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    黃色短桿菌ilvBN和ilvC基因定點(diǎn)突變對(duì)L-纈氨酸發(fā)酵的影響

    2017-12-23 05:11:26,,,
    發(fā)酵科技通訊 2017年4期
    關(guān)鍵詞:纈氨酸黃色定點(diǎn)

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    (廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,河北 廊坊 065001)

    黃色短桿菌ilvBN和ilvC基因定點(diǎn)突變對(duì)L-纈氨酸發(fā)酵的影響

    宮衛(wèi)波,王海雷,程國(guó)平,趙津津

    (廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,河北 廊坊 065001)

    以黃色短桿菌MH-1000為出發(fā)菌株,使用PCR技術(shù)克隆ilvBN與ilvC基因,對(duì)ilvBN進(jìn)行定點(diǎn)突變,獲得解除L-纈氨酸對(duì)乙酰羥酸合酶反饋抑制突變型基因ilvBN′.對(duì)基因ilvC進(jìn)行點(diǎn)突變,獲得乙酰羥酸變位酶突變基因ilvC′.通過(guò)重疊延伸PCR方法,將基因片段ilvBN′和ilvC′拼接為ilvBN′C′,進(jìn)而連接至穿梭載體pXMJ19獲得重組質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′.該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至出發(fā)菌株獲得工程菌株MH-1032.50 L分批補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果顯示:MH-1000發(fā)酵72 h L-纈氨酸質(zhì)量濃度為35.2 g/L,MH-1032發(fā)酵72 h L-纈氨酸質(zhì)量濃度為38.4 g/L,增長(zhǎng)9.1%,糖酸轉(zhuǎn)化率從21.7%提高到25.8%.

    L-纈氨酸;乙酰羥酸合酶;乙酰羥酸變位酶;黃色短桿菌

    L-纈氨酸作為增味劑、添加劑,應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域.L-纈氨酸是人體必需八種氨基酸之一.工業(yè)上主要使用發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸,所用菌種以棒桿菌為主.一般通過(guò)增強(qiáng)L-纈氨酸代謝通路關(guān)鍵酶、限速酶的表達(dá)[1-2],阻斷或者減弱支路代謝[3-4],改變細(xì)胞膜對(duì)底物和產(chǎn)物透性,增強(qiáng)細(xì)菌對(duì)糖等底物的耐受,抑制終產(chǎn)物分解[5-7]等方法提高L-纈氨酸產(chǎn)量.另外優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基配方、改善發(fā)酵工藝也可提高L-纈氨酸產(chǎn)量[8-9].徐慶陽(yáng)等[10]以黃色短桿菌(B.flavum)XV0505(Leu-+Ile-+2-TAr+α-ABr+SGr)在10 L小罐中發(fā)酵72 h,最高產(chǎn)L-纈氨酸53.4 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為26.7%.張偉國(guó)等[11]通過(guò)誘變篩選出了XQ-8(Leulα+ABhr+2-TAhr+AHVhr),搖瓶產(chǎn)酸達(dá)66 g/L.但是以誘變?yōu)榛A(chǔ)的菌株篩選效率比較低,現(xiàn)基本被基因工程手段替代.

    筆者采用對(duì)ilvBNC進(jìn)行定點(diǎn)突變的方法,解除了L-纈氨酸對(duì)乙酰羥酸合酶(AHAS)的反饋抑制,同時(shí)經(jīng)過(guò)定點(diǎn)突變,將乙酰羥酸變位酶(AHAIR)的輔酶NADPH改為NADH,搖瓶發(fā)酵產(chǎn)L-纈氨酸19.5 g/L,比突變前提高16.8%;50 L發(fā)酵罐產(chǎn)L-纈氨酸38.4 g/L,比突變前提高9.1%.

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    大腸桿菌transT1(北京全式金生物技術(shù)有限公司),黃色短桿菌MH-1000(α-ABhr+2-TAhr+AHVhr),廊坊梅花生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司保藏菌種.

    大腸桿菌-棒桿菌穿梭質(zhì)粒pXMJ19,本實(shí)驗(yàn)所使用的菌株及載體詳見(jiàn)表1.

    表1 本實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids in this experiment

    1.2 試劑及設(shè)備

    限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶,MBI Fermentas公司;Fast pfu DNA polymerase,TransStart FastTaq DNA polymerase,TransStart FastPfu DNA polymerase,DNA Marker,dNTPs等,北京全氏金生物技術(shù)有限公司;質(zhì)粒小量提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、基因組提取試劑盒,北京天根生化科技有限公司;引物合成及測(cè)序送交英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司完成;往復(fù)式搖床、恒溫培養(yǎng)箱、PCR儀、電泳-凝膠成像系統(tǒng)等;SBA生物傳感儀,山東省科學(xué)院微生物研究所;50 L發(fā)酵罐,上海百侖生物科技有限公司.

    1.3 培養(yǎng)基

    LB培養(yǎng)基:氯化鈉10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,121 ℃滅菌20 min.

    黃色短桿菌搖瓶及50 L小罐發(fā)酵培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)[11].LBHIS(LB with brain heart infusion and sorbitol)用于電轉(zhuǎn)化后恢復(fù)培養(yǎng),BHI(Brain heart lnfusion medium)感受態(tài)細(xì)胞培養(yǎng)等培養(yǎng)基配制參考文獻(xiàn)[12-13].

    黃色短桿菌斜面培養(yǎng)基LBG:LB培養(yǎng)基+0.5%葡萄糖,NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,121 ℃滅菌20 min.

    黃色短桿菌種子培養(yǎng)基:葡萄糖25 g/L,尿素2.5 g/L,玉米漿40 g/L(氨基氮1.0%~1.3%,波美度19.5~22),KH2PO41 g/L,MgSO40.5 g/L,NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,121 ℃滅菌20 min.

    黃色短桿菌50 L發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖50 g/L,玉米漿15 g/L,KH2PO41 g/L,MgSO40.5 g/L,NaOH調(diào)節(jié)pH至 7.0,121 ℃滅菌20 min.

    1.4 發(fā)酵以及數(shù)據(jù)測(cè)定

    搖瓶發(fā)酵條件:搖床轉(zhuǎn)速170 r/min,發(fā)酵溫度33 ℃,時(shí)間72 h.發(fā)酵結(jié)束后加水定容至20 mL;吸取菌液0.1 mL,使用0.5 mol/L鹽酸稀釋至5 mL,分光光度計(jì)測(cè)量OD562;取1 mL菌液至1.5 mL的EP管中,12 000 r/min離心2 min,安捷倫液相色譜測(cè)定L-纈氨酸產(chǎn)量;吸取1.5 mL EP管中10 μL上清液至990 μL去離子水中,SBA生物傳感儀測(cè)定發(fā)酵液剩余葡萄糖;50 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件,樣品測(cè)定參考文獻(xiàn)[11].

    1.5 感受態(tài)細(xì)胞制備及其他分子操作

    大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備參考文獻(xiàn)[14],MH-1000感受態(tài)細(xì)胞制備參考文獻(xiàn)[15-16].基因組提取、質(zhì)粒提取、酶切和連接等按照試劑盒或說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作.引物設(shè)計(jì)參照黃色短桿菌ATCC14067相關(guān)基因(表2),并添加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基.

    1.6 ilvBN定點(diǎn)突變

    提取黃色短桿菌基因組,使用引物ilvBN-F和ilvBN-R經(jīng)PCR獲得ilvBN.以ilvBN為模板,分別使用ilvBN-F,ilvBN-IR和ilvBN-IF,ilvBN-R擴(kuò)增兩個(gè)基因片段ilvB和ilvN.

    利用重疊延伸PCR的方法,以ilvBN-F,ilvBN-R為引物,等摩爾濃度的ilvB,ilvN為模板PCR,TransStart FastTaq DNA polymerase,TransStart FastPfu DNA polymerase混合酶,體積比1∶10,體系50 μL包括:10 μL 5×Primer star buffer (Mg2+plus),4 μL的dNTP混合物(各2.5 mmol/L),引物各1 μL,混合酶1 μL,模板ilvB和ilvN適量,補(bǔ)水至50 μL.PCR條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,以上30 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min.PCR結(jié)束后獲得定點(diǎn)突變的ilvBN′.

    表2 本實(shí)驗(yàn)中所用引物1)Table 2 Primers in this experiment

    注:1) 表中帶有下劃線的堿基表示突變位點(diǎn).

    回收上步中PCR產(chǎn)物后,連接T載體pEASYTM-T5,獲得pEASYTM-T5-ilvBN′,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌;使用M13為鑒定引物測(cè)序鑒定,提取質(zhì)粒pEASYTM-T5-ilvBN′經(jīng)Hind III與EcoR I酶切,回收ilvBN′片段,與相同酶切回收的pXMJ19連接,構(gòu)建pXMJ19-ilvBN′.

    轉(zhuǎn)化pXMJ19-ilvBN′至大腸桿菌,平板培養(yǎng),挑單菌落進(jìn)行搖瓶過(guò)夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒作為模板,以pX-F和pX-R為引物進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定;鑒定完畢獲得陽(yáng)性克隆后,提取質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′轉(zhuǎn)化MH-1000,轉(zhuǎn)化條件、培養(yǎng)基配方參考文獻(xiàn)[12-13],以pX-F和pX-R為引物進(jìn)行PCR測(cè)序鑒定篩選陽(yáng)性克隆.

    1.7 ilvC定點(diǎn)突變

    提取黃色短桿菌基因組為模板,以ilvNC-F和ilvNC-R為引物PCR獲得ilvNC;以ilvNC為模板,分別使用ilvNC-F,ilvC-IR和ilvC-IF,ilvNC-R為引物擴(kuò)增兩個(gè)基因片段ilvNCF和ilvCR.

    利用重疊延伸PCR的方法,以ilvNC-F,ilvNC-R為引物,等摩爾濃度的ilvNCF和ilvCR為模板進(jìn)行PCR,獲得定點(diǎn)突變ilvC′,連接T載體pEASYTM-T5,構(gòu)建pEASYTM-T5-ilvC′,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,24 h長(zhǎng)出菌落后,挑單菌落或搖瓶過(guò)夜培養(yǎng)后提質(zhì)粒作為模板,T載體自帶引物M13進(jìn)行PCR鑒定,測(cè)序,序列正確可用于ilvBN′C′的重疊延伸PCR.

    1.8 ilvBN′與ilvC′連接、轉(zhuǎn)化

    以ilvBN-F和ilvN-R為引物,ilvBN′為模板,擴(kuò)增出ilvBN′F;以ilvNC-F和ilvC-R為引物,ilvC′為模板,擴(kuò)增出ilvC′R.

    回收上步驟中ilvBN′和ilvC′R基因片段,以ilvBN′F與ilvC′R為模板,以ilvBN-F和ilvC-R為引物,PCR擴(kuò)增形成ilvBN′C′,條件基本同1.6.體系50 μL:包括10 μL 5×Primer star buffer(Mg2+plus),4 μL的dNTP混合物(各2.5 mmol/L),引物各1 μL,混合酶1 μL,模板ilvBN′和ilvC′R適量,補(bǔ)水至50 μL.PCR條件為:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸1.5 min,以上30 個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,連接T載體pEASYTM-T5,形成pEASYTM-T5-ilvBN′C′,使用M13引物、Hind III與EcoR I雙酶切進(jìn)行鑒定,鑒定陽(yáng)性克隆測(cè)序.

    搖瓶過(guò)夜培養(yǎng)測(cè)序正確的大腸桿菌,提取質(zhì)粒pEASYTM-T5-ilvBN′C′,使用Hind III與EcoR I酶切,回收ilvBN′C′片段后,連接同樣酶切回收的pXMJ19,構(gòu)建質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌,長(zhǎng)出菌落后挑單菌落為PCR模板,以pX-F和pX-R為引物進(jìn)行PCR進(jìn)行擴(kuò)增,測(cè)序驗(yàn)證為陽(yáng)性克隆后,提取質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′轉(zhuǎn)化MH-1000,再次以pX-F和pX-R為引物,以轉(zhuǎn)化后菌株為模板進(jìn)行PCR,測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆.

    1.9 分批補(bǔ)料

    50 L發(fā)酵罐發(fā)酵條件:接種量10%,通風(fēng)比1 vvm,攪拌轉(zhuǎn)速200~500 r/min,溫度31 ℃,25%氨水流加調(diào)節(jié)pH至7.0,流加650 g/L高濃度葡萄糖補(bǔ)充碳源,控制溶氧30%~50%,發(fā)酵液葡萄糖質(zhì)量濃度1~2 g/L.

    2 結(jié) 果

    2.1 ilvBN的定點(diǎn)突變及轉(zhuǎn)化

    將ilvBN從MH-1000菌株基因組上擴(kuò)增,使用重疊延伸PCR方法進(jìn)行定點(diǎn)突變,將AHAS小亞基別構(gòu)中心的3個(gè)氨基酸做如下替換Gly20Asp,Ile21 Asp和Ile22 Phe,相應(yīng)的的核苷酸GGAATCATT定點(diǎn)突變成GATGACTTT,解除了L-纈氨酸對(duì)AHAS的反饋抑制(圖1),獲得定點(diǎn)突變基因.質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′模板,以pX-F,pX-R為引物PCR驗(yàn)證如圖2所示,ilvBN′大小約為2.5 kb(基因大小2 413 bp)左右(泳道2).構(gòu)建的pXMJ19-ilvBN′C′經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切,有兩條片段(泳道4),質(zhì)粒片段pXMJ19約為6.6 kb(質(zhì)粒6 601 bp),驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性,獲得MH-1031.

    圖1 ilvBN基因定點(diǎn)突變位點(diǎn)及其上下游序列測(cè)序圖譜Fig.1 Site-directed mutation of ilvBN and related sequences

    圖2 質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′的PCR及酶切驗(yàn)證Fig.2 Validation of pXMJ19-ilvBN′C′ through PCR and endonuclease digestion

    2.2 ilvC的定點(diǎn)突變

    將ilvC從MH-1000菌株基因組中PCR擴(kuò)增,對(duì)照本基因序列中氨基酸表達(dá)偏好性設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變堿基(核苷酸5′-TCCCAGAACCTCCGCGATTCTGGCGTTGAGGTTGTCATT GGTCTGCG-3′),用重疊延伸PCR方法定點(diǎn)突變成5′-GGCCAGAACCTCCGCGATTCT GGCGTTGAGGTTGTCA TTGGTGAGTT-3′,即氨基酸替換為Ser34Gly,Leu48Glu和Arg49Phe.這樣ilvC編碼酶的輔酶從NADPH變?yōu)镹ADH,獲得ilvC′,如圖3所示.

    2.3 ilvBN′C′基因片段的拼接驗(yàn)證

    以質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′為模板,pX-F,pX-R為引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證,如圖4所示,獲得的條帶3.5 kb(泳道2:基因大小3 610 bp)左右.質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′經(jīng)Hind III和EcoR I雙酶切,理論獲得3 610 bp和6 551 bp的條帶,分別為ilvBN′C′和pXMJ19質(zhì)粒片段(圖4),獲得條帶分別與所述相符.使用純化的ilvBN′C′的PCR產(chǎn)物測(cè)序,獲得序列除了堿基突變之外,與ATCC14067序列一致,用Vector NTI 11軟件繪制質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′圖譜,如圖5所示.

    圖3 ilvC基因定點(diǎn)突變位點(diǎn)及其上下游序列測(cè)序圖譜Fig.3 Site-directed mutation of ilvC and related sequences

    圖4 質(zhì)粒pXMJ19-ilvBN′C′的PCR及酶切驗(yàn)證Fig.4 Validation of pXMJ19-ilvBN′C′ through PCR and endonuclease digestion

    圖5 構(gòu)建的pXMJ19-ilvBN′C′質(zhì)粒圖譜Fig.5 Plasmid profile of pXMJ19-ilvBN′C′

    2.4 基因工程菌的產(chǎn)L-纈氨酸情況

    將已構(gòu)建的pXMJ19-ilvBN′和pXMJ19-ilvBN′C′分別轉(zhuǎn)化至MH-1000后,獲得MH-1031和MH-1032,通過(guò)20 mL/500 mL三角燒瓶和50 L發(fā)酵罐驗(yàn)證3 批次,發(fā)酵時(shí)間72 h,往復(fù)式搖床振幅5 cm,170 r/min,50 L發(fā)酵OD和L-纈氨酸見(jiàn)圖6.

    搖瓶發(fā)酵初始產(chǎn)酸16.7 g/L,MH-1031產(chǎn)L-纈氨酸18.2 g/L,比出發(fā)菌增長(zhǎng)9.0%,MH-1032產(chǎn)L-纈氨酸19.5 g/L,比出發(fā)菌增長(zhǎng)16.8%,比MH-1031增長(zhǎng)7.1%;

    50 L發(fā)酵罐發(fā)酵測(cè)試顯示(圖6):MH-1031/pXMJ19-ilvBN′,MH-1032/pXMJ19-ilvBN′C′生長(zhǎng)比MH-1000緩慢,是由于高表達(dá)質(zhì)粒所致;發(fā)酵過(guò)程葡萄糖控制1~2 g/L(曲線未給出);出發(fā)菌MH-1000經(jīng)72 h發(fā)酵產(chǎn)L-纈氨酸35.2 g/L,MH-1031經(jīng)72 h產(chǎn)37.3 g/L,比出發(fā)菌增長(zhǎng)6.0%,MH-1032經(jīng)72 h產(chǎn)L-纈氨酸38.4 g/L,比出發(fā)菌高9.1%,比MH-1031高2.9%(表3).

    圖6 分批發(fā)酵OD和產(chǎn)酸曲線Fig.6 The curve of OD and L-val in batch of fermentation

    菌株/質(zhì)粒L?纈氨酸(搖瓶)質(zhì)量濃度/(g·L-1)增長(zhǎng)率/%L?纈氨酸(50L罐)質(zhì)量濃度/(g·L-1)增長(zhǎng)率/%50L發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率/%出發(fā)菌MH?100016.735.221.7MH?1031/pXMJ19?ilvBN′18.29.037.36.023.3MH?1032/pXMJ19?ilvBN′C′19.516.838.49.125.8

    3 結(jié) 論

    50 L分批補(bǔ)料發(fā)酵結(jié)果顯示:出發(fā)菌株MH-1000 72 h產(chǎn)L-纈氨酸35.2 g/L,MH-1032 72 h產(chǎn)L-纈氨酸38.4 g/L,比出發(fā)菌株增長(zhǎng)9.1%.對(duì)L-纈氨酸代謝通路的ilvBN,將AHAS小亞基別構(gòu)中心的3 個(gè)氨基酸定點(diǎn)突變?yōu)镚ly20Asp,Ile21 Asp和Ile22 Phe,能夠完全解除3 種支鏈氨基酸對(duì)AHAS的反饋抑制作用[7].一分子葡萄糖通過(guò)EMP途徑產(chǎn)生兩分子丙酮酸作為合成L-纈氨酸的底物,而一分子葡萄糖通過(guò)HMP途徑,通過(guò)多種酶作用,脫掉一分子碳生成五碳糖,產(chǎn)生的丙酮酸少于EMP途徑.EMP途徑甘油醛-3-磷酸脫氫酶的輔酶為NADH,HMP途徑的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的輔酶為NADPH.NADH輔酶的序列特征是GXGXXGXXXG(X代表一種氨基酸),而NADPH輔酶序列特征是GXGXXAXXXA,改變ilvC的氨基酸序列為Ser34Gly,Leu48Glu和Arg49Phe[1],AHAIR能夠利用NADH作為輔酶代替NADPH,通過(guò)降低對(duì)NADPH的依賴以降低戊糖磷酸途徑的物料消耗,相對(duì)較高濃度的NADH有助于反應(yīng)向終產(chǎn)物L(fēng)-纈氨酸方向進(jìn)行,進(jìn)而增加L-纈氨酸產(chǎn)量.

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    Site-directedmutagenesisofilvBNandilvCinBrevibacteriumflavumforimprovedproductionofL-valine

    GONG Weibo, WANG Hailei, CHENG Guoping, ZHAO Jinjin

    (MeiHua Biotech(Langfang) Co., Ltd., Langfang 065001, China)

    Brevibacteriumflavum1000 was used as the original strain and site-specific mutagenesis was performed in itsilvBNgene, resulting in an anti-feedback inhibition geneilvBN′. The geneilvC′ encoding acetohydroxyacid isomeroreductase was obtained by site-directed mutagenesis fromilvC. The geneilvBN′C′ was obtained by overlap extension PCR fromilvBN′ andilvC, and then inserted intoE.coli-B.flavumshuttle expression vector pXMJ19 to construct a recombinant plasmid pXMJ19-ilvBN′C′. The recombinant plasmid was subsequently transformed intoB.flavumMH-1000, resulting in the strain MH-1032. The results from fed-batch fermentation experiments in 50 L fermenter indicated that the L-valine productivity of MH-1032 (38.4 g/L) was increased by 9.1% in contrast to that of MH1000 (35.2 g/L) in 72 hours, and the conversion of glucose to L-val increased from 21.7% to 25.8%.

    L-valine;Brevibacteriumflavum; acetohydroxyacid synthase; acetohydroxyacid isomeroreductase

    2017-08-02

    宮衛(wèi)波(1979—),男,河北邯鄲人,碩士,研究方向?yàn)樯锘瘜W(xué)與分子生物學(xué),E-mail:gongweibo@meihuagrp.com.

    TQ922

    A

    1674-2214(2017)04-0228-05

    朱小惠)

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