組學(xué)技術(shù)在氨基酸生產(chǎn)菌株選育中的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢

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(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457)

組學(xué)技術(shù)在氨基酸生產(chǎn)菌株選育中的研究現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢

張權(quán)威1，林高揚1，馬倩1,2,3

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300457；3.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室，天津 300457)

系統(tǒng)生物學(xué)研究手段包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和通量組學(xué)等，可以獲得研究對象整體代謝途徑、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的信息.將組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于氨基酸的發(fā)酵菌株優(yōu)化過程，可以為菌株的進一步代謝工程改造提供信息基礎(chǔ)與理論指導(dǎo).介紹各種組學(xué)技術(shù)在氨基酸微生物發(fā)酵研究中的應(yīng)用與發(fā)展趨勢，通過綜合運用各種組學(xué)數(shù)據(jù)信息，可以更好地指導(dǎo)氨基酸發(fā)酵優(yōu)良菌株的理性設(shè)計與構(gòu)建.

氨基酸；組學(xué)；代謝工程；理性設(shè)計；高產(chǎn)菌株

氨基酸具有重要的代謝與調(diào)控功能，它們不僅是很多重要物質(zhì)合成的必要前體物質(zhì)，而且可以調(diào)節(jié)關(guān)鍵代謝途徑與過程，是人體生命活動所必需物質(zhì)，因而被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品、保健品和飼料等行業(yè)[1-2].2016年，我國氨基酸總產(chǎn)量460 萬噸，預(yù)計2017將超過500 萬噸.2016年，我國谷氨酸鈉(味精)總產(chǎn)量270 萬噸，賴氨酸總產(chǎn)量135 萬噸，蘇氨酸總產(chǎn)量48 萬噸，另外色氨酸、丙氨酸和三支鏈氨基酸產(chǎn)能均已超過萬噸以上，其他氨基酸綜合產(chǎn)能約在10 萬噸左右[3].氨基酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法、水解法、酶法以及微生物發(fā)酵法.其中，微生物發(fā)酵法以其高效性、低成本和低污染等優(yōu)勢獲得迅速發(fā)展，成為目前大多數(shù)氨基酸工業(yè)生產(chǎn)的重要方法[4].

早期，氨基酸生產(chǎn)菌株的產(chǎn)能提高與性能優(yōu)化主要采用多輪隨機誘變篩選的方式.然而，由于誘變具有隨機性，基因組發(fā)生不確定改變，因而在沒有突變株基因信息的條件下，很難再對誘變獲得的高產(chǎn)菌株進行進一步的代謝改造.近年來，隨著代謝工程與合成生物學(xué)的發(fā)展，基因的定向改造技術(shù)得到廣泛應(yīng)用，通過對微生物DNA的重組，獲得理想的基因型以及表型，這種方法使得研究者對菌株的改造更加理性化[5].然而，定向改造策略仍然具有一定的局限性，位點改造的范圍通常是局部的，而非基因組范圍，通常缺乏對整個代謝網(wǎng)絡(luò)的考慮.系統(tǒng)生物學(xué)研究手段包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)和通量組學(xué)等，可以獲得研究對象整體代謝途徑、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的信息[6].將組學(xué)應(yīng)用于氨基酸的發(fā)酵菌株優(yōu)化過程[7]，可以為進一步的代謝工程改造提供信息基礎(chǔ)與理論指導(dǎo)[8].通過綜合考慮整個代謝與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、中游的發(fā)酵過程以及下游的提取純化過程，實現(xiàn)改造目標(biāo)的選定[5]，進一步通過代謝工程改造獲得高產(chǎn)菌株.

1 氨基酸的微生物發(fā)酵

1956年，Kinoshita等[9]發(fā)現(xiàn)谷氨酸棒狀桿菌Corynebacteriumglutamicum是L-谷氨酸的高效生產(chǎn)菌株，從此開啟了L-谷氨酸的微生物發(fā)酵歷程.隨后，L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-異亮氨酸、L-蘇氨酸、L-天門冬氨酸和L-丙氨酸等大多數(shù)氨基酸都開始運用Corynebacteria進行發(fā)酵生產(chǎn)，因而棒狀桿菌在氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域有著舉足輕重的地位[7].除棒狀桿菌以外，大腸桿菌Escherichiacoli也是一種常用的氨基酸生產(chǎn)菌株，主要用來生產(chǎn)L-苯丙氨酸、L-色氨酸等芳香氨基酸及L-蘇氨酸、L-脯氨酸等非芳香族氨基酸[10].

目前，國際上氨基酸生產(chǎn)的強國主要是日本和德國.日本的味之素、協(xié)和發(fā)酵以及德國的德固沙是世界氨基酸生產(chǎn)的三大巨頭.我國是世界上的氨基酸生產(chǎn)大國，谷氨酸產(chǎn)量居世界首位，賴氨酸產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的50%左右[2].目前，我國已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的氨基酸品種有谷氨酸、賴氨酸、谷氨酰氨、蘇氨酸、色氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和丙氨酸等[3].在這些氨基酸中，除了組氨酸、絲氨酸和半胱氨酸尚未采用發(fā)酵法進行工業(yè)生產(chǎn)，其他氨基酸均可通過微生物發(fā)酵生產(chǎn).但是，目前我國在菌株生產(chǎn)能力、生產(chǎn)技術(shù)與工藝方面，與日本、德國仍然存在較大的差距.因此，進行菌株性能優(yōu)化獲得高產(chǎn)菌株，改進生產(chǎn)工藝，仍然是目前我國氨基酸生產(chǎn)領(lǐng)域亟待解決的重要問題.

2 組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展

各種不同的組學(xué)研究可選用的技術(shù)手段如圖1所示.隨著1980年首個噬菌體基因組測序的完成，基因組學(xué)開始了迅速的發(fā)展.第二代測序儀(NGS，如Ⅲumina 454，ABI SOLiD sequencer等)和第三代測序儀(TGS，如HeliScope)的開發(fā)，逐步取代了傳統(tǒng)的Sanger測序法，使得測序的準(zhǔn)確性與精確性有了顯著提高，同時測序周期與測序成本大大下降.目前，羅氏公司致力于開發(fā)的納米孔測序技術(shù)將促使新一代測序技術(shù)的開發(fā).豐富的基因組數(shù)據(jù)信息是后續(xù)進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)以及通量組學(xué)研究的基礎(chǔ).20世紀(jì)90年代中期以來，微陣列技術(shù)(Microarray)被用于大規(guī)?；虮磉_分析，自此展開了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究.基于Sanger測序法的SAGE(Serial analysis of gene expression)技術(shù)以及MPSS(Massively parallel signature sequencing)技術(shù)逐漸得到應(yīng)用.隨著新一代測序儀的開發(fā)，轉(zhuǎn)錄組mRNA的高通量測序逐漸展開，成為一種流行的轉(zhuǎn)錄組分析方法.

圖1 組學(xué)研究的技術(shù)方法Fig.1 The technical method of omics

蛋白組學(xué)的發(fā)展，始于1975年O’Farrell[11]開發(fā)的二維凝膠電泳技術(shù).該技術(shù)是一種經(jīng)典的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，被認(rèn)為是蛋白組學(xué)研究的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[12].20世紀(jì)90年代，隨著基因組測序技術(shù)、現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)、計算能力和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，蛋白組學(xué)也得到了飛速發(fā)展，實現(xiàn)了通過二級質(zhì)譜圖(MS/MS)進行肽段的鑒定.同時，越來越多的研究圍繞定量蛋白組學(xué)展開，一系列新型的蛋白質(zhì)定量方法涌現(xiàn)，包括iTRAQ，cICAT，SILAC和Label-free等[13].從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)到蛋白組學(xué)的研究是一種自上而下(top-down)的研究策略，逐步從基因水平過渡到蛋白功能水平研究.代謝組與通量組信息獲取的途徑，主要包括GC-MS，NMR，LC-MS和13C標(biāo)記等.代謝組學(xué)可以從功能水平反映細(xì)胞活力，與細(xì)胞的表型有最直接的聯(lián)系[14].通過代謝水平分析，可以實現(xiàn)上游基因型與下游表型的連接，進行自下而上(bottom-up)的研究，而它們的結(jié)合研究，可以為代謝工程改造提供信息基礎(chǔ)與方向指導(dǎo)，使得人們對研究對象的改造更加理性化，具有方向性.

3 氨基酸發(fā)酵中組學(xué)研究的現(xiàn)狀

3.1 基因組學(xué)

誘變篩選是氨基酸優(yōu)良生產(chǎn)菌株選育的一種常用方法，經(jīng)過多輪誘變篩選過程可以獲得具有優(yōu)良性狀的菌株，但是如果想更進一步地提高高產(chǎn)菌株的生產(chǎn)能力往往會受到瓶頸制約.若要突破這種制約，需要獲得突變高產(chǎn)菌株的代謝、調(diào)控信息，以及它們發(fā)生的突變信息[15].基因組學(xué)作為一種高通量的現(xiàn)代測序手段，可以從上游基因水平尋找突變株與原始菌株之間的差異，而這些差異很可能是菌株高產(chǎn)的原因.同時，獲得的突變株基因信息可以使人們更加全面地認(rèn)識突變株的代謝與調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信息，這是設(shè)計新的代謝工程改造方案的必要基礎(chǔ).此外，基因組學(xué)獲得的基因組信息是轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組以及通量組研究開展的基礎(chǔ)，通過其他組學(xué)的研究，可以進一步為代謝與調(diào)控網(wǎng)路的重構(gòu)提供更加豐富的補充信息.

Kalinowski等[15]首先對具有代表性的野生菌株C.glutamicumATCC 13032進行了全基因組測序，并將基因組信息應(yīng)用于L-天冬氨酸衍生類氨基酸合成的研究.目前，C.glutamicum的基因組信息在高產(chǎn)菌株的構(gòu)建中已經(jīng)發(fā)揮出重要的作用.Ohnishi等[16]通過賴氨酸高產(chǎn)菌株與原始菌株的基因組序列比對后發(fā)現(xiàn)高絲氨酸脫氫酶基因(hom)、天冬氨酸激酶基因(lysC)和丙酮酸羧化酶基因(pyc)的突變可能對賴氨酸的高產(chǎn)起作用.于是，他們將這些突變引入原始菌株中，提高了原始菌株的L-賴氨酸產(chǎn)量；隨后，通過進行基因組比對，又進一步在高產(chǎn)菌株中引入有利突變gnd(6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因)，使L-賴氨酸產(chǎn)量提高了15%[17]；最后，又引入了mqo突變(蘋果酸：喹啉氧化還原酶基因)，進一步提高了L-賴氨酸的生產(chǎn)速度與產(chǎn)量[18].全基因組測序技術(shù)還可被用于發(fā)現(xiàn)基因新功能以及新的代謝途徑，Mchardy等[19]通過基因組分析以及實驗驗證，在C.glutamicum中發(fā)現(xiàn)了參與支鏈氨基酸與L-苯丙氨酸合成的11 種潛在的氨基轉(zhuǎn)移酶基因.此外，通過基因組水平分析、靶基因刪除以及同源互補等研究，使得C.glutamicum中L-甲硫氨酸的合成途徑逐漸清晰.

3.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)

通過比較不同菌株、不同時間點樣品或者不同培養(yǎng)條件下的轉(zhuǎn)錄組變化，可以發(fā)現(xiàn)可能的調(diào)控路徑、基因改造靶點等，進而為菌株的進一步改造與優(yōu)化提供信息指導(dǎo).C.glutamicum中谷氨酸的大量合成需要刺激因子引發(fā)，如生物素亞適量控制，添加青霉素和表面活性劑等.Stansen等[20]發(fā)現(xiàn)一株可以被溫度變化誘導(dǎo)谷氨酸大量合成的谷氨酸棒狀桿菌C.glutamicum2262，同時獲得了一株不生產(chǎn)谷氨酸的突變株C.glutamicum2262NP，通過對比分析這兩株菌的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)在溫度發(fā)生變化時，C.glutamicum2262中NCg12816，NCg12817兩個基因(分別對應(yīng)乳酸通透酶、L-乳酸脫氫酶)的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高.在谷氨酸的生產(chǎn)過程中，會產(chǎn)生副產(chǎn)物L(fēng)-乳酸，后續(xù)的研究表明，NCg12817基因編碼的L-乳酸脫氫酶對C.glutamicum在L-乳酸中正常生長起關(guān)鍵作用.Hayashi等[21]通過比較賴氨酸工業(yè)生產(chǎn)菌株C.glutamicumB-6與其原始出發(fā)菌株的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)C.glutamicumB-6具有磷酸戊糖途徑基因的高表達、TCA循環(huán)基因的低表達以及氨基酸合成基因的誘導(dǎo)表達.他們的研究發(fā)現(xiàn)亮氨酸氨基肽酶編碼基因(leuC)是一種有利突變，于是被引入到另一株L-賴氨酸生產(chǎn)菌株AHD-2中，最終產(chǎn)量提高了14%.Sindelar等[22]采用DNA芯片技術(shù)，比較分析賴氨酸生產(chǎn)菌株MH20-22B以及其他幾株C.glutamicum的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)NCg10855，amtA-ocd-soxA操縱子對賴氨酸生產(chǎn)有重要的作用，通過對其進行過表達，賴氨酸產(chǎn)量可以提高40%.Park等[23]首先利用文獻報道的代謝調(diào)控信息構(gòu)建了生產(chǎn)L-纈氨酸的E.coli，又進一步解除了產(chǎn)物抑制，然后通過比較改造菌株與對照菌株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并結(jié)合原位基因敲除模擬獲得的信息，進行了進一步的代謝工程改造，最終獲得了可將每克葡萄糖轉(zhuǎn)化為0.378 g L-纈氨酸的L-纈氨酸高產(chǎn)菌株.近年來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)在氨基酸生產(chǎn)菌株的系統(tǒng)代謝工程改造(Systems metabolic engineering)中發(fā)揮著越來越重要的作用[24]，通過比較改造菌株與出發(fā)菌株的轉(zhuǎn)錄組差異，獲得進一步改造的位點，可提高氨基酸的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率.

3.3 蛋白組學(xué)

細(xì)胞內(nèi)的大部分代謝活動都是直接或者間接受蛋白質(zhì)調(diào)控，因而對細(xì)胞蛋白組的分析，可以更好地了解細(xì)胞代謝狀態(tài).隨著現(xiàn)代蛋白質(zhì)分離與鑒定技術(shù)的發(fā)展，可被鑒定的蛋白質(zhì)種類越來越多.由于提取、分離等過程的蛋白損失，對蛋白組的鑒定不如基因組、轉(zhuǎn)錄組全面，但是通過對不同條件下的蛋白組進行差異分析，即可發(fā)現(xiàn)差異表達的蛋白，進而發(fā)現(xiàn)不同條件下蛋白表達及調(diào)控蛋白的差異.

目前，對C.glutamicum的蛋白組研究主要包括三個方面：1) 菌株蛋白譜圖的繪制；2)C.glutamicum在環(huán)境刺激(氮缺失、芳香化合物、重金屬、有機酸[25]和高滲透壓[26]等)下的蛋白組機制研究；3) 高產(chǎn)菌株與原始菌株的蛋白組比較.1998年，Hermann等[27]首次繪制了C.glutamicum的蛋白組譜圖，采用二維凝膠電泳分離，利用銀染技術(shù)顯色，共分離1 000多種胞漿蛋白與700多種膜蛋白，并利用N-末端測序的方法鑒定了10 種蛋白質(zhì).隨后，他們又將MALDI-TOF-MS以及ESI-MS技術(shù)用于C.glutamicum的蛋白鑒定[28].Bendt等[29]采用兩種方法構(gòu)建了C.glutamicum的磷酸化蛋白組譜圖.Schluesener等[30]構(gòu)建了C.glutamicum的膜蛋白組譜圖.在C.glutamicum的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，氮缺失會造成細(xì)胞中一系列氨基酸，包括精氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和芳香族氨基酸等的合成基因表達下調(diào)[31].因而，氮代謝調(diào)控的研究具有重要的價值，一系列針對此過程的蛋白組學(xué)研究也相繼展開.其中，Bendt等[29]從磷酸化蛋白組角度研究了氮缺失對C.glutamicum的影響.在碳源代謝方面，Qi等[32]比較了C.glutamicum在芳香化合物(苯甲酸鹽、對甲酚、苯酚、間苯二酚和龍膽酸)與葡萄糖中生長的蛋白組.研究結(jié)果表明：芳香化合物降解的中間代謝產(chǎn)物主要通過糖異生途徑進入中心碳代謝，糖異生途徑的增強是C.glutamicum在芳香化合物中得以生長的必需過程.由于細(xì)胞膜會受到芳香化合物的影響，Haussmann等[33]比較了在苯甲酸鹽、葡萄糖條件下C.glutamicum的膜蛋白組，揭示了在苯甲酸鹽條件下出現(xiàn)的兩種苯基酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白BenK與BenE的共表達、中心碳代謝與能量代謝調(diào)節(jié)以及饑餓反應(yīng)等現(xiàn)象.此后，又比較了在原兒茶酚、葡萄糖碳源條件下C.glutamicum的蛋白組[34]，發(fā)現(xiàn)GlxR與McbR調(diào)節(jié)子對原兒茶酚條件下菌株的適應(yīng)性調(diào)節(jié)有關(guān)鍵作用.

在異亮氨酸的微生物合成中，生產(chǎn)1 mol/L異亮氨酸需要消耗4 mol/L的NADPH[35]，因而保證細(xì)胞內(nèi)一定的NADPH濃度是異亮氨酸獲得高產(chǎn)的關(guān)鍵因素.江南大學(xué)Shi等[35]通過在C.glutamicumJHI3-156中分別過表達POS5基因(編碼外源NADH激酶)與zwf-ppnK基因(編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-多聚(P)/ATP-NAD激酶)，異亮氨酸的產(chǎn)量分別提高了26%和31%.為了解析POS5與zwf-ppnK過表達對異亮氨酸合成的整體影響，比較分析了過表達菌株與原始菌株的蛋白組[36].他們的研究發(fā)現(xiàn)了一種新的肌醇代謝途徑，同時表明了回補途徑在異亮氨酸生產(chǎn)中的重要性.Kedar等[37]通過敲除E.coli中編碼丙酮酸激酶的pyK-F基因，獲得了高產(chǎn)芳香氨基酸的菌株.通過比較此高產(chǎn)菌株與原始菌株的蛋白組，發(fā)現(xiàn)敲除pyK-F基因的菌株在芳香氨基酸合成途徑中的一系列蛋白表達顯著提高，同時說明磷酸烯醇式丙酮酸與赤蘚糖-4-磷酸在芳香氨基酸合成過程中有重要作用.

3.4 代謝組學(xué)

代謝組學(xué)是對細(xì)胞內(nèi)所有代謝物的定量分析，通常利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀等儀器進行檢測，采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘(PLS)等多元統(tǒng)計方法進行數(shù)據(jù)分析.2004年，Strelkov等[38]首次構(gòu)建了C.glutamicum代謝組檢測的方法，共檢測到1 000多種化合物，其中164 種物質(zhì)得到鑒定.Plassmeier等[39]運用代謝組學(xué)手段對C.glutamicum中的中心碳代謝以及2-甲基檸檬酸循環(huán)途徑進行了研究.Woo等[40]將代謝組學(xué)研究方法應(yīng)用于C.glutamicum在磷缺失條件下的代謝狀況研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在磷缺失的條件下，C.glutamicum通過增強自身的糖原代謝來適應(yīng)該條件下的碳代謝要求.此外，代謝組學(xué)在氨基酸優(yōu)良生產(chǎn)菌株的高通量篩選以及高產(chǎn)菌株的構(gòu)建與性能研究中也發(fā)揮了重要的作用.B?rner等[41]運用96孔板培養(yǎng)C.glutamicum，并采用了高通量代謝組分析的方法，該方法一天可以測定72 組樣品，并且具有較高的靈敏度與可重復(fù)性.這種方法的建立，使得通過大規(guī)模測定突變株文庫的代謝組篩選優(yōu)勢菌株得以實現(xiàn).隨后，對258 株轉(zhuǎn)座子突變株文庫進行了高通量代謝組分析，通過對代謝物進行成對關(guān)系比較分析，篩選了特定代謝途徑改變的突變株.Bartek等[42]通過刪除磷酸葡糖異構(gòu)酶基因pgi，使得C.glutamicum生產(chǎn)L-纈氨酸的產(chǎn)量提高了36%.通過比較pgi基因刪除菌株與原始菌株之間的代謝組，發(fā)現(xiàn)pgi基因刪除后，胞內(nèi)NADPH產(chǎn)生途徑相關(guān)的代謝物含量(包括葡萄糖-6-磷酸、6-磷酸葡萄糖酸、檸檬酸和異檸檬酸等)有明顯提高，說明了NADPH供應(yīng)對L-纈氨酸生產(chǎn)有重要作用.在賴氨酸的生產(chǎn)中，同樣需要充足的NADPH來源，因此可通過pgi基因的刪除增強NADPH的供應(yīng).此外，有研究報道檸檬酸合成酶(CS)活性的下降可以增加酮戊二酸的積累，進而可以實現(xiàn)L-賴氨酸的高產(chǎn).Van等[43]通過等位基因無痕置換技術(shù)構(gòu)建了一些列CS活力逐漸降低的C.glutamicum菌株，并對這些菌株進行了代謝組比較，發(fā)現(xiàn)這些菌株中天冬氨酸半縮醛的含量有顯著提高，而天冬氨酸半縮醛可以進一步轉(zhuǎn)化為賴氨酸，因此這些菌株具有進一步提高賴氨酸產(chǎn)量的潛在能力.基于這一推測，又進一步過表達了賴氨酸合成的若干基因，最終進一步提高了賴氨酸產(chǎn)量.

3.5 通量組學(xué)

通量組學(xué)，又稱代謝流分析，是對細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)中流量的定量分析，即對細(xì)胞內(nèi)酶與代謝途徑活力的定量分析，可以動態(tài)反映基因改造、環(huán)境變化對細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，因此可以為菌株的選育提供重要信息.目前，通量組學(xué)主要采用基于同位素標(biāo)記、GC-MS的方法進行測定.

近年來，通量組學(xué)在氨基酸生產(chǎn)菌株選育方面表現(xiàn)出越來越重要的作用.Bartek等[44]利用13C標(biāo)記的方法對丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC)缺陷的L-纈氨酸生產(chǎn)菌株進行了代謝流分析.結(jié)果表明：與野生型菌株相比，PDHC的缺失使細(xì)胞中PPP的代謝流增強了113%左右，這與賴氨酸合成對NADPH的需求相契合.Kind等[45]通過敲除C.glutamicum中succinyl-CoA合成酶基因sucCD，將TCA循環(huán)與賴氨酸合成中的琥珀?；种緩今詈掀饋?，使得更多的琥珀酰輔酶A用于賴氨酸合成.通過比較分析敲除sucCD前后菌株的通量組，確認(rèn)了途徑的耦合提高了賴氨酸的產(chǎn)量.此外，通量組學(xué)通過提供細(xì)胞內(nèi)動態(tài)的代謝通量信息，為菌株的insilico模擬提供了有效信息，在此基礎(chǔ)上可以有效預(yù)測細(xì)胞中特定基因敲除或過表達后的代謝情況.

4 氨基酸發(fā)酵中組學(xué)應(yīng)用的發(fā)展趨勢

各種組學(xué)手段，包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝物組學(xué)以及通量組學(xué)等，可以分別從DNA、mRNA、蛋白質(zhì)、代謝物以及代謝流水平對研究對象進行闡釋，它們在各自的研究層面展現(xiàn)著豐富的生物信息.在氨基酸的微生物發(fā)酵研究過程中，組學(xué)已經(jīng)表現(xiàn)出了重要的作用.但是單獨組學(xué)的研究仍然存在一定的局限性：大量的代謝物難以用一種提取、分離和檢測手段進行分析，并且存在著結(jié)構(gòu)鑒定的困難；由于未測序物種基因數(shù)據(jù)庫的缺失導(dǎo)致蛋白鑒定困難，蛋白質(zhì)提取分離造成的蛋白損失導(dǎo)致鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量有限；大量基因組冗余數(shù)據(jù)的存在，導(dǎo)致注釋困難等.這些問題的存在，使得獲取的信息難免會存在缺失與片面性，這種不完整性會在進行各種組學(xué)數(shù)據(jù)整合分析時，出現(xiàn)結(jié)果沖突、變化多向性等結(jié)果，使得對體系的解析更加困難.如何整合這些不同層次的組學(xué)數(shù)據(jù)，實現(xiàn)數(shù)據(jù)的上下關(guān)聯(lián)和不同組學(xué)研究方法之間的信息互補，是從整體上把握研究體系的重要內(nèi)容.

在氨基酸生產(chǎn)菌株C.glutamicum的研究中，組學(xué)的結(jié)合運用已經(jīng)進行了一些嘗試.Kr?mer等[46]綜合運用轉(zhuǎn)錄組、代謝組以及通量組，對賴氨酸生產(chǎn)菌株C.glutamicum進行了研究.Buchinger等[47]結(jié)合蛋白組與轉(zhuǎn)錄組分析，找到了C.glutamicum中氮素調(diào)節(jié)子AmtR作用的新靶點.Silberbach等[31]運用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組研究了C.glutamicum在氨鹽缺失條件下的代謝途徑變化.Yoon等[48]則利用轉(zhuǎn)錄組與蛋白組對高密度培養(yǎng)條件下的E.coli進行了研究.但是，他們的研究結(jié)果中仍然有很多不同組學(xué)來源的數(shù)據(jù)沒有得到有效利用，這主要是由生物樣品的復(fù)雜性造成的.如何能利用生物信息學(xué)分析，應(yīng)用新型的多元統(tǒng)計工具，從大量的數(shù)據(jù)中挖掘出有用的生物信息，是跨組學(xué)研究的重要目標(biāo)，也是組學(xué)在氨基酸的微生物發(fā)酵方面發(fā)揮更大作用的關(guān)鍵.綜合自上而下、自下而上的研究策略(圖2)，將各種組學(xué)綜合研究結(jié)果應(yīng)用于指導(dǎo)高產(chǎn)菌株的理性設(shè)計構(gòu)建，將是未來氨基酸微生物發(fā)酵研究的發(fā)展趨勢.

圖2 組學(xué)研究方法與代謝工程關(guān)系圖 Fig.2 The relationship between omics research methods and metabolic engineering

5 結(jié) 論

利用組學(xué)研究手段可獲得菌種的代謝途徑、調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的信息，為氨基酸生產(chǎn)菌株的代謝改造提供研究思路，為相關(guān)菌種的理性設(shè)計與構(gòu)建提供更明確的理論指導(dǎo).目前，組學(xué)研究迅速發(fā)展并與多項領(lǐng)域相結(jié)合.通過使用各種組學(xué)研究手段及數(shù)據(jù)分析方法，將進一步提高氨基酸生產(chǎn)菌株的選育與改造效率.同時，組學(xué)研究的相關(guān)方法可進一步推廣至更多領(lǐng)域，為其他領(lǐng)域的研究提供參考.

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Researchstatusanddevelopmenttrendofomicstechnologiesinscreeningaminoacidsproductionstrains

ZHANG Quanwei1, LIN Gaoyang1, MA Qian1,2,3

(1.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 2.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China; 3.Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture, Tianjin 300457, China)

Omics technology, including genomics, transcriptomics, metabolomics, proteomics, etc, can be used to acquire the whole metabolic pathway information and regulatory network information of the research objects. The application of omics technology to the optimization of amino acid fermentation provides important theoretical guidance for further metabolic engineering of microorganisms with enhanced production of target products. This paper introduces the application and development trend of omics techniques applied in microbial fermentation of amino acids, which is conducive to the rational design and construction of excellent amino acid production strains.

amino acid; omics; metabolic engineering; rational design; high-yield strains

2017-04-24

工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室暨天津市工業(yè)微生物重點實驗室(天津科技大學(xué))主任基金項目(2016IM104)；天津科技大學(xué)青年教師創(chuàng)新基金(2016LG11)；天津市大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201710057094)

張權(quán)威(1993—)，男，河南周口人，碩士研究生，研究方向為氨基酸發(fā)酵組學(xué)分析，E-mail: zquanweiyx@126.com. 通信作者：馬倩講師，E-mail: qianma1987@tust.edu.cn.

TQ92

A

1674-2214(2017)04-0205-07

朱小惠)