生姜莖基腐病病原鑒定及甲殼胺對其病原菌的抑菌作用

胡鮮梅 李長松 曹亞棟 徐作珽 張悅麗 齊軍山 馬立國張 博 孫明偉 芮法富

（1山東省農業(yè)科學院植物保護研究所，山東省植物病毒學重點實驗室，山東濟南 250100；2山東農業(yè)大學植物保護學院，山東泰安 271001；3濟南阿波羅甲殼素肥業(yè)有限公司，山東濟南 250101）

生姜莖基腐病病原鑒定及甲殼胺對其病原菌的抑菌作用

胡鮮梅1，2李長松1*曹亞棟1徐作珽1張悅麗1齊軍山1馬立國1張 博1孫明偉3芮法富3

（1山東省農業(yè)科學院植物保護研究所，山東省植物病毒學重點實驗室，山東濟南 250100；2山東農業(yè)大學植物保護學院，山東泰安 271001；3濟南阿波羅甲殼素肥業(yè)有限公司，山東濟南 250101）

通過形態(tài)學觀察、致病性測定及序列分析，對生姜莖基腐病病原菌進行鑒定；并采用菌絲生長速率法、活體組織法和田間試驗研究甲殼胺對生姜莖基腐病病原菌的抑菌活性。結果表明，生姜莖基腐病病原菌為群結腐霉（Pythium myriotylum）、刺腐霉（Pythium spinosum）和林棲腐霉（Pythium sylvaticum）。甲殼胺對3種腐霉菌均有抑制作用，抑制中濃度（EC50）分別為422.711 2、401.699 5、446.910 7 μg·mL-1。顯微觀察顯示，甲殼胺處理后的腐霉菌絲膨大、扭曲，分枝增多，菌絲內部出現(xiàn)空泡化?；铙w組織法試驗結果表明，甲殼胺可以明顯抑制生姜莖基腐病的發(fā)生。田間防治試驗結果表明，甲殼胺可以明顯預防生姜莖基腐病的發(fā)生，從而提高生姜產量。

生姜；莖基腐病；形態(tài)特征；序列分析；甲殼胺；抑菌活性

山東省生姜栽培由來已久，近年來隨著生姜種植面積的不斷擴大，病害發(fā)生也呈上升趨勢，尤其是生姜莖基腐病的發(fā)生十分嚴重，給姜農帶來巨大的經(jīng)濟損失，已成為生姜生產中的主要病害之一。

1907年Butler首次報道絢麗腐霉（Pythium gracile）侵染可引起生姜莖基腐病的發(fā)生（Butler，1907）。截至目前，已發(fā)現(xiàn)的能引起生姜莖基腐病的腐霉病原菌有10余種，而關于該病的病原菌，國內外報道不盡一致。由于地理環(huán)境及氣候的差異，導致不同國家及地區(qū)間病原菌優(yōu)勢種類有較大差異（元菊丹，2011）。如瓜果腐霉（P.aphanidermatum）、巴特勒腐霉（P. butleri）、完整腐霉（P. complectens）、終極腐霉（P. ultimum）、群結腐霉（P. myriotylum）、鐘器腐霉（P. vexans）、禾生腐霉（P. graminicola）、刺腐霉（P. spinosum）和德里腐霉（P. deliense）等都可在國外不同國家和地區(qū)引起生姜莖基腐病的發(fā)生。國內生姜莖基腐病病原菌有瓜果腐霉（P. aphanidermatum）、喙腐霉（P. rostratum Butler.）、周雄腐霉（P. periilum Drechsler）、群結腐霉（P. myriotylum）、禾生腐霉（P.graminicola）和腐霉（P. monospermum）等（姜子德和戚佩坤，1992；李林 等，2009）。

生姜莖基腐病是典型的土傳病害和種子傳播病害，其無性繁殖體游動孢子可隨水流在土壤中傳播，與生姜根系或莖基接觸后侵入組織致其發(fā)病，而后迅速向上擴展蔓延，引起葉片黃化、葉枯乃至植株枯死。寄主發(fā)病后，在發(fā)病部位表面能產生大量孢子囊和游動孢子，可以進行多次再侵染（Ichitanit & Shinsu，1980；Davis，1991；Ravindren & Nirmal，2005）。目前防治莖基腐病的方法主要是化學防治，但是從環(huán)境安全和人類健康角度考慮，急需尋找安全有效的生物防治方法和途徑（Stirling，2009；Pandey，2010）。

甲殼胺，又名殼聚糖、脫乙酰甲殼質、可溶性甲殼質、幾丁聚糖、脫乙酰幾丁質、聚氨基葡糖，是一種天然多糖類高分子化合物，在自然界中廣泛存在。由于其生物相容性、無毒性、抗菌性、可生物降解等優(yōu)點，近年來在農業(yè)上的應用日趨廣泛（李牧，2007）。前人研究表明，甲殼胺對番茄葉霉病菌的孢子萌發(fā)和菌絲體生長均具有明顯抑制作用（李美芹，2007）；隨著濃度的提高，甲殼胺對櫻桃番茄腐敗菌的抑制作用增強（馬菲，2013）；甲殼胺作為激發(fā)子，可有效誘導植物抗病性，增強植物對病害的防御能力（許珍，2012）。本試驗通過形態(tài)學觀察、致病性測定及序列分析，對生姜莖基腐病病原菌進行鑒定；并采用菌絲生長速率法、活體組織法和田間試驗研究甲殼胺對生姜莖基腐病病原菌的抑菌活性，旨在為防治生姜莖基腐病和綠色藥劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種（Pythium myriotylum、Pythium spinosum、Pythium sylvaticum）分離于2015年安丘明顯感染莖基腐病的生姜姜塊上。

供試培養(yǎng)基：水瓊脂培養(yǎng)基（WA：100 mL無菌水中加入1 g瓊脂）；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、無菌水1 000 mL）；CMA培養(yǎng)基（玉米粒60 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL）；玉米粒VP3培養(yǎng)基（Ali-Shtayeh et al.，1986）；皮氏液〔Ca（NO3）20.4 g，KH2PO40.15 g，Mg（NO3）20.15 g，CaCl20.06 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃蒸汽滅菌15～20 min〕。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離及顯微鏡觀察 將采集的帶病姜塊用水沖洗干凈，用消毒醫(yī)用手術刀將發(fā)病姜塊病健交界處切成小塊，放入紗袋中，用流水沖洗12 h，取出組織小塊，用滅菌濾紙吸干表面水分后，置于WA培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長出新鮮菌絲及時用菌絲頂端分離技術分離數(shù)代后，得到單一菌種。

將得到的單一菌種置于CMA平板上，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)48 h，挑取邊緣菌絲塊轉入皮氏液，放置于25 ℃培養(yǎng)箱誘發(fā)培養(yǎng)。每隔1 h挑取菌絲在顯微鏡下對孢子囊、卵孢子、藏卵器及雄器進行觀察并照相。測量成熟的孢子囊、雄器、藏卵器及卵孢子大小。每項指標分別觀察測量200個，并計算其平均值（劉振偉和史秀娟，2009）。

根據(jù)余永年（1998）主編的《中國真菌志》（第六卷·霜霉目）的檢索表及描述，對菌絲體、孢子囊、雄器、藏卵器及卵孢子的形態(tài)特征、有關特性以及菌落形態(tài)等進行鑒定。

1.2.2 致病性測定 將玉米粒煮熟滅菌，在無菌操作臺中接種病原菌，25 ℃培養(yǎng)48 h，滅菌玉米粒長滿待測病原菌。將每1 kg滅菌土與50 g帶菌玉米粒混勻，對照用不接菌的玉米粒與滅菌土混勻，分別種入健康的姜塊。適時澆水，保持一定的土壤濕度。接種60 d后調查、記錄發(fā)病癥狀。

1.2.3 致病菌測序鑒定 用滅菌的解剖刀刮取PDA平板上的菌絲，放入研缽中，加入液氮迅速研磨。采用Biospin植物基因組DNA提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）提取供試菌株的DNA，用特異性引物ITS1和ITS4擴增，將擴增條帶經(jīng)過測序得到的rDNA-ITS序列與GenBank中已有的相關菌株的ITS序列進行同源比對。利用MEGA 5.2等相關生物學軟件進行序列比對，分析同源性，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 不同濃度甲殼胺的抑菌試驗 采用菌絲生長速率法測定甲殼胺對病原真菌腐霉菌的抑菌活性。將甲殼胺加入到45 mL滅菌PDA中配成不同濃度的培養(yǎng)基，搖勻、冷卻、接種。在25 ℃條件下培養(yǎng)并逐日觀察病原菌的生長情況。以不加藥劑為對照。待對照組菌落幾近長滿平板時，測量各處理菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。將各自數(shù)據(jù)分別帶入DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，得到EC50值。

1.2.5 甲殼胺對腐霉菌菌絲形態(tài)的影響 從培養(yǎng)2 d的腐霉菌菌落邊緣打取5 mm的試菌餅，接種于100 mL含0.4 mg·mL-1甲殼胺的液體PDA培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接5塊，每處理3次重復，以不含甲殼胺的PDA培養(yǎng)基為對照。于25 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，挑取菌絲體，顯微鏡觀察并照相。

1.2.6 田間防治試驗 田間試驗于2016年在安丘市景芝鎮(zhèn)孫家沙浯村進行，該地區(qū)2015年生姜莖基腐病發(fā)病率85%，幾乎絕產。試驗設3個處理：T1，每667 m2施棉隆30 kg，熏蒸25 d，揭膜翻晾10 d，旋耕前每667 m2施甲殼胺有機肥（濟南阿波羅公司，有機質＞45%，下同）200 kg作底肥，種前溝施有機肥100 kg，擺好姜種噴施養(yǎng)根素（甲殼胺60 g·L-1）1 L，之后分別于第1次、第2次澆水、小培土、大培土時施養(yǎng)根素1 L。小培土、大培土時分別施甲殼胺有機肥（濟南阿波羅公司）120 kg和80 kg。T2處理根據(jù)當?shù)厣锞食Ｓ檬┓史椒?，?67 m2施棉隆30 kg，熏蒸25 d，揭膜翻晾10 d，旋耕前施微生物菌劑凱迪瑞（含枯草芽孢桿菌2億個·g-1）160 kg作底肥。種前溝施微生物菌劑凱迪瑞80 kg、微生物菌擴培劑（寶地生-揚州博軒生物技術有限公司）4.8 kg。對照（CK）按照當?shù)厥┓柿晳T，每667 m2旋耕前施土雜肥3 m3、生物有機肥（益生元-京青中信科技有限公司）100 kg，種前溝施生物有機肥（益生元-京青中信科技有限公司）100 kg、0.5%阿維菌素顆粒劑1.2 kg以防治線蟲病害。2016年4月10日播種，小區(qū)面積50 m2，4次重復，順序排列。

收獲前調查生姜莖基腐病發(fā)病情況，每小區(qū)80株，計算病情指數(shù)和防治效果。生姜莖基腐病分級標準：0級，無癥狀；1級，1%～25%葉片有發(fā)病癥狀；2級，26%～50%葉片有發(fā)病癥狀；3級，51%～75%葉片有發(fā)病癥狀；4級，76%以上的植株倒伏、枯死。10月10日收獲，每小區(qū)收獲生姜6 m2，測產量。

2 結果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)特征

群結腐霉菌落在CMA培養(yǎng)基上無特定形態(tài)。菌絲發(fā)達，分枝，粗3.1～7.0 μm，平均為4.5 μm。孢子囊由膨大與不膨大菌絲共同組成，膨大部分呈指狀或裂瓣狀，頂生或間生，平均為216 μm×15 μm。藏卵器球形或近球形，平滑，頂生或間生，偶有2個串生，直徑20～31 μm，平均為25.2 μm。雄器棒狀或鉤狀，著生于分枝的雄器柄頂端，與藏卵器異絲生，以頂端與藏卵器接觸（圖1）。

林棲腐霉菌落在CMA培養(yǎng)基上呈放射狀，有氣生菌絲產生。菌絲較粗，直徑3.5～10.5μm。菌絲膨大體形態(tài)多樣，球形、檸檬形，間生或頂生，球形菌絲膨大體直徑為18.7～24.2 μm，平均為19.7 μm；檸檬形菌絲膨大體平均為17.9 μm×23.3 μm，不產生游動孢子。藏卵器光滑，多數(shù)間生。雄器異絲生，在接近藏卵器處形成二叉分枝。卵孢子不滿器（圖2）。

圖1 群結腐霉（Pythium myriotylum）的形態(tài)特征

圖2 林棲腐霉（Pythium sylvaticum）的形態(tài)特征

刺腐霉菌落在CMA培養(yǎng)基上呈放射狀。菌絲無隔，老熟菌絲有隔，發(fā)達，不規(guī)則分枝，菌絲粗4.1～7.3 μm。菌絲膨大體球形，頂生，間生或切生，頂生時偶見生于主干菌絲的短小分枝上，直徑10～32 μm，平均為18.7 μm，萌發(fā)產生芽管。藏卵器球形，間生或頂生，偶有切生，直徑13～25 μm，平均為19.2 μm。藏卵器上均勻分布指狀突起，突起物絕大多數(shù)直立，較少彎曲。雄器棍棒狀或彎棍棒狀，頂生，與藏卵器同絲生，較少異絲生，罕無柄，每個藏卵器有1～3個雄器。卵孢子球形，平滑，滿器，偶有不滿器的，直徑12～22 μm，平均為17.3 μm；壁厚0.9～1.7 μm，平均為1.49 μm，內含貯物球和折光體各1個（圖3）。

圖3 刺腐霉（Pythium spinosum）的形態(tài)特征

2.2 致病性測定

致病性測定結果表明，群結腐霉、刺腐霉、林棲腐霉對生姜均具有致病性。接種1個月后，生姜莖基部接種點周圍呈水漬狀，維管束變褐，莖基部縊縮，甚至倒伏，葉片發(fā)黃萎蔫，與田間自然發(fā)病植株癥狀類似。從根、莖基部病組織上重新分離的病原菌與田間植株上分離的病原菌的菌落、孢子囊、藏卵器等形態(tài)完全一致，結果符合Koch法則。

2.3 序列分析

將測序得到的rDNA-ITS序列與GenBank中已有的相關菌株的ITS序列進行同源比對，結果表明，分離到的菌株Q、C、L分別與群結腐霉（P.myriotylum）、刺腐霉（P. spinosum）、林棲腐霉（P.sylvaticum）的相似性最高，同源性可達100%。

從GenBank中下載不同種的腐霉菌ITS序列，采用MEGA軟件以Neighbor-Joining計算法，構建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）。從系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，C、L、Q分別與P. spinosum、P. sylvaticum、P. myriotylum在同一分枝上，同源關系較近。結合形態(tài)分析，可知C、L、Q分別為刺腐霉（P.spinosum）、林棲腐霉（P. sylvaticum）、群結腐霉（P.myriotylum）。

2.4 甲殼胺對3種腐霉菌的抑制作用

試驗結果表明（表1），甲殼胺對3種腐霉菌的抑制中濃度均在400～500 μg·mL-1之間，抑菌效果明顯。

2.5 甲殼胺對腐霉菌絲形態(tài)的影響

顯微照相觀察顯示，甲殼胺處理后的菌絲膨大、扭曲，分枝增多，菌絲內部出現(xiàn)空泡化（圖5），與Benhamou（1992）的描述一致。

圖4 基于ITS序列構建的腐霉菌系統(tǒng)發(fā)育進化樹

表1 甲殼胺對3種腐霉菌的抑制作用

2.6 田間防治試驗

從表2可以看出，T1（甲殼胺處理）對生姜莖基腐病的防治效果可達到98.02%，比對照增產51.14%；與T2處理相比，防治效果提高了3.23個百分點，產量增加了35.33%。表明甲殼胺可以預防生姜莖基腐病的發(fā)生，進而提高產量，而且對環(huán)境友好，有較高的投產使用優(yōu)勢。

圖5 甲殼胺對腐霉菌絲形態(tài)的影響（400×）

表2 安丘市景芝鎮(zhèn)生姜莖基腐病防治試驗

3 結論與討論

甲殼胺是一種天然多糖類高分子化合物，在自然界中廣泛存在，由于天然無毒、環(huán)境友好的特性，使得其在農業(yè)、醫(yī)藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提取及回收、生化和生物醫(yī)學工程等諸多領域的應用研究取得了重大進展。余雄偉（2011）研究發(fā)現(xiàn)，甲殼胺對細菌細胞膜的通透性有破壞作用，細菌核內物質滲漏，最終導致菌體死亡。王云光（2015）研究發(fā)現(xiàn)，低分子量的甲殼胺可降低真菌菌絲內麥角固醇的含量，并通過破壞細胞壁和細胞膜的完整性，進入細胞內部對細胞器造成破壞，導致細胞內容物的流失。荊迎軍等（2006）研究了10個分子量的甲殼胺對6種細菌的抑菌性，結果表明，甲殼胺的抑菌機理有可能是影響細胞膜的透性。

本試驗鑒定得到3種生姜莖基腐病病原菌：群結腐霉（Pythium myriotylum）、刺腐霉（Pythium spinosum）和林棲腐霉（Pythium sylvaticum）。通過室內菌絲生長抑制法和室外田間試驗測定了甲殼胺對腐霉菌的抑制作用，結果表明甲殼胺可使菌絲腫脹變形、分枝增多、菌絲內部出現(xiàn)空泡化，與前人的研究結果一致，但是甲殼胺對腐霉菌絲形態(tài)的影響機理還不夠完善，需做進一步研究。田間試驗中通過施用含甲殼胺的有機肥作基肥和追肥，同時在種植、澆水和培土時溝施甲殼胺表現(xiàn)出較好的防病增產效果，證明田間通過土壤熏蒸處理結合施用甲殼胺或微生物制劑，可以較好地控制生姜莖基腐病。本試驗還對安丘和昌邑的生姜莖基腐病地塊進行土壤含菌量測定，不發(fā)病地塊每克土壤含菌量為10～100個，重病地塊每克土壤含菌量為800～2 500個。表明腐霉菌含量越高，生姜莖基腐病發(fā)病就越重。甲殼胺對田間生姜莖基腐病的預防增產結果可能與甲殼胺抑制土壤中腐霉的含量有關。

綜上可知，新型生物農藥甲殼胺具有高效的抑菌效果，可有效減少生姜莖基腐病的發(fā)生，是防治生姜莖基腐病的優(yōu)秀生物替代制劑，具有良好的開發(fā)前景和工業(yè)生產潛力。

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Identification of Rhizome Rot Disease Pathogen in Ginger and Chitosan Antifungal Effect on Pathogen

HU Xian-mei1，2，LI Chang-song1*，CAO Ya-dong1，XU Zuo-ting1，ZHANG Yue-li1，QI Jun-shan1，MA Li-guo1，ZHANG Bo1，SUN Ming-wei3，RUI Fa-fu3
（1Institute of Plant Protection，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Plant Virology of Shandong Province，Jinan 250100，Shandong，China；2Plant Protection College，Shandong Agricultural University，Tai’an 271001，Shandong，China；3Jinan Apollo Chitosan Fertilizer Industry Co. LTD，Jinan 250101，Shandong，China）

This paper carried out identification on pathogen of rhizome rot disease in ginger by morphological observation，pathogenicity test and sequence analysis；and studied the antifungal activity of chitosan against ginger rhizome rot disease by mycelium growth rate method，in vivo biospy and field experiment. The results showed that the pathogen of ginger rot disease was identified as Pythium myriotylum，Pythium spinosum and Pythium sylvaticum，the mycelial growth of those pathogens were restrained by chitosan and the EC50values were 422.711 2，401.699 5，446.910 7 μg·mL-1，respectively. Micrography observation showed，while inoculated in the substrate with chitosan，the mycelia would abnormally grow，like：bulging，contorting，having more branches，and vacuolation appearing inside of mycelia. These results showed that chitosan could obviously inhibit the occurrence of rhizome rot disease in ginger. The results of field control experiment showed that chitosan could significantly prevent the occurrence of rhizome rot disease in ginger，and consequently improve the ginger yield.

Ginger；Rhizome rot disease；Morphological characteristics；Sequence analysis；Chitosan；Antifungal activity

胡鮮梅，女，碩士研究生，主要從事蔬菜病害研究，E-mail：xianmeihu@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：李長松，研究員，碩士生導師，主要從事植物病害與防治研究，E-mail：lics1011@sina.com

2017-04-26；接受日期：2017-06-23

國家重點研發(fā)計劃項目（2017YFD0201605），山東省農業(yè)重大應用技術創(chuàng)新項目，山東省農業(yè)科學院重大科技創(chuàng)新項目（2014CXZ07），山東省農機裝備研發(fā)創(chuàng)新計劃項目