)土味素菌株的生長(zhǎng)、代謝較為活躍，其代謝產(chǎn)物影響了發(fā)酵液pH的變化。從而使自身的生長(zhǎng)環(huán)境處于較適于自身生存的狀態(tài)。POLLAK[12]等人研究了2.5 L實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器中StreptomycescitreusCBS 109.60的生長(zhǎng)情況及土味素產(chǎn)生過(guò)程。在培養(yǎng)過(guò)程中，廢氣中土味素的濃度是連續(xù)上升的。在最初的48 h內(nèi)，pH緩緩降低(從7.5降到6)，隨后培養(yǎng)基的pH增長(zhǎng)到最初的7.5。在培養(yǎng)基和尾氣中檢測(cè)到了甲基吡嗪(methylpyrazine)，2,5-二甲基吡嗪(2,5-dimethylpyrazine)，2,5-二甲基吡嗪(2,6-dimethylpyrazine)的含量分別為3、6、8 μg/L。吡嗪等堿性物質(zhì)的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值升高[18-19]。已有研究認(rèn)為，吡嗪是鏈霉菌典型的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物。GAINES和COLLINS[15]研究了S.odorifer的代謝產(chǎn)物，其中就有氨類(lèi)物質(zhì)。在我們的研究中也發(fā)現(xiàn)，在大曲中所篩選的4株鏈霉菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中均有不同種類(lèi)和含量的吡嗪類(lèi)物質(zhì)產(chǎn)生，其中有四甲基吡嗪、2,5-二甲吡嗪、2,6-二甲吡嗪等。這些弱堿性物質(zhì)的存在能夠起到pH緩沖液的作用，使微生物所處的營(yíng)養(yǎng)體系維持在適度偏堿的環(huán)境中。

張文學(xué)[20]等人研究了白酒酒醅的pH，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過(guò)程中酒醅的pH在3.2～4.2之間。酒醅中偏酸性的pH環(huán)境，能夠抑制產(chǎn)土味素菌株的大量繁殖，從而避免土味素在白酒釀造過(guò)程的大量生成。因此，可以解釋在酒醅中即使含有產(chǎn)土味素的鏈霉菌，也不會(huì)有大量土味素產(chǎn)生的現(xiàn)象。有研究表明，微生物細(xì)胞在受到外界環(huán)境的脅迫或刺激時(shí)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)自身狀態(tài)或啟動(dòng)合成并向細(xì)胞外釋放某種“自衛(wèi)”物質(zhì)來(lái)抵御和應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化。例如，聶薇等人[21]發(fā)現(xiàn)高產(chǎn)谷胱甘肽的產(chǎn)阮假絲酵母(Candidautilis)在低pH環(huán)境中受到脅迫時(shí)，通過(guò)增加谷胱甘肽的合成并釋放到外界中來(lái)抵御pH的變化。整個(gè)白酒的釀造是在偏酸性的環(huán)境下進(jìn)行的，但是適于偏堿性的環(huán)境中生長(zhǎng)的產(chǎn)土味素鏈霉菌在不同地域的酒廠中廣泛存在。

綜上所述，本文通過(guò)考察不同環(huán)境因子下產(chǎn)土味素鏈霉菌的生長(zhǎng)及代謝情況，明確了該類(lèi)鏈霉菌的生長(zhǎng)繁殖特征。同時(shí)，通過(guò)本文研究結(jié)果可知，高酒精度與低pH等環(huán)境條件可抑制該類(lèi)鏈霉菌的生長(zhǎng)，從而降低土味素在白酒釀造環(huán)境中的出現(xiàn)概率。后續(xù)需以風(fēng)味為導(dǎo)向，對(duì)白酒主體香氣及其他常見(jiàn)異味的化學(xué)本質(zhì)及其產(chǎn)生機(jī)制進(jìn)行深入研究。綜合各種重要風(fēng)味產(chǎn)生機(jī)制，通過(guò)釀造環(huán)節(jié)優(yōu)化，整體提升白酒品質(zhì)和生產(chǎn)效率。

[1] 沈怡方, 白酒生產(chǎn)技術(shù)全書(shū)[M].北京: 中國(guó)輕工業(yè)出版社,1998: 4-615.

[2] DU H, FAN W, XU Y. Characterization of geosmin as source of earthy odor in different aroma type Chinese liquors[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011, 59(15):8 331-8 337.

[3] 封明振, 王賢張國(guó)杰. 濃香型酒酸味、辣味、澀味淺析[J]. 釀酒科技, 2000(1):30-31.

[4] GERBER N N, LECHEVALIER H A. Geosmin, an earthy-smelling substance isolated from actinomycetes[J]. Applied Microbiology, 1965, 13(6):935-938.

[5] LU G P, FELLMAN J K, EDWARDS C G, et al. Quantitative determination of geosmin in red beets (BetavulgarisL.) using headspace solid-phase microextraction [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51(4):1 021-1 025.

[6] DU H, XU Y. Determination of the microbial origin of geosmin in chinese liquor[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(9):2 288-2 292.

[7] DICKSCHAT J S, BODE H B, MAHMUD T, et al. A novel type of geosmin biosynthesis in Myxobacteria[J]. Journal of Organic Chemistry, 2005, 70(13):5 174-5 182.

[8] 武敬松, 劉恒兆. 白酒不良口味的成因及解決措施 [J]. 釀酒科技, 2006((2):109.

[9] 李家明, 饒家權(quán). 白酒中異雜味的形成及解除途徑 [J]. 釀酒科技, 1992(6):12-14.

[10] BLAHA L, SABATER S, BABICA P, et al. Geosmin occurrence in riverine cyanobacterial mats: Is it causing a significant health hazard? [J]. Water Science and Technology, 2004, 49(9):307-312.

[11] TUCKER C S. Off-flavor problems in aquaculture [J]. Reviews in Fisheries Science, 2000, 8(1):45-88.

[12] POLLAK F, BERGER R. Geosmin and related volatiles in bioreactor-culturedStreptomycescitreuscbs 109.60 [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(4):1 295-1 299.

[13] REZANKA T, PRELL ASIGLER K. Identification of odorous compounds from nine fermentor-cultivatedStreptomycesstrains [J]. Folia Microbiologica, 2008, 53(4): 315-318.

[14] KOMATSU M, TSUDA M, OMURA S, et al. Identification and functional analysis of genes controlling biosynthesis of 2-methylisoborneol [J]. Proceeding of the National Academy of Science,2008, 105:7 422-7 427.

[15] GAINES. Volatile substances produced byStreptomycesodorifer[J]. Lloydia, 1963, 26:247-253.

[16] DU H, XU Y. Determination of the microbial origin of geosmin in chinese liquor [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(9):2 288-2 292.

[17] 李興軍, 張?jiān)? 王雙林,等. 谷物安全水分估算[J]. 糧食加工, 2011, 36(3):41-45.

[18] ZHU B F, XU Y. A feeding strategy for tetramethylpyrazine production byBacillussubtilisbased on the stimulating effect of ammonium phosphate [J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2010, 33(8):953-959.

[19] ZHU B F, XU Y. Production of tetramethylpyrazine by batch culture ofBacillussubtiliswith optimal pH control strategy [J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2010, 37(8): 815-821.

[20] 張文學(xué), 岳元媛, 向文良. 濃香型白酒酒醅中化學(xué)物質(zhì)的變化及其規(guī)律性 [J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 37(4): 44-48.

[21] 聶薇, 衛(wèi)功元, 李寅,等. 利用低pH脅迫作用促進(jìn)產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽 [J]. 化工學(xué)報(bào), 2005(9): 1 750-1 756.

Theinfluencesoftheenvironmentalfactorsonthegrowthandmetabolismofgeosmin-producingStreptomycesintheliquor-makingprocess

DU Hai1，DU Xiao-wei2，ZHAO Jing-long2，ZHANG Xin2，XU Yan1*

1 (Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University,Center for Brewing Science and Enzyme Technology, Wuxi 214122, China)2 (Shanxi Xinghuacun Fen Liquor Technology Center, Fenyang 032205, China)

Geosmin-producingStreptomycesmay cause the imbalance ofmicrobial flora seriously deterioratthe liquor aroma.The aim of this study is to identify the key factors restricting geosmin production in the liquor-making process.The influence of the main liquor-makingvariables(temperature, water content, ethanol content, pH)on the growth and metabolism of geosmin-producingStreptomyceswere investigated.The results showedthat the yield of geosmin was positivelyrelated with the biomass and growth rate of theStreptomycescells.The most suitable temperature for thegrowth ofStreptomyceswas 30℃, andthe optimum water content was 50%. The growth of geosmin-producingStreptomycesiscompletely inhibited at the alcohol content of over 10% vol. Moreover,Streptomycescangrow rapidly in the neutral and alkalescent (pH7-8) environment, whileit is severelyinhibited in the acidic environment(pH3-5) reduce geosmin production. The above discoveries provide reliable theory to control the earthy off-flavor in Chinese liquor.

geosmin;Streptomyces; environmental factor; Chinese liquor

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014929

博士，講師(徐巖教授為通訊作者，E-mail: yxu@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31501469, 31530055)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK20150143)；中央高?；究蒲谢?JUSRP11537)；中國(guó)白酒“3C”計(jì)劃

2017-06-10，改回日期：2017-07-07