抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野芥菜的抗性回交3代子1代和子2代的適合度

王曉蕾，王建，張慶玲，閆靜，強勝，宋小玲

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室，江蘇 南京210095)

抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野芥菜的抗性回交3代子1代和子2代的適合度

王曉蕾，王建，張慶玲，閆靜，強勝，宋小玲*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)雜草研究室，江蘇 南京210095)

如果抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜的抗性基因滲入到野芥菜中，會給野芥菜的防除帶來很大困難。因此在抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜環(huán)境釋放前對抗性基因向野芥菜的滲入開展深入的研究非常必要。以抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野芥菜的攜帶抗性基因回交3代子1代和子2代(BC3mF2和BC3pF2及BC3mF3和BC3pF3，m表示以野芥菜為母本的回交后代，p表示以野芥菜為父本的回交后代)為材料，在田間條件下研究了它們在不同密度(低密度為15株/區(qū)，高密度為30株/區(qū))及不同種植比例(單種，野芥菜與回交后代以4∶1、3∶2、1∶1混種)時的適合度成分和總適合度。結(jié)果表明，無論是低密度還是高密度條件下，單種時BC3F2和BC3F3的總適合度均與野芥菜無顯著差異。低密度混種時，在4∶1和3∶2下，只有BC3mF3的總適合度與野芥菜無顯著差異，其余各后代的總適合度均顯著小于野芥菜；以1∶1混種時，只有BC3mF2和BC3mF3的總適合度與野芥菜無顯著差異。高密度混種時，3個比例混種下4種供試回交后代的總適合度均顯著小于野芥菜。相關(guān)性分析結(jié)果表明，BC3mF3的各適合度成分都與混種比例不相關(guān)。表明攜帶抗性基因的BC3F2和BC3F3在野外都具有生存定植的可能性，且BC3mF3定植的可能性較其他供試回交后代更大。因此在防范轉(zhuǎn)基因油菜基因逃逸的策略上，在防范初始雜交發(fā)生的同時，也應(yīng)該防范回交后代的產(chǎn)生。

抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜；野芥菜；回交后代；適合度

轉(zhuǎn)基因油菜(Brassicanapus)是生物技術(shù)的重點研究領(lǐng)域，自商業(yè)化種植以來，其種植面積不斷增加，2015年已達(dá)1億hm2左右，占總轉(zhuǎn)基因作物面積的5%[1]。轉(zhuǎn)基因作物的大面積種植在帶來可觀的經(jīng)濟(jì)和社會效益的同時也可能造成一定的生態(tài)風(fēng)險，其中抗性基因向野生近緣種特別是近緣雜草的漂移問題備受關(guān)注[2-4]。我國目前雖還沒有轉(zhuǎn)基因油菜的商業(yè)化種植，但其研究相當(dāng)活躍，已經(jīng)培育出一批抗除草劑的轉(zhuǎn)基因油菜[5]。同時每年進(jìn)口大量的轉(zhuǎn)基因油菜籽用于食用油的加工生產(chǎn)，油菜籽在運輸、加工過程中可能會散落而發(fā)生轉(zhuǎn)基因的逃逸[6-9]。因油菜是異花授粉植物，花粉傳播距離遠(yuǎn)且活力保持時間長，同時在我國存在很多可交配的野生近緣種，因此轉(zhuǎn)基因油菜的基因漂移問題更值得關(guān)注[5,10]。

轉(zhuǎn)基因作物和野生近緣種能否發(fā)生初始雜交、抗性基因在雜交和回交后代中能否傳遞下去及雜交或回交后代的適合度(fitness)是抗性基因能否成功地漂移至野生近緣種的關(guān)鍵因素[11-13]。其中適合度是指個體在特定環(huán)境下的生存和繁殖能力。轉(zhuǎn)基因逃逸是否會帶來生態(tài)風(fēng)險很大程度上取決于雜交或回交代的適合度[14]。研究表明，轉(zhuǎn)基因作物和野生近緣種的雜交或回交后代的適合度受親本基因組[15-17]、基因型[18-19]和測試環(huán)境條件[20-23]等因素的影響，因此通過雜種適合度大小來評估抗性基因漂移風(fēng)險時要綜合考慮各方面因素。

在我國與轉(zhuǎn)基因油菜親緣關(guān)系最近的雜草是野芥菜(wildB.juncea)。野芥菜是西北地區(qū)和長江流域荒地及農(nóng)田的重要雜草[24]。在自然條件下油菜包括轉(zhuǎn)基因油菜和野芥菜能自發(fā)雜交[10,25-26]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，以野芥菜為母本，抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜為父本，人工雜交獲得的F1代表現(xiàn)出對草丁膦的抗性，但結(jié)實率很低[10]。以攜帶抗草丁膦基因的F1和野芥菜回交，發(fā)現(xiàn)以野芥菜為母本的回交1代(正向回交1代)和以野芥菜為父本的回交1代(反向回交1代)自交的結(jié)實率都明顯低于野芥菜的自交結(jié)實率；但以野芥菜和正向回交1代以及野芥菜和正向回交2代為親本，回交獲得的正向回交2代和正向3代的自交結(jié)實率已和野芥菜相當(dāng)，但反向回交2代和反向回交3代的自交結(jié)實率仍顯著低于野芥菜[27]。這說明通過不斷回交，攜帶抗草丁膦基因的回交后代適合度在不斷提高，抗性基因有可能滲入到野芥菜中。但上述研究是在溫室條件下進(jìn)行的，尚沒有對回交后代在田間條件下的適合度進(jìn)行研究。

本試驗在田間條件下研究了攜帶抗草丁膦基因的正反回交3代子1代以及正反回交3代子2代與野芥菜在單種和3種比例(4∶1、3∶2、1∶1)混種時的適合度。目的是獲得回交3代自交子代在田間條件下的適合度及變化規(guī)律，為進(jìn)一步開展抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜的抗性基因向野芥菜滲入的研究提供試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

野芥菜(wildB.juncea)采集于南京江浦，抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜(Swallow, Liberty Link, event HCN92)來自加拿大。宋小玲等[10]以野芥菜為母本，抗性油菜為父本人工雜交獲得攜帶抗性基因的F1；以野芥菜為母本，F(xiàn)1或者回交代為父本獲得正向回交1代(BC1mF1)、正向回交2代(BC2mF1)、正向回交3代(BC3mF1)，以F1或者回交代為母本，野芥菜為父本獲得反向回交1代(BC1pF1)、反向回交2代(BC2pF1)、反向回交3代(BC3pF1)[27]。以BC3mF1與BC3pF1連續(xù)套袋自交及抗性篩選獲得攜帶抗性基因的正向回交3代子1代(BC3mF2)和正向回交3代子2代(BC3mF3)與反向回交3代子1代(BC3pF2)和反向回交3代子2代(BC3pF3)為研究對象。詳細(xì)過程見圖1。

圖1 野芥菜和抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜雜交和回交框架圖Fig.1 Crossing scheme of hybridization and backcrossing between wild Brassica juncea and transgenic glufosinate-resistant oilseed rape ×前面的作母本，后面的作父本；m表示野芥菜為母本的后代；p表示野芥菜為父本的后代；L表示攜帶抗草丁膦基因；BC表示回交后代。Combinations involved in this study are indicated as maternal plants×paternal plants. Plants in front of × are always maternal, and plants in the back of × are always paternal. m denotes backcross progeny obtained with wild B. juncea as maternal plants. p denotes backcross progeny obtained with wild B. juncea as paternal plants. L denotes F1 and backcross progeny with glufosinate-resistant gene. BC: Backcross generation.

1.2 試驗方法

1.2.1種植方法 試驗于2012和2013年進(jìn)行，每年11月初將經(jīng)過抗性篩選的長勢良好攜帶抗性基因的植株幼苗移栽至試驗田。田間試驗按照隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積為3 m2(2.5 m×1.2 m)，重復(fù)3次。種植密度按照低、高兩種密度即15和30株/區(qū)進(jìn)行種植，其中低密度1∶1混種時，為了使野芥菜與回交后代株數(shù)相同且不改變株距，小區(qū)面積相應(yīng)擴(kuò)大。各密度下分別設(shè)計單種和混種，混種時野芥菜與各回交后代兩兩混合種植，混種比例為野芥菜∶回交后代=4∶1，3∶2，1∶1。小區(qū)內(nèi)回交后代和野芥菜隨機(jī)排列。其中低密度下每小區(qū)種植3行×5列，行距為0.4 m，株距為0.5 m。高密度下每小區(qū)種植6行×5列，行距為0.2 m，株距為0.5 m，小區(qū)具體設(shè)計見圖2。

圖2 野芥菜與回交后代混種時小區(qū)植株分布Fig.2 Layout of field experiment in mixed plot △代表野芥菜Represents B. juncea;▲代表回交后代Represents progeny of the first backcross generation.

1.2.2適合度成分的測量 所測指標(biāo)包括營養(yǎng)生長指標(biāo)(株高[28]、莖粗[29]、一次分支數(shù)[30]、地上部單株生物量[31])和生殖生長指標(biāo)(單株有效角果數(shù)[32]、單株種子重量[33]、角果長[19]、每角果飽粒數(shù)[34])。具體方法見表1。統(tǒng)計每小區(qū)內(nèi)的全部植株，計算平均值。

1.2.3數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。單種條件下多重比較采用Duncan復(fù)極差測驗(Duncan’s Multiple Range Test)的方法，混種條件下采用配對樣本T檢驗的方法。把同年的各回交后代及親本野芥菜在相同密度、相同比例下的相同適合度成分進(jìn)行方差分析，比較差異顯著性。

以各自親本野芥菜的各適合度成分為標(biāo)準(zhǔn)“1”， 回交后代的各適合度成分與野芥菜相應(yīng)適合度成分之比為回交后代該適合度成分的相對適合度值。每一回交后代的總適合度(composite fitness)值是其各項適合度成分相對適合度值的加權(quán)平均數(shù)[36-37]。

在SPSS 20.0軟件中運用Pearson相關(guān)系數(shù)，對各回交后代的適合度成分與單種和混種時密度以及混種比例的相關(guān)性進(jìn)行分析。

表1 適合度成分及測定方法Table 1 Fitness components and the measurement methods

2 結(jié)果與分析

2.1 單種時各回交代與野芥菜的適合度

2.1.1低密度 各適合度指標(biāo)的測定結(jié)果見表2。從表2中可以看出，BC3mF2與BC3pF2的株高、莖粗、單株有效角果數(shù)分別為151.00、150.47 cm、1.33、1.32 cm與1714.20、1580.33個，均顯著小于野芥菜的176.33 cm、1.51 cm、2442.97個。但一次分支數(shù)、地上部單株干生物量、種子重量、角果長以及每角果飽粒數(shù)均與野芥菜無顯著差異。而BC3mF3和BC3pF3除了莖粗顯著小于野芥菜，其余各適合度成分均與野芥菜無顯著差異(表2)。各后代的總適合度為0.86～1.02，均已達(dá)到與野芥菜相當(dāng)?shù)乃?圖3)。

2.1.2高密度 各適合度成分的測定結(jié)果見表2。只有BC3mF3的株高與野芥菜無顯著差異，其余后代株高顯著低于野芥菜12.93～29.27 cm；各后代的莖粗為1.22～1.36 cm，地上部單株干生物量為98.00～115.43 g，單株有效角果數(shù)為1129.73～1263.57，均顯著小于野芥菜。此外BC3pF2的每角果飽粒數(shù)為15.30粒, 顯著小于野芥菜的17.89粒(表2)。各后代的總適合度為0.85～0.89，均與野芥菜無顯著差異(圖4)。

低密度條件下，BC3mF2和BC3pF2的株高、單株有效角果數(shù)顯著低于野芥菜，但其自交后代BC3F3的這兩個適合度成分提高到與野芥菜相當(dāng)?shù)乃?。高密度下，BC3mF2和BC3pF2的株高、單株有效角果數(shù)仍顯著低于野芥菜，只有BC3mF3的株高與野芥菜相當(dāng)。但是無論是低密度還是高密度條件下，各后代的總適合度均與野芥菜無顯著差異。

表2 單種時回交3代子1代及子2代(BC3F2、BC3F3)與野芥菜的適合度成分比較Table 2 Comparison on fitness components between wild B. juncea and the first and second progenies of the third backcross generation (BC3F2、BC3F3) in pure plots

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note： The different letters within the same column denote significant differences atP<0.05, the same below.

2.2 混種時各回交代與野芥菜的適合度

2.2.1低密度混種條件下 在低密度混種條件下，野芥菜與供試后代生長良好。各適合度成分的測定結(jié)果見表3。在低密度4∶1混種時， BC3mF2、BC3pF2與BC3pF3的株高為105.39～132.67 cm，莖粗在0.87～1.15 cm之間，都顯著小于野芥菜，而BC3mF3的株高和莖粗分別為137.33 cm和1.24 cm，與野芥菜無顯著差異；BC3pF2的地上部單株生物量顯著小于野芥菜42.65 g，其余后代的地上部單株生物量為105.64～134.67 g，與野芥菜無顯著差異；BC3F2與BC3F3的一次分支數(shù)、單株有效角果數(shù)、種子重量、角果長以及每角果飽粒數(shù)均與野芥菜無顯著差異(表3)。BC3mF2、BC3pF2與BC3pF3的總適合度為0.87～0.89，均顯著小于野芥菜，只有BC3mF3的總適合度為0.93，與野芥菜無顯著差異(圖5)。

低密度3∶2混種時，BC3mF2、BC3pF2與BC3pF3的株高分別比其混種的野芥菜顯著低20.84、25.26和36.95 cm，莖粗分別顯著低0.39、0.42和0.35 cm，只有BC3mF3的株高和莖粗均與野芥菜無顯著差異；BC3pF2的地上部單株干生物量為112.87g，顯著小于野芥菜46.76 g，其余后代的地上部單株干生物量與野芥菜無顯著差異；BC3F2與BC3F3的一次分支數(shù)、單株有效角果數(shù)、種子重量、角果長以及每角果飽粒數(shù)均與野芥菜無顯著差異(表4)。低密度3∶2混種條件下BC3mF2、BC3pF2與BC3pF3的總適合度分別為0.87、0.86、0.87，都顯著小于野芥菜，只有BC3mF3的總適合度為0.94，與野芥菜相當(dāng)(圖6)。

圖3 田間低密度單種下野芥菜和回交3代子1代及子2代的總適合度Fig.3 Composite fitness of wild B. juncea and the first and second progenies of the third backcross generation in pure 15 plants/plot

圖4 田間高密度單種下野芥菜和回交3代子1代及子2代的總適合度Fig.4 Composite fitness of wild B. juncea and the first and second progenies of the third backcross generation in pure 30 plants/plot

1:WildB.juncea;2:BC3mF2;3:BC3pF2;4:BC3mF3；5:BC3pF3.不同小寫字母表示差異性顯著(P<0.05)，下同。The different letters mean the significant differences atP<0.05, the same below.

表3 4∶1混種時回交3代子1代及子2代(BC3F2、BC3F3)與野芥菜適合度成分的比較Table 3 Comparison on fitness components between B. juncea and backcross generation (BC3F2, BC3F3) in mixed 4∶1 planting proportion

圖5 田間低密度4∶1混種下野芥菜和回交3代子1代及2代的總適合度Fig.5 Composite fitness of wild B. juncea and the first and second progenies of the third backcross generation in mixed 15 plants/plot under 4∶1 planting proportion

圖6 田間低密度3∶2混種下野芥菜和回交3代子1代及子2代的總適合度Fig.6 Composite fitness of wild B. juncea and the first and second progenies of the third backcross generation in mixed 15 plants/plot under 3∶2 planting proportion

低密度1∶1混種時，各回交后代的適合度成分均達(dá)到了與野芥菜無顯著差異。但是BC3pF2與BC3pF3的總適合度分別為0.90、0.87，仍顯著小于野芥菜，而BC3mF2與BC3mF3的總適合度分別為0.95、0.91，與野芥菜無顯著差異(圖7)。

2.2.2高密度混種條件下 4∶1混種下，BC3F2和BC3F3的株高在116.03～137.95 cm之間，莖粗為0.90～1.11 cm，地上部單株生物量在40.53～70.32 g之間，單株有效角果數(shù)在614.97～705.56之間，種子重量為11.19～13.27 g/株，都顯著小于野芥菜；而BC3F2和BC3F3的一次分支數(shù)在9.74～12.87之間，角果長為3.40～3.74 cm，每角果飽粒數(shù)為13.38～15.57粒，均與野芥菜無顯著差異(表3)。最終，BC3F2和BC3F3的總適合度為0.75～0.79，也都顯著小于野芥菜(圖8)。

圖7 田間低密度1∶1混種下野芥菜和回交3代子1代及子2代的總適合度Fig.7 Composite fitness of wild B. juncea and the first and second progenies of the third backcross generation in mixed 15 plants/plot under 1∶1 planting proportion

圖8 田間高密度4∶1混種下野芥菜和回交3代子1代及子2代的總適合度Fig.8 Composite fitness of wild B. juncea and the first and second progenies of the third backcross generation in mixed 30 plants/plot under 4∶1 planting proportion

3∶2混種下，BC3F2和BC3F3的株高為109.58～137.46 cm，莖粗為0.96～1.18 cm，地上部單株生物量在48.17～76.08 g之間，單株有效角果數(shù)為592.20～857.81，種子重量為10.54～18.07 g，均顯著小于野芥菜；而BC3F2和BC3F3的一次分支數(shù)為9.24～13.60，角果長為3.44～3.89 cm，每角果飽粒數(shù)在14.32～17.31粒之間，與野芥菜無顯著差異(表4)。各回交后代的總適合度為0.76～0.84，也都顯著小于野芥菜(圖9)。

表4 3∶2混種時回交后代(BC3F2、BC3F3)與野芥菜適合度成分的比較Table 4 Comparison on fitness components between B. juncea and backcross generation (BC3F2， BC3F3) in mixed 3∶2 planting proportion

1∶1混種下，BC3F2和BC3F3的株高為115.73～133.17 cm，莖粗為0.98～1.14 cm，地上部單株生物量為61.85～78.55 g，單株有效角果數(shù)為799.09～882.18，種子重量為16.36～20.23 g，均顯著小于野芥菜；而BC3F2和BC3F3的一次分支數(shù)為11.14～12.84，角果長為3.51～3.96 cm，每角果飽粒數(shù)為13.60～16.41粒，與野芥菜無顯著差異(表5)。各回交后代的總適合度為0.77～0.84，也都顯著小于野芥菜(圖10)。

2.3 各后代適合度成分與密度的相關(guān)性分析

圖9 田間高密度3∶2混種下野芥菜和回交3代子1代及子2代的總適合度Fig.9 Composite fitness of wild B. juncea and the first and second progenies of the third backcross generation in mixed 30 plants/plot under 3∶2 planting proportion

圖10 田間高密度1∶1混種下野芥菜和回交3代子1代及子2代的總適合度Fig.10 Composite fitness of wild B. juncea and the first and second progenies of the third backcross generation in mixed 30 plants/plot under 1∶1 planting proportion

表5 1∶1混種時回交后代(BC3F2、BC3F3)與野芥菜適合度成分的比較Table 5 Comparison on fitness components between B. juncea and backcross generation (BC3F2， BC3F3) in mixed 1∶1 planting proportion

表6 BC3F2、BC3F3的地上部單株干生物量、單株有效角果數(shù)和種子重量與單種和混種時密度的相關(guān)性以及混種比例的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis between above-ground dry biomass/plant, silique number/plant and seed weight of backcross generation BC3F2， BC3F3 and the density in pure and mixed plot and the ratio in mixed plot

*表示顯著性在0.05水平，**表示顯著性在0.01水平。

* Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed); ** Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

BC3F2和BC3F3的地上部單株干生物量、單株有效角果數(shù)和種子重量與單種和混種時密度以及混種比例的相關(guān)性見表6。可以看出，各回交后代在單種和混種時這3個適合度成分均與種植密度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。說明隨著密度的增大，各后代的地上部單株干生物量、單株有效角果數(shù)和種子重量都呈下降的趨勢。與比例的相關(guān)性中，低密度種植條件下，各回交后代的地上部單株干生物量、單株有效角果數(shù)和種子重量與混種比例無顯著相關(guān)關(guān)系；高密度種植條件下，BC3mF2的種子重量，BC3pF2的地上部單株干生物量、單株有效角果數(shù)和種子重量以及BC3pF3的地上部單株干生物量和種子重量與混種比例呈顯著正相關(guān)關(guān)系，而BC3mF3的各適合度成分都與混種比例不相關(guān)，這說明了BC3mF3具有較強的生存競爭能力。

3 討論

適合度是衡量個體或種群在不同生境下的適應(yīng)程度或者是個體對群體基因庫的相對貢獻(xiàn)程度，即特定基因型個體在同種生物群體中生存和繁殖后代的能力[14,38]。轉(zhuǎn)基因作物的抗性基因能否逃逸到野生近緣種中很大程度取決于雜交1代和隨后后代的適合度[18,39-41]。本試驗在田間條件下評估了抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野芥菜的回交3代子1代及子2代的適合度，結(jié)果表明，在單種條件下，無論是低密度還是高密度，正反回交3代子1代和子2代都有和野芥菜相似的適合度，這就意味著攜帶抗性基因的回交3代子代在田間環(huán)境下具有較強的生存能力，因此抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜向野芥菜的基因逃逸風(fēng)險不可忽視。

后代的結(jié)實能力是評價其適合度的重要指標(biāo)之一，且受親本親緣關(guān)系的影響[12,17]。親本基因組的同源性越高，雜交或回交后代的結(jié)實能力就越強。轉(zhuǎn)基因作物和近緣種的雜交1代的染色體組來源于母本和父本，如果親本的染色體組不同，雜種染色體在減數(shù)分裂中不能進(jìn)行正常配對和分離，導(dǎo)致雜交1代的育性降低甚至高度不育。轉(zhuǎn)基因油菜(2n=38, AACC)和近緣雜草野芥菜(2n=36, AABB)有一個共同的AA基因組，因此F1的染色體組成應(yīng)該是AABC，2n=37，F(xiàn)1幾乎不結(jié)實[10]。盡管如此，但F1和野芥菜有回交的可能性，并產(chǎn)生攜帶抗性基因的回交后代[9,27,35]，因此評價攜帶抗性基因回交后代的結(jié)實能力對正確評估轉(zhuǎn)基因油菜的抗性基因向野芥菜的逃逸可能引起的生態(tài)風(fēng)險有重要意義。

轉(zhuǎn)基因油菜與近緣種的雜交后代可以不斷自交或與野生近緣種回交，使得攜帶抗性基因后代的染色體會越來越接近野生種甚至與野生近緣種相同，因此后代的結(jié)實能力也會不斷提高。這在轉(zhuǎn)基因油菜與蕪菁(B.rapa)的回交后代中[42]以及轉(zhuǎn)基因油菜與野蘿卜(Raphanusraphanistrum)的雜交和回交后代中得到證實[12,16-17]。理論上講轉(zhuǎn)基因油菜和野芥菜的回交后代的染色體數(shù)量應(yīng)該是變化的，且變化范圍介于20 (2A)+8(B)+0-8 (B)+0-9 (C)之間。 C染色體由于在減數(shù)分裂過程中沒有同源染色體配對而隨著代數(shù)的增加逐漸丟失[43]，因此隨著回交或自交次數(shù)的增加，后代染色體趨于穩(wěn)定。因此理論上講，相同條件下，相比回交3代子1代，回交3代子2代應(yīng)具有相似或更高的適合度。本研究單種下的試驗結(jié)果也證實這一推論。從單個適合度成分來看，在低密度下，正反回交3代子1代的株高、莖粗和單株有效角果數(shù)都顯著低于野芥菜，而正反回交3代子2代的適合度成分部分和野芥菜相當(dāng)。在高密度下，正反回交3代子1代的株高、地上部干生物量和單株有效角果數(shù)以及反向回交3代子1代的每角飽粒數(shù)都顯著低于野芥菜，而正向回交3代子2代的株高以及反向回交3代子2代的每角果飽粒數(shù)和野芥菜相當(dāng)，這說明隨著自交代數(shù)的增加，后代的適合度也呈提高的趨勢，且正向回交3代子2代具有更高的適合度。因此在防范轉(zhuǎn)基因油菜抗性基因逃逸的策略上在防范初始雜交發(fā)生的同時，也應(yīng)該防范回交后代的產(chǎn)生。

植物競爭是植物間對限制性資源(肥、水、光、空間等)需求的一種相互關(guān)系，只要植物共享某種資源就會存在競爭[44]。許多研究表明競爭是影響后代適合度的主要因子之一。Halfhill等[45]發(fā)現(xiàn)無競爭條件下，轉(zhuǎn)基因油菜與蕪菁的回交后代的干生物量顯著大于親本轉(zhuǎn)基因油菜，但種間競爭條件下，回交后代的單株干生物量明顯低于親本轉(zhuǎn)基因油菜。在與小麥競爭的情況下，栽培向日葵(Helianthusannuus)與野生向日葵的雜交1代及野生向日葵的結(jié)實能力均明顯下降[22]。在無競爭的情況下，野蘿卜的結(jié)實能力明顯大于栽培蘿卜(R.sativus)和野蘿卜的雜交后代，但在競爭的條件下， 野蘿卜的結(jié)實能力顯著下降，從而縮小了雜交后代與野蘿卜在生殖適合度上的差異[21]。在競爭環(huán)境條件下，野蘿卜和栽培蘿卜的雜交后代能產(chǎn)生更多的種子，提高了雜種定植成功的可能性[23]。因此在田間條件下，研究攜帶抗性基因的回交后代在競爭條件下的適合度對深入了解轉(zhuǎn)基因油菜向野芥菜的滲入有重要參考價值。

種植密度對物種的競爭能力有顯著影響。高密度下的個體間在光照、養(yǎng)分和生長空間方面競爭激烈，單株占有空間少，獲得的光照、養(yǎng)分也相對少，這就阻礙了其高度、葉面積和生物量等的增長[46]。張嵐[47]對高羊茅(Festucaarundinacea)、黑麥草(Loliumperenne)、早熟禾(Poaannua)單種與混種的初期競爭動態(tài)的研究發(fā)現(xiàn)，各物種的鮮生物量的增速隨群落密度的增大而降低。張宏彬等[48]對含有轉(zhuǎn)基因和不含轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)Bt基因栽培稻和雜草稻的F2群體進(jìn)行了田間混種試驗，發(fā)現(xiàn)高密度下混種的群體適合度小于低密度混種下的適合度。除種植密度，混種比例對后代植物的競爭能力也有顯著影響。一般在混合種植時，數(shù)量上占優(yōu)勢的植株能產(chǎn)生更多的種子，表現(xiàn)出更優(yōu)異的生存競爭能力。這在黑麥草(Loliummultiflorum)和箭筈豌豆(Viciasativa)[49]以及小黑麥在不同混種比例下的競爭能力中得到證實[50]。在轉(zhuǎn)基因油菜與野生近緣種后代的適合度研究中也有類似的研究結(jié)果。Johannessen等[51]在以油菜作為母本和蕪菁為父本的基因漂移研究中證實高密度能降低油菜的營養(yǎng)生長能力，且油菜比例增加能提高其生物量。

本試驗在田間條件下研究了抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野芥菜的回交3代子1代、子2代和野芥菜在低、高兩種密度下混種(4∶1、3∶2、1∶1比例)時的適合度。試驗結(jié)果表明，在低密度4∶1和3∶2條件下，正反回交3代子1代以及反向回交3代子2代的適合度都顯著低于野芥菜，只有正向回交3代子2代的適合度與野芥菜相似，在1∶1條件下，正向回交3代子1代和子2代的適合度與野芥菜相當(dāng)；在高密度下，正反回交3代子1代和子2代的適合度都顯著低于野芥菜。各后代的地上部單株干生物量、單株有效角果數(shù)以及種子重量與種植密度、比例的相關(guān)性分析也顯示這些適合度成分與密度呈顯著負(fù)相關(guān)，且高密度下與混種比例呈正相關(guān)。

競爭條件下即混種與無競爭條件即單種的結(jié)果明顯不同，競爭導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因油菜與野芥菜的回交3代子1代和子2代適合度降低。因此在田間或野外環(huán)境存在競爭的情況下，攜帶抗性基因的回交3代子1代和子2代的生存競爭能力較野芥菜弱。盡管如此，在本試驗條件下，供試的回交后代都能正常生長，完成開花結(jié)實，平均最低也能產(chǎn)生約800個有效角果，且每角飽粒數(shù)最低也在14粒，單株能形成11200粒種子。因此即使在競爭條件下后代的適合度有所降低，還是可能給雜草防除帶來威脅。

選擇壓對后代適合度也有顯著影響。Londo等[52]報道路邊噴施草甘膦的霧滴漂移也能導(dǎo)致攜帶抗性基因的抗草甘膦油菜和蕪菁回交后代適合度的提高。農(nóng)田除草劑的噴施對轉(zhuǎn)基因作物-雜草的雜交后代提供了選擇壓，轉(zhuǎn)基因使抗性后代表現(xiàn)出選擇優(yōu)勢，從而提高了后代的適合度，這可能會增加后代的雜草性。Londo等[53]的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)沒有蟲壓和除草劑選擇壓時，抗蟲和抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜的生物量、種子產(chǎn)量、相對繁殖力均比非轉(zhuǎn)基因油菜低；而當(dāng)存在蟲壓和除草劑選擇壓時，抗蟲和抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜的種子產(chǎn)量有所提高，適合度也有所提高。因此，本試驗有待進(jìn)一步研究除草劑選擇壓特別是不同草丁膦選擇壓對抗性后代適合度的影響。

本試驗設(shè)計的田間條件下，在有競爭的條件下，供試回交后代的生存適合度大多數(shù)情況下都沒有野芥菜高，但是在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因油菜田中，在人工噴施除草劑后，沒有抗性基因的野芥菜或回交后代會死亡，而攜帶抗性基因的后代則會存活下來，因此在田間實際環(huán)境條件下可能引起的生態(tài)風(fēng)險不容忽視。

4 結(jié)論

本試驗中，單種條件下，在低密度(15株/區(qū))時，抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野芥菜的正反回交3代子1-2代的總適合度與野芥菜相當(dāng)；混種條件下，在低密度(15株/區(qū))各混種比例下，正向回交3代子2代的總適合度與野芥菜相當(dāng)。因此，務(wù)必防范轉(zhuǎn)基因油菜的抗性基因向野芥菜的漂移。防范轉(zhuǎn)基因油菜基因逃逸時首先要加強轉(zhuǎn)基因油菜的進(jìn)出口及加工過程中的運輸管理，防治油菜種子逃逸；其次，隔離種植轉(zhuǎn)基因油菜，周圍設(shè)置隔離帶，外圍種植其他作物，避免通過花粉介導(dǎo)的基因漂移；再次，播種和收獲過程中要徹底清洗各種機(jī)械和工具，且在種子自然脫落前進(jìn)行收獲，避免轉(zhuǎn)基因種子遺落在田間。此外，若轉(zhuǎn)基因油菜或者與野芥菜的回交后代種子散落在田間，由于自身的休眠特性，會保留在田間種子庫中，可翻耕農(nóng)田且適時休耕，待種子庫中回交后代種子及轉(zhuǎn)基因油菜種子產(chǎn)生自生苗后進(jìn)行防除。一旦發(fā)現(xiàn)回交后代自生苗時應(yīng)立即進(jìn)行防除，防止回交后代與野芥菜的再次回交；同時應(yīng)輪換施用不同作用靶標(biāo)的除草劑，防止抗藥性雜草的產(chǎn)生，以保證防除效果。

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Fitnessofresistantbackcrossgeneration(BC3F2-3)betweenglufosinate-resistanttransgenicoilseedrapeandwildBrassicajuncea

WANG Xiao-Lei, WANG Jian, ZHANG Qing-Ling, YAN Jing, QIANG Sheng, SONG Xiao-Ling*

WeedResearchLab,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China

One of the concerns about releasing transgenic herbicide-resistant oilseed rape (Brassicanapus, AACC=38) is that herbicide-resistant (HR) transgenes from transgenic oilseed rape may escape to wildBrassicajuncea. If this happens, wildB.junceawith the HR trait might pose new problems for weed control. Therefore, it is necessary to evaluate gene flow from HR transgenic oilseed rape to wildB.junceabefore it is released. The fitness components and composite fitness of BC3mF2, BC3pF2, BC3mF3 and BC3pF3 (m=backcross progeny obtained with wildB.junceaas maternal plants; p=backcross progeny obtained with wildB.junceaas paternal plants.) between glufosinate-resistant transgenic oilseed rape and wildB.junceaunder different densities and different planting proportions were measured in the field. In pure plots, the composite fitness of BC3F2 and BC3F3 were not different to wildB.junceaeither at low density (15 plants/plot), or high density (30 plants/plot). In mixed plots, at low density under 4∶1, 3∶2 proportions, the composite fitness of the backcross generations was lower than that of wildB.junceaexcept for BC3mF3, which was similar to wildB.juncea. Under 1∶1 proportion, the composite fitness of the backcross generations was lower than that of wildB.junceaexcept for BC3mF2 and BC3mF3, which were similar to wildB.juncea. At high density, the composite fitness of all backcross generations was lower than that of wildB.junceairrespective of proportions. There was no correlation between fitness components of BC3mF3 and planting density. BC3F2 and BC3F3 between glufosinate-resistant transgenic oilseed rape and wildB.junceahave the ability to establish in field, particularly BC3mF3. Therefore, hybridization between transgenic oilseed rape and wildB.juncea, including backcrosses between wildB.junceaand F1or subsequent generations, should be prevented.

glufosinate-resistant transgenic oilseed rape (Brassicanapus); wildBrassicajuncea; backcross generation; fitness

10.11686/cyxb2017129http//cyxb.lzu.edu.cn

王曉蕾, 王建, 張慶玲, 閆靜, 強勝, 宋小玲. 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野芥菜的抗性回交3代子1代和子2代的適合度. 草業(yè)學(xué)報, 2017, 26(12): 138-151.

WANG Xiao-Lei, WANG Jian, ZHANG Qing-Ling, YAN Jing, QIANG Sheng, SONG Xiao-Ling. Fitness of resistant backcross generation (BC3F2-3) between glufosinate-resistant transgenic oilseed rape and wildBrassicajuncea. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(12): 138-151.

2017-03-21；改回日期：2017-05-17

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項子課題(2016ZX08012005-006)和國家自然科學(xué)

基金項目(31270579)資助。

王曉蕾(1994-)，女，安徽滁州人，在讀碩士。*通信作者Corresponding author. E-mail: sxl@njau.edu.cn