血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞及其受體檢測(cè)的臨床意義

孔令環(huán),馬寅芙,呂作福,韓 梅,肖中平,高 鵬

(吉林省人民醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130021)

血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞及其受體檢測(cè)的臨床意義

孔令環(huán)*,馬寅芙,呂作福,韓 梅,肖中平,高 鵬

(吉林省人民醫(yī)院,吉林 長(zhǎng)春130021)

目的探討血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK(CD3-CD16+CD56+)細(xì)胞及其受體檢測(cè)的臨床意義。方法用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)18例正常對(duì)照及20例淋巴瘤、22例急性白血病、16例MDS病人外周血NK細(xì)胞占淋巴細(xì)胞百分比，NK細(xì)胞膜活化性受體NKG2D和抑制性受體NKG2A及穿孔素、顆粒酶的表達(dá)。結(jié)果(1)初治淋巴瘤和白血病組NK細(xì)胞數(shù)量顯著低于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MDS組與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)；(2)初治淋巴瘤組、白血病組、MDS組活化性受體NKG2D表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；淋巴瘤組、白血病組、MDS組抑制性受體NKG2A與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。(3)初治淋巴瘤組和白血病組的穿孔素、顆粒酶表達(dá)均顯著低于正常對(duì)照(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MDS組穿孔素、顆粒酶表達(dá)與對(duì)照組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論淋巴瘤、白血病病人免疫功能減低與NK細(xì)胞數(shù)量減少及NKG2D、穿孔素、顆粒酶表達(dá)減少有關(guān)，MDS病人免疫功能減低可能只與NKG2D表達(dá)減低有關(guān)。

惡性；淋巴瘤；白血?。患毙?；殺傷細(xì)胞，天然；受體；穿孔素；顆粒酶

(ChinJLabDiagn,2017,21:2079)

血液系統(tǒng)惡性腫瘤的主要發(fā)病機(jī)制是機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生紊亂，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)或清除異常細(xì)胞，而導(dǎo)致異常細(xì)胞惡性克隆性增殖并浸潤(rùn)其他器官或組織[1]。NK(CD3-CD16+CD56+)細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成成分，具有自然殺傷、分泌細(xì)胞因子、趨化因子、參與調(diào)節(jié)免疫的作用，在機(jī)體抗感染、抗腫瘤、清除衰老正常細(xì)胞和異己細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用[2-4]。本研究通過(guò)檢測(cè)外周血NK細(xì)胞數(shù)量及受體的表達(dá)，來(lái)探討NK細(xì)胞數(shù)量及功能的變化在血液系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象

選取本院2015年1月-2016年7月血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人58例為研究對(duì)象，其中初治白血病組22人，淋巴瘤組20人，MDS組16人。男32例，女26例，年齡22-75歲。其中急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL) 6例，急性髓細(xì)胞白血病(AML)16例；彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤10例，套細(xì)胞淋巴瘤6例，濾泡淋巴細(xì)胞淋巴瘤4例；MDS-RCMD3例，MDS-RAEB16例,MDS-RAEB27例；對(duì)照組18例，均為本院健康體檢者，男10例，女8例，年齡31-53歲。標(biāo)本的留取均獲得知情同意。

1.2試劑和儀器

單抗購(gòu)自BD公司，鼠抗人CD3-ECD、CD56-PC5、CD16-PC5 、CD159- PE(抑制性受體NKG2A)、CD314-FITC(活化性受體NKG2D)、granzymeβ-PE(顆粒酶β)、胞質(zhì)蛋白perforin-FITC(穿孔素)、溶血素、破膜劑、同型對(duì)照；流式細(xì)胞儀為美國(guó)貝克曼公司的多參數(shù)EPICS XL型流式細(xì)胞儀，應(yīng)用EXPO32ADCXL4 Color軟件分析，在FSC-SSC散點(diǎn)圖上選定淋巴細(xì)胞群，結(jié)果以百分率表示。

1.3方法受試者于清晨空腹采靜脈血2 ml，EDTA抗凝,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞的變化

見(jiàn)圖1。初診淋巴瘤組與白血病組病人外周血NK細(xì)胞表達(dá)減低，分別為(7.94±3.01)%、(9.98±6.04)%，與正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14.3±6.24)%，P<0.05]；MDS組病人外周血NK細(xì)胞數(shù)(14.73±7.7)%，與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(14.3±6.24)%，P>0.05]；治療后淋巴瘤組、白血病組、MDS組3組病人外周血NK細(xì)胞表達(dá)分別為(17.28±5.53)% 、(14.2±7.04)%、(16.9±4.68)% ，與正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(14.3±6.24)%，P>0.05]。

圖1 血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞數(shù)量的變化

2.2血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞膜活化性受體、抑制性受體表達(dá)

見(jiàn)圖2。初診淋巴瘤組、MDS組、白血病組病人外周血NK細(xì)胞膜活化性受體NKG2D表達(dá)均減低，分別為(40.52±11.23)%、(51.98±22.06)%、(45.04±27.81)%，與正常對(duì)照組均有顯著性差異[(66.97±14.32)%，P<0.05]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三組治療后NKG2D表達(dá)均增加，分別為(62.78±12.08)%、(65.3±11.26)%、(60.5±18.3)%，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異[(66.97±14.32)%，P>0.05]。

圖2 血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞膜活化性受體(NKG2D)表達(dá)

見(jiàn)圖3。初診淋巴瘤組、MDS組、白血病組3組病人外周血NK細(xì)胞膜抑制性性受體NKG2A表達(dá)分別為(22.75±9.39)%和(19.71±10.9)%，(17.97±12.26)%，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異[(20.0±9.75)%，P>0.05]。治療后三組NKG2A表達(dá)分別為(13.93±8.54)%和(13.71±9.9)%，(28.1±10.26)%，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異[(20.0±9.75)%，P>0.05]。

圖3 血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞膜抑制性受體(NKG2A)表達(dá)

2.3血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)穿孔素、顆粒酶-β表達(dá)

見(jiàn)圖4，圖5。初診淋巴瘤組和白血病組病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)穿孔素表達(dá)均減低，分別為(46.74±16.91)%和(54.65±29.61)%，與正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(71.98±13.41)%,P<0.05]；MDS組病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)穿孔素表達(dá)為(69.71±17.89)%，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異[(71.98±13.41)%，P>0.05]。治療后淋巴瘤組、白血病組、MDS組病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)穿孔素表達(dá)均增加，分別為(81.02±14.31)%、(64.2±25.12)%、(80.6±15.41)%，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異[(71.98±13.41)%，P>0.05]。

圖4 血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)穿孔素(perforin)表達(dá)

淋巴瘤組、白血病組病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)顆粒酶-β表達(dá)分別為(13.82±7.14)%和(26.59±21.88)%與正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(46.15±16.97)%,P<0.05]；MDS組病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)顆粒酶-β表達(dá)(36.87±10.31)%與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異[(46.15±26.97)%，P>0.05]；治療后淋巴瘤組、白血病組、MDS組病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)顆粒酶-β表達(dá)均增加，分別為(65.31±13.31)%、(29.91±20.48)%、(39.87±12.53)%，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異[(46.15±26.97)%，P>0.05]。

圖5 血液系統(tǒng)惡性腫瘤病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)顆粒酶-β(granzyme β)表達(dá)

3 討論

自然殺傷(NK)細(xì)胞是天然免疫應(yīng)答中關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤作用的第一道防線。在外周血中具有明顯的分布優(yōu)勢(shì),故對(duì)血液系統(tǒng)疾病的控制具有意義[5]。本研究通過(guò)對(duì)58例血液系統(tǒng)惡性腫瘤分析，發(fā)現(xiàn)MDS組病人外周血NK細(xì)胞數(shù)量與正常對(duì)照無(wú)顯著性差異；淋巴瘤組和白血病組病人外周血NK細(xì)胞數(shù)明顯減低，與正常對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，治療后NK細(xì)胞數(shù)量均明顯回升，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異。這一結(jié)果提示，經(jīng)過(guò)化療后淋巴瘤和白血病病人的免疫功能得到恢復(fù)。徐述[6]等報(bào)道，MDS患者NK細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組無(wú)明顯差異。鄭淑霞等[7]報(bào)道，淋巴瘤急性期和AML急性期NK細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組比有顯著差異；與本研究結(jié)果一致。

活化性受體NKG2D是NKG2家族中免疫活性最強(qiáng)的活化性受體，也是目前公認(rèn)的在抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用的受體，其表達(dá)水平幾乎決定了機(jī)體NK細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)弱，在抗腫瘤免疫中起重要作用[8]。沈亞娟等報(bào)道[9]，腫瘤患者NK細(xì)胞膜上的活化性受體NKG2D表達(dá)水平降低，而使NK細(xì)胞的殺傷功能受到抑制。武曉博等[10]報(bào)道，經(jīng)化療后，淋巴瘤組、急性白血病組、MDS組的活化性受體均明顯回升。本研究與報(bào)道一致，初診淋巴瘤組、白血病組、MDS組病人外周血NK細(xì)胞膜活化性受體NKG2D表達(dá)均減低，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后三組病人的NK細(xì)胞活化性受體NKG2D表達(dá)均增加，與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異。NK細(xì)胞通過(guò)抑制性受體特異性識(shí)別靶細(xì)胞表面的MHC I類分子并保護(hù)正常細(xì)胞不被殺傷，研究發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤組、白血病組、MDS組三組的NK細(xì)胞抑制性受體表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異，即NK細(xì)胞的識(shí)別能力沒(méi)變，但殺傷能力減低。因此，機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱不僅與NK細(xì)胞數(shù)量有關(guān)，更與活化性受體的表達(dá)有直接關(guān)系，活化性受體表達(dá)減低導(dǎo)致機(jī)體免疫功能減低或免疫功能紊亂，引起血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生。

NK細(xì)胞活化后，通過(guò)釋放穿孔素、顆粒酶-β等大量細(xì)胞毒性顆粒發(fā)揮自然殺傷功能，導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，初診淋巴瘤組和白血病組病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)穿孔素、顆粒酶-β表達(dá)均減低，與正常對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；治療后與正常對(duì)照無(wú)顯著性差異。MDS組病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)穿孔素、顆粒酶-β表達(dá)與正常對(duì)照組無(wú)顯著性差異；因此，考慮MDS病人免疫功能減低僅與NK細(xì)胞的活化性受體NKG2D表達(dá)減低有關(guān)。而淋巴瘤、白血病病人免疫功能減低不僅與NK細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)，還與NKG2D、穿孔素、顆粒酶表達(dá)減少有關(guān)。由于急性白血病病人和淋巴瘤病人外周血NK細(xì)胞胞質(zhì)穿孔素、顆粒酶表達(dá)均減低，使得腫瘤細(xì)胞獲得免疫逃避而過(guò)度增殖，浸潤(rùn)組織器官，這可能是急性白血病來(lái)勢(shì)兇猛及淋巴瘤容易浸潤(rùn)骨髓等臟器的原因之一。

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ClinicalsignificanceofnaturalkillcellanditsreceptorinperipheralbloodofpatientswithHematologicMalignant

KONGLing-huan,MAYin-fu,LüZuo-fu,etal.

(JilinProvinceHospital,Changchun130021,China)

ObjectiveTo study the clinical significance of NK(CD3-CD16+CD56+) cell and its receptor in peripheral blood of hematologic malignant.MethodsBy flow cytometry，the percentage of NK cell in peripheral blood lymphocytes was detected in 20 lymphoma,22 acute leukemia，16 MDS and 18 healty adults.NK cell activation receptor (NKG2D),inhibitory receptor (CD159),perforin and granzyme of patients were also detected.Results(1)The percentage of NK cell in newly diagnosed lymphoma group and acute leukemia group was significantly lower than those of normal controls(P<0.05).But it had no significant in MDS group than that of normal controls(P>0.05).(2)The expression of NKG2D were significantly lower than those of normal controls(P<0.05) in the newly diagnosed lymphoma groups,acute leukemia group and MDS group.But the expression of NKG2A among the 3 groups had no significant than that of normal controls(P>0.05).(3)The expression of perforin and granzyme both in the newly diagnosed lymphoma group and acute leukemia group were significantly lower than those of normal controls(P<0.05).But the MDS group had no significant than that of normal controls(P>0.05).ConclusionThe cellular immune is suppressed in lymphoma and acute leukemia patients.That was correlated with the lower expression of NK cell,activation receptor (NKG2D),inhibitory receptor (CD159),perforin and granzyme.Perhaps that was only correlated with the lower expression of NKG2D about MDS patients.

malignancy;lymphoma;Leukemia;acute;killer cells ，natural;receptor;perforin;granzyme

吉林省科技廳項(xiàng)目20150101145JC

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2079-04

R331.4

A

2017-01-15)