微生物醛酮還原酶結(jié)構(gòu)、功能及其在生物催化中的應(yīng)用

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(1.浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

微生物醛酮還原酶結(jié)構(gòu)、功能及其在生物催化中的應(yīng)用

史麗珍1,2，應(yīng)彬彬1,2，王亞軍1,2

(1.浙江省生物有機(jī)合成技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310014；2.浙江工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

微生物醛酮還原酶(AKR)作為醛酮還原酶超家族的重要構(gòu)成之一，廣泛存在于自然界的各種微生物中，可對(duì)一系列天然和非天然的底物進(jìn)行代謝.通常，微生物AKR是大小約為37 kDa的單體蛋白，具有典型的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)和保守的輔酶結(jié)合區(qū)域.微生物AKR是NAD(P)H依賴型氧化還原酶，遵循由催化四聯(lián)體Asp-Tyr-Lys-His推動(dòng)的強(qiáng)制順序反應(yīng)機(jī)制.許多微生物AKR被應(yīng)用于不同的生物轉(zhuǎn)化中，主要包括木糖醇、維生素C前體2-酮-L-古龍酸和各類醫(yī)藥、化工中間體手性醇的合成.

醛酮還原酶；分類；結(jié)構(gòu)；生物催化；手性醇

醛酮還原酶(Aldo-keto reductase，AKR)家族是三個(gè)氧化還原酶超家族之一，到目前為止，已超過(guò)190 個(gè)蛋白被命名分類，并且還有新成員不斷地被鑒定確認(rèn).AKR的來(lái)源十分廣泛，幾乎分布于自然界所有的生物體內(nèi)，包括哺乳動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、植物、酵母，原生動(dòng)物和細(xì)菌等[1].AKR具有寬廣的作用底物譜，包括脂肪醛、芳香醛、單糖、類固醇和前列腺素等，在輔酶的參與下，能進(jìn)行羰基還原、碳碳雙鍵還原、內(nèi)酯還原和半縮醛氧化[2].微生物來(lái)源的AKR涵蓋最廣，是AKR的主要組成之一，盡管大多數(shù)AKR體內(nèi)生理功能未被解析，但因其擁有普遍性、豐富性和多功能性的特性，在生物催化與生物轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛.

1 AKR的分類和命名

Penning在1997年首次提出了AKR的命名法則，并經(jīng)過(guò)多次修訂后，形成了較為完善的命名體系[3-4].具體命名方法如下：以醛酮還原酶的縮寫(xiě)詞根AKR作為開(kāi)頭，后跟表示所屬家族的阿拉伯?dāng)?shù)字，之后為亞家族的大寫(xiě)英文單詞的首字母，最后為表示蛋白質(zhì)序列編號(hào)的阿拉伯?dāng)?shù)字，例如AKR1A1表示為AKR第一家族中的亞家族A的第一個(gè)蛋白質(zhì)；由于真核生物翻譯mRNA時(shí)存在可變剪切，得到功能上有差異的同種蛋白質(zhì)，故采用加后綴如AKR1A5.1的形式命名；此外，對(duì)于命名多聚體AKR時(shí)，采用特殊的比例形式如AKR7A1∶AKR7A4(1∶3)進(jìn)行命名，表示該四聚體AKR由一分子AKR7A1和三分子AKR7A4組成；以上所有的阿拉伯?dāng)?shù)字，以提交的先后次序排序.

根據(jù)AKR分類法則[1]，同源性低于40%時(shí)，AKR超家族分為16 個(gè)家族；再以同源性60%為界，同源性高于60%的屬于同一亞家族，同源性低于60%的屬于不同的亞家族；但同源性達(dá)到97%及以上時(shí)，一般認(rèn)為是同一個(gè)蛋白質(zhì).在16 個(gè)家族中，AKR1，AKR6和AKR7主要分布于哺乳動(dòng)物中，AKR4主要存在于植物中[5].微生物AKR橫跨12 個(gè)家族，包括AKR2，AKR3，AKR5，AKR8，AKR9，AKR10，AKR11，AKR12，AKR13，AKR14，AKR15和AKR16，這表明微生物細(xì)胞內(nèi)含有豐富的AKR，在細(xì)胞內(nèi)催化多個(gè)代謝過(guò)程，具有重要的生理生化功能.

2 微生物AKR的結(jié)構(gòu)

大多數(shù)已知的微生物AKR都是單體蛋白，但也存在多聚蛋白，如二聚體AKR2B5，AKR5C3和四聚體CPR-C1，CPR-C2[2, 6-7].類似于其他生物來(lái)源AKR，微生物AKR大小約為300～350 個(gè)氨基酸，分子量約為34～37 kDa，都具有相同的核心蛋白折疊——磷酸丙糖異構(gòu)酶(Triose phosphate isomerase，TIM)結(jié)構(gòu)，也稱為(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)，有些酶蛋白還帶有2 個(gè)額外的α螺旋結(jié)構(gòu)[8-9].如圖1所示[10]，來(lái)自棒狀桿菌的2,5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶的主體中心有8 個(gè)相互平行的β折疊，其外層存在著8 個(gè)α螺旋，而且每個(gè)α螺旋與對(duì)應(yīng)的β折疊相互交替和反向平行，前者的氨基端與后者的羧基端通過(guò)可變長(zhǎng)度的環(huán)連接.在桶狀結(jié)構(gòu)的背面，有三個(gè)具有柔性的可變環(huán)A，B和C，能識(shí)別、結(jié)合不同的底物，控制催化反應(yīng).這些羧基端的可變環(huán)是決定酶底物特異性的關(guān)鍵，在鑒定不同功能的AKR時(shí)具有重要的參考價(jià)值.通過(guò)多重序列比對(duì)確認(rèn)的高度保守的催化四聯(lián)體Asp-Tyr-Lys-His在酶蛋白三維結(jié)構(gòu)中的位置比較固定，主要位于組成核心的β折疊上，并在桶狀結(jié)構(gòu)開(kāi)口處形成底物結(jié)合口袋.

圖1 來(lái)自棒狀桿菌的2,5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶結(jié)構(gòu) Fig.1 Crystal structure of 2,5-diketo-D-gluconic acid reductase from Corynebacterium sp.

3 微生物AKR輔酶結(jié)合方式

絕大多數(shù)的微生物AKR是NADP(H)專一性依賴型，但酵母中的有些木糖還原酶是NAD(H)和NADP(H)雙依賴型[11]，僅有少數(shù)為NAD(H)專一依賴型[12].微生物AKR蛋白N端含有保守的LxxxGxxxPxxGxG輔酶結(jié)合區(qū)域，輔酶以伸展的狀態(tài)橫跨桶狀結(jié)構(gòu)，輔酶的煙酰胺環(huán)位于催化口袋的中心，催化四聯(lián)體的下方.焦磷酸基團(tuán)橫跨β7和β8之間的裂口，腺嘌呤單磷酸基團(tuán)則嵌在α7和α8結(jié)構(gòu)中間.當(dāng)輔酶結(jié)合后，酶蛋白的β7和β8部分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，將輔酶固定在合適的位置[13].到目前為止，微生物AKR偏好不同輔酶類型的結(jié)構(gòu)和機(jī)理仍在探索當(dāng)中，只有少量的報(bào)道提供了一定的研究思路.AKR5C3作為嚴(yán)格的NADP(H)依賴，其晶體結(jié)構(gòu)中有12 個(gè)與輔酶結(jié)合相關(guān)的氨基酸，最為重要的是高度保守的Trp30和Trp191與NADP(H)的煙酰胺環(huán)形成氫鍵，Lys234與NADP(H)的焦磷酸基團(tuán)形成氫鍵[7].NAD(H)和NADP(H)雙依賴的Pichiastipitis木糖還原酶XYLO的輔酶結(jié)合口袋由16 個(gè)氨基酸組成，不同的輔酶結(jié)合產(chǎn)生不同的酶構(gòu)象：當(dāng)其與NAD(H)結(jié)合時(shí)，Glu223和Phe236與輔酶形成氫鍵；當(dāng)其與NADP(H)結(jié)合時(shí)，Lys21和Phe236與輔酶形成氫鍵[14].

4 微生物AKR的催化機(jī)制

微生物AKR在進(jìn)行還原反應(yīng)時(shí)，遵循強(qiáng)制順序反應(yīng)機(jī)制[15]，具體催化歷程如下：1) AKR酶分子首先與還原型輔酶NAD(P)H結(jié)合形成全酶，誘導(dǎo)蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，這是整個(gè)還原過(guò)程的第一個(gè)限速步驟；2) 底物進(jìn)入催化口袋，與全酶結(jié)合形成三元復(fù)合物；3) NAD(P)H上的H轉(zhuǎn)移到底物羰基C原子上形成產(chǎn)物醇，隨后產(chǎn)物離開(kāi)催化口袋；4) 最后，酶釋放氧化型輔酶NAD(P)+，AKR酶分子恢復(fù)初始構(gòu)象，成為單酶，酶蛋白構(gòu)象回復(fù)，這是第二個(gè)限速步驟.上述過(guò)程中，催化四聯(lián)體Asp-Tyr-Lys-His起到至關(guān)重要的作用(圖2[2])，Tyr51作為質(zhì)子供體具有催化酸的作用，Asp46和Lys80的羧基相互作用形成鹽橋，且Lys80和Tyr51之間形成氫鍵，最終降低Tyr51的pKa值，促進(jìn)質(zhì)子轉(zhuǎn)移，His113在質(zhì)子轉(zhuǎn)移和底物分子的定向方面發(fā)揮重要作用[16-18].按照AKR獨(dú)特的“推-拉”原理，反應(yīng)分為兩部分：Tyr51和His113作用底物羰基使其極性化，同時(shí)煙酰胺C4位上的pro-R氫(HR)發(fā)生轉(zhuǎn)移；Tyr51提供質(zhì)子，保證還原反應(yīng)的完成.

圖2 AKR2B5還原羰基底物的機(jī)理Fig.2 Mechanism for AKR2B5 catalyzing the reduction of a carbonyl group

5 微生物AKR在生物轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用

5.1 木糖醇的制備

木糖醇是一類糖類多元醇，由于其具有特殊的化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)被大量應(yīng)用于食品和藥品.在食品工業(yè)中，木糖醇既可作為甜味劑增味，又可作為防腐劑延長(zhǎng)保質(zhì)期，還能作為吸熱劑加速冷卻[19].另外，木糖醇還具有抗氧化、潤(rùn)膚、防凍和降低冰點(diǎn)等能力，所以市場(chǎng)需求逐漸增加，已成為一種重要的添加劑.現(xiàn)今，大規(guī)模生產(chǎn)木糖醇通過(guò)金屬鎳等催化劑的催化加氫法，過(guò)程需高溫高壓，生產(chǎn)成本高，環(huán)境壓力大.因此，利用環(huán)境友好和高產(chǎn)率的生物法制備木糖醇是一種前景廣闊的替代方式[20].

生物法合成木糖醇過(guò)程中，起關(guān)鍵作用的一步即為木糖還原酶轉(zhuǎn)化木糖合成木糖醇.木糖還原酶屬于AKR家族中的亞家族AKR2，且均來(lái)源于微生物，大量存在于酵母和絲狀真菌中，相關(guān)報(bào)道如表1所示.大多數(shù)木糖還原酶是NADPH嚴(yán)格依賴型，僅有少數(shù)是NADPH和NADH同等偏好，極少數(shù)是NADH偏好或嚴(yán)格依賴.木糖還原酶通常在各類酵母系統(tǒng)中表達(dá)，并通過(guò)發(fā)酵不同生物質(zhì)原料得到產(chǎn)物木糖醇.Kogje和Ghosalkar[21]構(gòu)建了4種過(guò)表達(dá)木糖還原酶基因的Saccharomycescerevisiae，以玉米芯半纖維素水解液為原料和葡萄糖作為NADPH再生的輔底物，發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇.其中，過(guò)表達(dá)GRE3的S.cerevisiae菌株的產(chǎn)物時(shí)空產(chǎn)率和單位菌體產(chǎn)率分別為0.28 g/(L·h)和34 mg/(g·h).Pratter等[22]以表達(dá)Candidatenuis木糖還原酶基因的S.cerevisiae為生物催化劑，40 g/L的木糖可被完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到1.16 g/(L·h).Kim等[23]采用定向進(jìn)化和隨機(jī)突變改造Kluyveromycesmarxianus36907，最優(yōu)突變株的產(chǎn)物質(zhì)量濃度提高了120%，達(dá)到53 g/L，產(chǎn)物時(shí)空產(chǎn)率為0.36 g/(L·h).此外，Phanerochaetesordida,Candidaglycerinogenes和P.spitis也可作為木糖醇發(fā)酵生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)[20].

表1 不同來(lái)源木糖還原酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of XRs from various microorganisms

5.2 維生素C前體的制備

維生素C主要用于維生素保健品和藥物制劑.近年來(lái)，由于其具有抗氧化和促進(jìn)膠原蛋白產(chǎn)生的特性，逐漸被應(yīng)用于食品和飲料生產(chǎn)中[34].2-酮-L-古龍酸(2-KLG)作為維生素C的合成前體，可由2,5-二酮-D-葡萄糖酸(2,5-DKG)C5的酮基還原生成，2-KLG再經(jīng)酯化和內(nèi)酯化反應(yīng)生成維生素C.從D-葡萄糖出發(fā)，兩步法制備維生素C(圖3)是現(xiàn)今工業(yè)上的主要生產(chǎn)工藝路線[35].因此具有高選擇性還原2,5-DKG活性的還原酶對(duì)制備維生素C極為關(guān)鍵.兩步發(fā)酵法制備維生素C的途徑為

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道可知：2,5-DKG還原酶屬于AKR5，分布于17 種不同的細(xì)菌屬中，廣泛應(yīng)用于2-KLG的合成.Miller等[36]首次從Corynebacteriumsp.中分離純化到可一步還原2,5-DKG生成2-KLG的2,5-DKG還原酶A并進(jìn)行了表征.Sonoyama等[37]也從突變的Corynebacteriumsp.中純化得到AKR5C和AKR5D，但酶的底物親和性和催化效率較差.為獲得高性能的2,5-DKG還原酶，Eschenfeldt等[38]采用宏基因組的方法從土壤樣品宏基因組中克隆得到兩個(gè)不同的2,5-DKG還原酶基因，在大腸桿菌中異源表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)2,5-DKG的親和性較好，Km值分別為57, 67 μmol/L，可以同時(shí)利用NADH和NADPH.在生產(chǎn)上，Sonoyama等[39]則首次采用兩步法生產(chǎn)2-KLG，先由Erwiniasp.氧化D-葡萄糖生成2,5-DKG，再經(jīng)具有2,5-DKG還原酶活性的Corynebacteriumsp.還原生成2-KLG.Anderson等[40]將Corynebacterium中的2,5-DKG還原酶基因?qū)氲剿拗鱁rwiniaherbicola中，構(gòu)建了從D-葡萄糖一步發(fā)酵生產(chǎn)2-KLG的基因工程菌，雖然簡(jiǎn)化了步驟，但2-KLG的產(chǎn)率只有5%左右.目前，生產(chǎn)效率最高的為Kaswurm等[41]建立的兩步法，通過(guò)引入葡萄糖脫氫酶催化的NADPH原位再生系統(tǒng)，C.glutamicum的2,5-DKG還原酶可完全還原200 mmol/L的2,5-DKG，2-KLG時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到21.5 g/(L·h).

5.3 手性醇的制備

手性醇是指在手性碳上連接有一個(gè)羥基基團(tuán)的化合物，在藥物、農(nóng)用化學(xué)品和特殊材料生產(chǎn)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用，是重要的合成中間體[42].相比傳統(tǒng)重金屬催化合成技術(shù)，微生物AKR不對(duì)稱還原前手性酮生產(chǎn)手性醇技術(shù)具有立體選擇性高、轉(zhuǎn)化率高和環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到產(chǎn)學(xué)界的關(guān)注.如圖3所示，微生物AKR進(jìn)行不對(duì)稱還原時(shí)，輔酶煙酰胺環(huán)C上的H原子進(jìn)攻底物羰基時(shí)遵循Prelog規(guī)則或反Prelog規(guī)則[43].大多數(shù)微生物AKR在不對(duì)稱還原羰基化合物時(shí)遵循Prelog規(guī)則，也有少數(shù)酶遵循反Prelog規(guī)則.

圖3 NAD(P)H煙酰胺環(huán)的C4氫轉(zhuǎn)移到底物羰基碳上Fig.3 Hydride transfer from NAD(P)H to the substrate carbonyl C

前手性4-氯-3-羰基丁酸乙酯經(jīng)不對(duì)稱還原生成4-氯-(3R)-羥基丁酸乙酯或4-氯-(3S)-羥基丁酸乙酯，分別為L(zhǎng)-肉堿和阿托伐他汀鈣的重要手性中間體.日本學(xué)者Kita等[44]從SporobolomycessalmonicolorAKU4429中分離純化得到三種AKR——ARI，ARII和ARIII，均能不對(duì)稱還原4-氯-3-羰基丁酸乙酯.其中ARI和ARIII可將4-氯-3-羰基丁酸乙酯還原成4-氯-(3R)-羥基丁酸乙酯，e.e.值分別為100%和38.4%；與之相反，ARII則將底物還原成4-氯-(3S)-羥基丁酸乙酯，e.e.值為92.7%.還有學(xué)者從CandidamagnoliaeAKU4643純化得到一種能夠?qū)?-氯-3-羰基丁酸乙酯100%轉(zhuǎn)化成4-氯-(3R)-羥基丁酸乙酯的AKR，但其穩(wěn)定性較差，在干燥空氣中很快失活.4-溴-(3S)-羥基丁酸甲酯作為他汀類藥物的中間體，可類似地采用不對(duì)稱還原4-溴-3-羰基丁酸甲酯制備得到.Asako等[45]從PenicilliumcitrinumIFO4631中篩選并分離純化得到AKR3E1，根據(jù)部分氨基酸序列反轉(zhuǎn)錄得到編碼AKR3E1的基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，AKR3E1對(duì)4-溴-3-羰基丁酸甲酯表現(xiàn)出不對(duì)稱還原能力，AKR3E1催化合成的4-溴-(3S)-羥基丁酸甲酯e.e.值為96%.

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的微生物AKR通過(guò)基因挖掘技術(shù)被發(fā)現(xiàn)，并用于手性醇的研究.Ma等[46]通過(guò)序列及蛋白三維結(jié)構(gòu)分析，在嗜熱菌Thermotogamaritima基因組中篩選得到AKRTm1743基因，并在大腸桿菌中表達(dá)，用于2,2,2-三氟苯乙酮不對(duì)稱還原，得到的S-1-苯基-2,2,2-三氟乙醇e.e.值達(dá)到99.8%.Ning等[47]通過(guò)挖掘Lodderomyceselongisporus基因組，發(fā)現(xiàn)3 個(gè)推測(cè)AKR基因，并在大腸桿菌中異源表達(dá)，命名為L(zhǎng)EAKR48，LEAKR49和LEAKR50，并表征了它們對(duì)4-氯-3-羰基丁酸乙酯的活性，LEAKR48的催化活力最高，產(chǎn)物4-氯-(3R)-羥基丁酸乙酯e.e.值為98%.Guo等[48]通過(guò)基因挖掘技術(shù)從C.parapsilosis中克隆得到8株推測(cè)的AKR，并以此作為生物催化工具盒，不對(duì)稱還原一系列的酮酯和苯乙酮衍生物，得到e.e.值超過(guò)99%的多個(gè)手性醇.

6 結(jié) 論

微生物AKR是一類結(jié)構(gòu)功能相似、種屬來(lái)源廣泛、涉及生物體內(nèi)各種代謝過(guò)程的氧化還原酶，含有高度保守的(α/β)8桶狀結(jié)構(gòu)，催化四聯(lián)體、輔酶結(jié)合區(qū)域和三個(gè)可變的底物識(shí)別環(huán).明確其結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理，有助于了解酶蛋白在體內(nèi)的生理生化作用，也可作為分子改造的理論基礎(chǔ).盡管一些AKR晶體結(jié)構(gòu)已被解析，部分微生物AKR已被開(kāi)發(fā)用于制備一些高附加值精細(xì)化學(xué)品，但關(guān)于微生物AKR如何識(shí)別不同底物、不同輔酶結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及反應(yīng)機(jī)理有待完善，尤其針對(duì)新型AKR挖掘、AKR理性設(shè)計(jì)、AKR催化新反應(yīng)發(fā)現(xiàn)和高效輔酶再生系統(tǒng)構(gòu)建等方面的研究有待進(jìn)一步深入.

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Structure,functionandbiocatalyticapplicationsofmicrobialaldo-ketoreductases

SHI Lizhen1,2, YING Bingbing1,2, WANG Yajun1,2

(1.Key Laboratory of Bioorganic Synthesis of Zhejiang Province, Hangzhou 310014, China; 2.College of Biotechnology and Bioengineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

As an important member of the aldo-keto reductase (AKR) superfamily, microbial AKRs exist in a wide range of microorganisms and perform oxidoreduction on a broad variety of natural and artificial ketone compounds. Usually, microbial AKRs are monomeric proteins with molecular weights around 37 kDa, containing the typical (α/β)8-barrel fold and a conserved coenzyme binding domain. All microbial AKRs obey the ordered bi-bi mechanism, driven by a tetrad of Asp-Tyr-Lys-His. Currently, microbial AKRs have been applied in the synthesis of xylitol, vitamin C immediate precursor 2-keto-L-gulonic acid and pharmaceutical intermediate chiral alcohols.

aldo-keto reductase; classification; structure; biocatalysis; chiral alcohol

2017-05-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21476209);浙江省公益技術(shù)研究項(xiàng)目(2014C33223)

史麗珍(1992—)，女，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘ぃ珽-mail:13588399962@163.com.通信作者：王亞軍教授，E-mail:wangyj@zjut.edu.cn.

Q814.2；O643.3

A

1674-2214(2017)04-0198-07

朱小惠)