原位雜交與免疫組化技術用于評價化療后結直腸癌患者MLH1、MSH2和hMSH6表達水平的對比研究

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(中山大學附屬中山醫(yī)院病理科 528403)

·臨床醫(yī)學·

原位雜交與免疫組化技術用于評價化療后結直腸癌患者MLH1、MSH2和hMSH6表達水平的對比研究

羅教秀，儲兵，曹曉珊，黃志偉，吳師珍，杜娟*

(中山大學附屬中山醫(yī)院病理科 528403)

目的探討原位雜交方法和免疫組化方法兩種不同方法在檢測評價直腸癌術后新輔助化療治療后患者三種錯配修復蛋白(hMLH1、hMSH2和hMSH6)表達水平的效果。方法選取本院收治的散發(fā)性結直腸癌(SCRC)患者260例，取手術切除的腫瘤組織，使用較原位雜交和免疫組化法測定hMLH1、hMSH2和hMSH6表達水平的效果，比較三種指標之間的關聯(lián)性。結果不同部位的腫瘤各種特征之間未見明顯差別。原位雜交法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6的陽性率顯著高于免疫組化檢測的陽性率；免疫組化法檢測結果提示hMLH1與hMSH2的表達無明顯相關性，hMLH1或hMSH2與hMSH6表達分別呈正相關;原位雜交法檢測結果提示hMLH1與hMSH2，hMLH1與hMSH6，hMSH2與hMSH6表達均呈正相關。結論原位雜交法和免疫組化方法兩種方法在檢測評價直腸癌術后輔助化療后患者三種錯配修復蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6表達水平的效果中原位雜交法更優(yōu)。

原位雜交； 免疫組化； 結直腸癌； 錯配修復基因蛋白

錯配修復基因(mismatch repair gene,MMR)蛋白的表達缺失常見于散發(fā)性的結直腸癌(sporadic colorectal carcinoma,SCRC)患者中，該病的發(fā)生、發(fā)展過程均可能存在潛在的關聯(lián)，對于MMR蛋白在SCRC中表達的具體狀態(tài)以及其與臨床病理參數(shù)之間的相互關聯(lián)，尚鮮有研究涉及，而此類相關研究的結論將大大增加人們對于SCRC生物學行為的認識，以及對其發(fā)病機制的深入探索[1-3]。免疫組化技術已經(jīng)是檢驗界非常成熟和常用的方法之一，這種方法雖常用，但也存在著許多問題,如?？梢娕R床上出現(xiàn)HE切片比較典型而免疫組化卻提示陰性的案例；近年來發(fā)展起來的原位雜交技術是利用堿基配對原理，結合組織化學和免疫組織化學的檢測技術的檢測方法，顯示出自己的優(yōu)勢[4-6]。本研究通過免疫組化法和原位雜交兩種方法分別對SCRC腫瘤組織中3種MMR蛋白(hMLH1、hMSH2和hMSH6)的表達狀態(tài)進行測定，然后進行比較評價,希望有助于為SCRC患者制定個體化的化療方案，并未判斷患者預后提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料選取本院2013年至2015年間收治的SCRC患者260例，其中男140例，女120例；平均年齡(62.7±11.2)歲；腫瘤部位：本研究中腫瘤右半結腸的患者有75例，位于左半結腸90例，直腸腫瘤患者98例；從組織分化程度角度來看：高分化腺癌患者共計20例，中分化腺癌共165例，低分化及黏液性腺癌78例；從淋巴結轉移角度統(tǒng)計：研究中轉移陽性病例149例，轉移陰性114例。全部患者未進行過放化療，手術切除腫瘤組織固定后石蠟包埋備用。全部患者知情同意。

1.2材料與方法研究中使用試劑均為上海長嘉生物科技有限公司，即用型hMLH1鼠抗人單克隆抗體工作液(W-0721)、即用型hMSH2鼠抗人單克隆抗體工作液(W-0722)和即用型hMSH6鼠抗人單克隆抗體工作液(W-0723)。免疫組化測定使用Benchmark XT自動染色儀系統(tǒng)，手工滴定運行方式(手工加抗體)完成,Olympus Dp70圖像采集分析儀完成研究中的行圖像獲取工作。原位雜交檢測(ISH)法檢測使用石蠟切片脫蠟后，置于0.8%胃蛋白酶鹽酸混合液中,37 ℃水浴箱消化10 min，使用TBS洗5 min，乙醇脫水然后室溫干燥。98 ℃變性10 min后冰浴退火,再置于37 ℃水浴箱中雜交1h，雖有TBS洗在洗滌5 min，共3次，滴加堿性磷酸酶標記的地高辛抗體后,室溫放置0.5 h，洗滌兩次后加BCIP/NBT并于暗處顯色,然后使用0.3%核固紅襯染,常規(guī)脫水后透明封片。

1.3判斷標準結果判斷標準：hMLH1、hMSH2、hMSH6三種蛋白的表達陽性均定位于細胞核內(nèi)，所以本研究中依據(jù)染色強度和陽性細胞率來進行計算評分[4-6]。以在200倍的視野下隨機的10個視野為計數(shù)對象,記數(shù)每個視野中正常黏膜以及腫瘤細胞的染色情況。染色強度的評價見于0分：無染色,1分：弱染色,2分：中等染色,3分：強染色。陽性細胞率:0為<1%；1為<25%；2為<50%；3為<75%；4為≥75%。最后以染色強度與陽性細胞率之和作為評分:0～2分：陰性,3～5分：陽性,6～7分：強陽性。評價過程采取雙盲法。

1.4統(tǒng)計分析應用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用兩個(或多個)樣本率比較的χ2檢驗；計量資料使用t檢驗或方差分析完成；相關性分析采用Spearman等級相關分析，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學差異。

2 結 果

2.1原位雜交法與免疫組化法檢測指標陽性情況如見表1所示，與免疫組化(IHC)檢測各指標的陽性率比較，原位雜交法(ISH)檢測hMLH1，hMSH2，hMSH6的陽性率較高，分別為65.00%，63.46%，61.54%。

表1 原位雜交和免疫組化檢測三種指標的陽性率對比

與IHC方法比較:b:P<0.01

2.2兩種方法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6表達陽性的相關性分析分別使用兩種檢測方法得出的三種指標的檢測陽性率結果，然后分別進行三種指標之間的相關性分析，使用免疫組化法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC腫瘤組織中表達陽性率的相關分析。結果提示，hMLH1與hMSH2的表達無明顯相關性(rs=0.07，P=0.263)，hMLH1與hMSH6表達呈正相關(rs=0.45，P<0.01)，hMSH2與hMSH6表達呈正相關(rs=0.37，P=0.004);而是用原位雜交法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6在SCRC腫瘤組織中表達陽性率的相關分析結果提示hMLH1與hMSH2的表達呈正相關(rs=0.10，P=0.033)，hMLH1與hMSH6表達呈正相關(rs=0.56，P<0.01)，hMSH2與hMSH6表達呈正相關(rs=0.63，P<0.01)(見表2)?；颊?，男，54歲典型病例圖片見圖1～2。

表2 兩種方法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6表達陽性的相關性分析對比

a:P<0.05,b:P<0.01

圖1 免疫組化法測定結直腸癌患者(200×) A:MLH1,B:MSH2,C:hMSH6

圖2 原位雜交法測定結直腸癌患者(200×) A:MLH1,B:MSH2,C:hMSH6

3 討 論

結直腸癌在我國的發(fā)病患病近年來顯著增加，且有年輕化趨勢，明確疾病發(fā)生發(fā)展的規(guī)律對于診斷治療作用重大，對于診治工作能夠真正有的放矢具有重要意義。有研究提示錯配修復基因的種系突變，以及突變所引起的微衛(wèi)星穩(wěn)定性欠佳都可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展存在潛在聯(lián)系[7-9]，本研究中使用免疫組織化學方法對hMLH1、hMSH2、hMSH6三個主要的錯配修復基因蛋白的表達情況進行測定,比較指標之間的相互聯(lián)系，進而間接判斷SCRC腫瘤組織中該基因的突變情況，結果提示，使用免疫組化法檢測SCRC腫瘤組織中hMLH1、hMSH2、hMSH6的表達陽性率，通過相關分析發(fā)現(xiàn)，hMLH1與hMSH2的表達無顯著相關性，而hMLH1與hMSH6的表達呈正相關關系，hMSH2與hMSH6的表達也呈正相關;同時應用原位雜交方法進行同期測定，結論相似，且原位雜交法更為精準。本研究中，陽性率分析結果提示原位雜交法檢測hMLH1的陽性率為65.00%，顯著高于免疫組化檢測的陽性率，檢測hMSH2和hMSH6的陽性率也表現(xiàn)為原位雜交法的陽性率高于免疫組化檢測的陽性率，這些結果均提示原位雜交法具有較高的可信度和準確度。究其原因，主要與原位雜交技術的原理相關，其探針是根據(jù)堿基配對原則來完成檢測的，檢測過程中因為僅與靶基因序列雜交，所以探針—靶核酸的結合力要強于抗原—抗體的結合力,因此在一定程度上減少了免疫組化方法中容易出現(xiàn)的假陽性和假陰性問題。另一方面，原位雜交法使用福爾馬林固定組織，不會與蛋白產(chǎn)生交聯(lián)作用,所以DNA和mRNA蛋白質(zhì)所受的影響也相對都比較小，而免疫組化方法中組織因為使用福爾馬林固定而容易產(chǎn)生蛋白交聯(lián),對實驗結果的影響就會比較大。從操作層面上來說原位雜交法也相對更具優(yōu)勢，該方法具有耗時更少，而且操作更方便和安全的優(yōu)勢特征[10-11]。

綜上，原位雜交法和免疫組化方法兩種不同方法在檢測評價直腸癌術后新輔助化療治療后患者三種錯配修復蛋白hMLH1、hMSH2和hMSH6表達水平的效果中原位雜交法更優(yōu)，值得臨床推廣。

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AcomparisonofinsituhybridizationandimmunohistochemistryinevaluatingtheexpressionofMLH1,MSH2andhMSH6incolorectalcancerpatientsafterchemotherapy

LUO Jiaoxiu,CHU Bing,CAO Xiaoshan,et al

(DepartmentofPathology;ZhongshanHospitalAffiliatedtoZhongshanUniversityGuangzhou528403,Guangdong,China)

ObjectiveTo evaluate the expression of three mismatch repair proteins (hMLH1,hMSH2 and hMSH6) in neoadjuvant chemotherapy patients after rectal cancer resection by two different methods of in situ hybridization and immunohistochemistry.Methods260 patients suffered from sporadic colorectal carcinoma(SCRC) admitted to our hospital were studied.The expression of hMLH1,hMSH2 and hMSH6 were detected by in situ hybridization and immunohistochemistry,the correlation of hMLH1,hMSH2 and hMSH6 was compared.ResultsThere was no significant difference in the tumor characteristics of different parts.The rate of positive expression of hMLH1,hMSH2 and hMSH6 detected by in situ hybridization was significantly higher than that of immunohistochemistry,respectively (P<0.01).The immunohistochemistry result showed that there was no correlation between hMLH1 and hMSH2 expression,but hMLH1 or hMSH2 was positively correlated with hMSH6 expression,respectively.The expressions of hMLH1,HMSH2 and hMSH6 detected by in situ hybridization were positively correlated among the SCRC tumor tissues.ConclusionIn situ hybridization and immunohistochemistry are two best methods to evaluate the expression of three mismatch repair proteins hMLH1,hMSH2 and hMSH6 in postoperative neoadjuvant chemotherapy patients after rectal cancer.

in situ hybridization; immunohistochemistry; colorectal cancer; mismatch repair gene protein

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.02.010

2016-10-08；

2017-03-09

*通訊作者，E-mail：luojiaoxiuqa@sina.com.

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秦旭平)