脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)的研究進展及臨床應(yīng)用概況

姜 倩，岳 冬，顧忠偉,2

(1.四川大學 國家生物醫(yī)學材料工程技術(shù)研究中心， 四川 成都 610064)(2.南京工業(yè)大學材料科學與工程學院，江蘇 南京 211816)

脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)的研究進展及臨床應(yīng)用概況

姜 倩1，岳 冬1，顧忠偉1,2

(1.四川大學 國家生物醫(yī)學材料工程技術(shù)研究中心， 四川 成都 610064)(2.南京工業(yè)大學材料科學與工程學院，江蘇 南京 211816)

從1965年人類第一次發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)體開始，這種雙分子層閉合囊泡耗費了漫長的時間從用于生物物理研究到成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的重要傳遞系統(tǒng)。納米尺度，生物膜相似的結(jié)構(gòu)，優(yōu)良的生物相容性等特點都是脂質(zhì)體作為傳遞系統(tǒng)的優(yōu)勢，特別是其易于進行表面改性的表面高密度功能基團對脂質(zhì)體的優(yōu)化極為有利。脂質(zhì)體作為藥物傳遞系統(tǒng)是通過利用脂質(zhì)分子的雙親性將親水性藥物或者疏水性藥物包載于囊泡的內(nèi)部水相或者脂質(zhì)膜中。此外，陽離子脂質(zhì)分子具有壓縮基因或者吸附蛋白質(zhì)的能力，故其又可以作為生物大分子載體加以利用。而裝載了MRI(核磁共振成像)分子探針、NIR(近紅外光譜技術(shù))分子探針或者其他診斷試劑的脂質(zhì)體還可用于疾病診斷。脂質(zhì)體共載體系則是充分利用脂質(zhì)體的荷載能力，將多種治療劑或者分子探針裝載于同一傳遞系統(tǒng)中，以達到協(xié)同治療或診療一體的目的。系統(tǒng)地論述了脂質(zhì)體的設(shè)計與優(yōu)化、內(nèi)容物的選擇以及目前的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀。

脂質(zhì)體；藥物傳遞；生物大分子傳遞；分子探針；共載體系

1 前 言

50多年前，英國人Alec Bangham[1]發(fā)現(xiàn)了磷脂分子在水中自發(fā)形成閉合的雙分子層囊泡。之后的研究者發(fā)現(xiàn)通過利用囊泡不同部位的親和性可以將親水性或親脂性藥物包載于脂質(zhì)體內(nèi)部水相或者雙分子膜相中，將脂質(zhì)體引入了藥物或者基因治療的領(lǐng)域。脂質(zhì)體作為一種載體，具有的類細胞膜結(jié)構(gòu)、高生物相容性、低免疫原性、能保護藥物或者活性基團、延長藥物半衰期、增效減毒等一系列優(yōu)勢，也使其在隨后的50年發(fā)展中備受矚目。為了獲得更加優(yōu)異的脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)，人們開始在經(jīng)典脂質(zhì)分子的基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)變化、表面修飾以獲得具有不同生物效應(yīng)的新型脂質(zhì)體，大大拓展了脂質(zhì)體在生物醫(yī)學上的應(yīng)用[2]。與此同時，脂質(zhì)體作為一種傳遞系統(tǒng)，不僅僅活躍于科學研究中，更是早在1985年便已進入了臨床研究階段[3]。現(xiàn)如今，至少40余種脂質(zhì)體藥物已經(jīng)成功上市或者處于不同的臨床研究階段，這充分體現(xiàn)了脂質(zhì)體藥物的未來應(yīng)用前景。本文總結(jié)了近年來對脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)設(shè)計、生物醫(yī)學應(yīng)用以及臨床應(yīng)用等方面的研究概況，希望能對后續(xù)的脂質(zhì)體研究與開發(fā)提供借鑒。

2 脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)設(shè)計

組成脂質(zhì)體的脂質(zhì)分子主要分為經(jīng)典脂質(zhì)分子與新型類脂分子，這兩者均屬于兩親性分子，一般由親水性頭部、疏水性尾部以及連接鍵三部分構(gòu)成。

2.1 脂質(zhì)分子的親水性頭部

脂質(zhì)分子的親水性頭部按所帶電荷分為三種，分別是陽離子頭部、陰離子頭部以及中性頭部。其中以陽離子頭部最為常見。首先陽離子頭部有助于載體與負電性的細胞膜相互吸引，從而增加入胞率；其次是含有伯胺和仲胺的陽離子頭部可以通過“質(zhì)子海綿效應(yīng)”完成溶酶體逃逸，以防溶酶體對治療劑的降解。除此之外，荷載了藥物或者分子探針的陽離子脂質(zhì)體還可以壓縮負電性生物大分子，這就實現(xiàn)雙載的目的。經(jīng)典的脂質(zhì)分子一般都以類甘油作為骨架，并在甘油骨架的三個分支上分別連接上兩條碳氫鏈作為尾部以及一個季銨作為頭部。所以，經(jīng)典脂質(zhì)分子一般以單銨基作為頭部。以1987年Felgner與其同事[4]發(fā)明的DOTMA(2,3-二油酰氧丙基-1-溴化三甲胺)作為開端，DOTAP((2,3-二油酰基-丙基)-三甲胺)、DDAB(溴化二甲基雙十八烷基銨)、CTAB(溴化三甲基十六烷基銨)等均是在此結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進行變化而成(如圖1所示)[5-7]。除此之外，對單銨基頭部的細微改動可以獲得具有相似的物理化學性質(zhì)的衍生物。Wolff等[8]將羥乙基替換銨基上的甲基又獲得了DORIE 或者DMRIE，這些脂質(zhì)分子在體外和體內(nèi)實驗中均體現(xiàn)了比DOTAP更好的穿膜能力。

由于季銨類頭部在任何pH環(huán)境中均顯示正電性，在提供了強大的DNA吸附能力的同時，也使其失去了緩沖能力。因此，研究者開發(fā)了一系列具有多氨基頭部的脂質(zhì)體以改善脂質(zhì)體的緩沖能力。其中，商品化脂質(zhì)體Lipofectamine 2000的組分之一——DOSPA的設(shè)計理念便是如此(如圖1所示)，在保證了季銨基產(chǎn)生強正電性的同時，還加入了聚氨基使之具有質(zhì)子緩沖能力，增加了載體在溶酶體中的逃逸能力，顯著的增強陽離子脂質(zhì)體在胞內(nèi)遞送的效果[9]。

圖1 經(jīng)典陽離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)示意圖[7]Fig.1 Schematic diagram of structure of cationic liposome[7]

不可忽視的是，DOSPA在獲得更強的基因傳遞能力的同時，也帶來了更高的細胞毒性。為了設(shè)計出低毒高效的脂質(zhì)分子，使用內(nèi)源性的氨基酸構(gòu)建脂質(zhì)分子就成為了一個極好的選擇。最初，人們選擇僅用一個氨基酸作為脂質(zhì)分子的親水性頭部。Obata等以及Gu等課題組[10, 11]均設(shè)計了以單一精氨酸、賴氨酸和組氨酸為頭部的脂質(zhì)分子，發(fā)現(xiàn)通過利用精氨酸的穿膜能力，賴氨酸的質(zhì)子緩沖能力以及組氨酸的pH敏感能力均能有效的提升載體的基因轉(zhuǎn)染能力。為了進一步提升轉(zhuǎn)染效果，由多個氨基酸組成的聚氨基酸類以及肽類樹狀大分子作為頭部加入脂質(zhì)分子。由于肽類樹狀大分子具有類似蛋白一樣的球狀結(jié)構(gòu)，并且其多價結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的功能放大，耐蛋白酶水解等優(yōu)勢，Jiang等[12, 13]選擇使用以上3種氨基酸構(gòu)成的二代樹狀分子作為頭部，并通過共聚焦和流式實驗發(fā)現(xiàn)以二代精氨酸為頭部的脂質(zhì)分子表現(xiàn)出了最優(yōu)的轉(zhuǎn)染效率，這要歸功于精氨酸所具有的類穿膜肽能力和抗血清能力，可以顯著增強載體的入胞、溶酶體逃逸以及入核的能力。并且其在體內(nèi)實驗中也表現(xiàn)出良好的轉(zhuǎn)染效果，此類載體通過進一步的優(yōu)化，有望獲得更廣闊的應(yīng)用前景。

2.2 脂質(zhì)分子的疏水性尾部

研究表明疏水性尾部的選擇會影響脂質(zhì)體疏水空腔的體積和親水部分與疏水部分的比例，因此脂質(zhì)分子的疏水性尾部同樣對脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)起到至關(guān)重要的作用。一般來說，疏水尾部分為脂肪烴類和膽固醇類兩種。在基因遞送方面，對于大多數(shù)以脂肪烴類為尾部的經(jīng)典脂質(zhì)分子來說，單尾的脂質(zhì)分子比雙尾的脂質(zhì)分子的毒性大而轉(zhuǎn)染效率低。Pinnaduwage等[14]報道了CTAB的毒性明顯強于DOTMA，轉(zhuǎn)染效率卻低于DOTMA。但對于一些結(jié)構(gòu)特定的脂質(zhì)體，仍然會出現(xiàn)一些特例，Tang 和Hughes[15]曾報道過，具有單尾的6-(2,5-二氨基-戊酰氧基)己酯卻有著比雙尾的DOTAP更高的轉(zhuǎn)染效率和更低的毒性。除了碳氫鏈數(shù)量會影響載體效能外，尾部的長度和飽和度同樣是重要的影響因素。Koynova等[16]合成了一系列具有不同長度和不同飽和度碳氫鏈尾部的脂質(zhì)分子，并對它們的生物學效應(yīng)進行評價，發(fā)現(xiàn)隨著尾部長度和不飽和度的增加，載體的轉(zhuǎn)染效能也隨之增加。Obata等[11]也發(fā)現(xiàn)了相似的現(xiàn)象。

Li等[10]通過比較3種膽固醇衍生物(lysinylated cholesterol, histidinylated cholesterol和 argininylated cholesterol)的基因轉(zhuǎn)染能力(如圖2所示)，發(fā)現(xiàn)以膽固醇為尾部的脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率高于DOTAP幾十倍。但是大部分的膽固醇類衍生物脂質(zhì)分子都是蛋白質(zhì)激酶C(protein kinase C，PKC)的抑制劑，而PKC是一種與細胞毒性相關(guān)的激酶。因此，膽固醇類衍生物脂質(zhì)分子一般都具有較大的細胞毒性。Kawakami等[17]所合成的半乳糖化的膽固醇衍生物Gal-C4-Chol(cholesten-5-yloxyN-(4-((1-imino-c-β-D-thiogalactosyl-ethyl)amino)butyl)formamide)則在人肝癌細胞(HepG2)實驗中表現(xiàn)出較低的細胞毒性，說明了通過獨特的設(shè)計也能有效的降低膽固醇衍生物帶來的細胞毒性。

圖2 以氨基酸為頭部的陽離子脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)示意圖[10]Fig.2 Chemical structure of amino acid-based cationic lipids[10]

2.3 脂質(zhì)分子的連接鍵

通常連接脂質(zhì)分子親、疏水端的連接鍵都是酯鍵、醚鍵以及酰胺鍵。其中以醚鍵作為連接鍵的脂質(zhì)分子具有較高的轉(zhuǎn)染效率，但由于醚鍵過于穩(wěn)定，不易降解的特性卻增加了脂質(zhì)體的細胞毒性。相較而言，以酯鍵及酰胺鍵作為連接鍵的陽離子脂質(zhì)體(如，DOTAP等)則具有更好的生物降解性和更低的細胞毒性[18-20]。對比穩(wěn)定的PEI載體，Xu等[12]所合成的以酰胺鍵連接的脂質(zhì)分子所具有的不僅是更強的基因傳遞能力，還有更高的細胞存活率(大于90%)。在體內(nèi)循環(huán)時，以此為鏈接鍵的脂質(zhì)體存在被體內(nèi)酰胺酶和酯酶降解的可能性，這一點在科學及臨床研究中也是不可忽視的[21]。

為了在保證脂質(zhì)體體內(nèi)穩(wěn)定性的同時，進一步降低其細胞毒性，在脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)中加入環(huán)境響應(yīng)型連接鍵。這類脂質(zhì)體能在正常組織環(huán)境中保持穩(wěn)定，而在特定的環(huán)境下通過環(huán)境敏感鍵的響應(yīng)完成治療劑的定位釋放以及生物降解。早在1998年，Tang和Hughes[22]就嘗試在陽離子脂質(zhì)分子中加入二硫鍵。這種脂質(zhì)分子所構(gòu)成的脂質(zhì)體可以在含有較高谷胱甘肽濃度的腫瘤細胞中進行定向的降解和釋放基因，其轉(zhuǎn)染效率是DOTAP/DOPE組成的脂質(zhì)體的50倍。這種結(jié)構(gòu)在近些年來依然應(yīng)用廣泛，例如Wang等[23]設(shè)計的脂質(zhì)體遞藥系統(tǒng)同樣是利用二硫鍵在細胞內(nèi)的斷裂來釋放所荷載的藥物。同時，利用正常組織、腫瘤組織以及細胞內(nèi)含/溶酶體之間的pH階梯式變化，設(shè)計出能夠在低pH條件下降解的脂質(zhì)體更是數(shù)不勝數(shù)，常用的pH敏感型連接鍵有原酸酯鍵[24]、氨基甲酸酯[25]、腙鍵[26]等。

3 脂質(zhì)體的功能化修飾

由于機體炎癥部位或者實體瘤的血管內(nèi)皮細胞排列不如正常組織致密，因此脂質(zhì)體可以穿過血管壁對炎癥部位或者實體瘤進行滲透，即高通透性和滯留效應(yīng)(Enhanced Permeability and Retention Effect，EPR效應(yīng))。但要利用該效應(yīng)，首先要保證脂質(zhì)體能長久而穩(wěn)定地參與體循環(huán)。但是陽離子脂質(zhì)體在體內(nèi)循環(huán)時會與血漿蛋白發(fā)生非特異性吸附，且存在易降解、易被巨噬系統(tǒng)清除、靶向性不高等問題，因此很多脂質(zhì)體雖然在細胞實驗中表現(xiàn)出不俗的效果，但是卻很難應(yīng)對復(fù)雜的體內(nèi)環(huán)境。近些年來人們?yōu)榱双@得在體內(nèi)有效的脂質(zhì)體，開始對脂質(zhì)體的功能進行進一步的優(yōu)化。

3.1 PEG化

由于進入體循環(huán)的陽離子脂質(zhì)體與負電性的血漿蛋白相互作用，導(dǎo)致其易被單核-巨噬細胞系統(tǒng)(Mononuclear Phagocyte System，MPS)攝取而使血藥濃度快速下降，最終蓄積于肝臟和脾臟等器官中。顯然，這一現(xiàn)象不僅減少了藥物在靶組織(非MPS相關(guān)組織)的分布，而且還會對蓄積器官造成一定損傷。為了解決這一問題，人們首先嘗試了預(yù)注射大量的空白脂質(zhì)體的方法以封閉 MPS，再注射載藥脂質(zhì)體的方式增加脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)半衰期。Kao等[27]通過考察Tc 標記的脂質(zhì)體的體內(nèi)分布情況，發(fā)現(xiàn)MPS 封閉組的組織放射性強于未封閉組1.5倍之多，同時每克腫瘤的放射強度是其他組織的2倍。

但對于臨床治療來說，封閉法并非最佳的解決辦法，因而改變脂質(zhì)體性質(zhì)以延長體內(nèi)循環(huán)時間就成為了研究的重點。由于脂質(zhì)體與體內(nèi)蛋白產(chǎn)生的非特異性吸附作用是其被快速清除的潛在因素，因此首先考慮屏蔽脂質(zhì)體的電荷?；诖怂悸罚珺lume等[28]和 Klibanov等[29]取得了里程碑式的進展。他們率先使用聚乙二醇(Polyethylene Glycol，PEG)修飾脂質(zhì)體，PEG分子可在脂質(zhì)體表面形成空間立體組層，從而屏蔽了正電荷與蛋白質(zhì)的相互作用，降低其被MPS 識別攝取的概率，顯著延長了脂質(zhì)體在體內(nèi)的循環(huán)時間，故被稱為“長循環(huán)脂質(zhì)體”。Nie等[30]也發(fā)現(xiàn)PEG化的陽離子脂質(zhì)體(CL)和陰離子脂質(zhì)體(AL)的體內(nèi)循環(huán)時間和穩(wěn)定性均高于中性脂質(zhì)體(NL)，且CL和AL荷載了阿霉素(DOX)產(chǎn)生的抑瘤效果同樣優(yōu)于NL(70%vs45%, p < 0.05，如圖3所示)，說明PEG化的脂質(zhì)體更適應(yīng)體內(nèi)環(huán)境，而延長體內(nèi)循環(huán)時間的脂質(zhì)體更易通過EPR效應(yīng)在腫瘤部位富集。另外，其他類似的聚合物如聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯嗎啉、聚丙酰胺、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚(2-甲基-2-噁唑啉)等也可制備長循環(huán)脂質(zhì)體。

圖3 靜脈注射荷載DOX的PEG化脂質(zhì)體后，小鼠的腫瘤體積變化(a)和抑瘤率(b)[30]Fig.3 In vivo anti-tumor activity of liposomes after i.v. injection of different DOX-loaded PEGylated liposomes with DOX. The tumor volume in different treatment groups.(*p < 0.05 vs control group) (a). Tumor inhibition rates of various formulations (b)[30]

PEG化脂質(zhì)體不僅解決了脂質(zhì)體易被MPS系統(tǒng)清除的問題，還避免了或者極大程度上減輕了脂質(zhì)體的免疫原性。但是PEG化脂質(zhì)體也有不可否認的缺陷，比如PEG外殼如果無法及時在腫瘤組織脫去，會嚴重影響細胞吞噬效率低或?qū)е氯苊阁w逃逸失敗[31]。除此之外，Dams等[32]還發(fā)現(xiàn)PEG化脂質(zhì)體具有“加速血液清除”(ABC)現(xiàn)象，這種現(xiàn)象發(fā)生于大鼠首次靜脈注射PEG化脂質(zhì)體后，間隔一定時間再次注射該脂質(zhì)體時，其藥代動力學行為會發(fā)生異常的改變。Zhao等[33]的研究表明，ABC現(xiàn)象在首次皮下注射PEG 化脂質(zhì)體后，間隔7 d進行二次靜脈注射也會被誘發(fā)，并且皮下注射誘導(dǎo)產(chǎn)生的ABC現(xiàn)象比靜脈注射的更為強烈。該現(xiàn)象的產(chǎn)生不僅會極大減弱 PEG 化制劑的長循環(huán)優(yōu)勢，而且還會由于其藥動學行為的改變使得包封藥物、基因等在體內(nèi)產(chǎn)生嚴重毒副作用，因此采取一定措施減弱或消除 ABC 現(xiàn)象對 PEG化載體來說迫在眉睫。

3.2 特異性主動靶向

鑒于脂質(zhì)體本身的特性(如，粒徑，表面電位以及形狀等)，可利用脂質(zhì)體易被單核-巨噬細胞系統(tǒng)攝取使得脂質(zhì)體靶向MPS相關(guān)器官(如肝臟或者腎臟)，或者利用毛細淋巴管的基底膜不完整或缺失造成的上皮細胞間隙通透性富集脂質(zhì)體于淋巴組織。但對于實體瘤來說，僅僅只靠EPR效應(yīng)是無法保證藥物在腫瘤組織的蓄積量[34, 35]。因此在脂質(zhì)體上修飾與靶細胞特異性或非特異性結(jié)合的分子(如抗體、多肽等)，利用抗原-抗體、受體-配體作用機制完成主動識別靶組織和/或靶細胞。下面分別介紹抗體、葉酸、多糖、蛋白和多肽以及寡核苷酸適配子等常用靶向分子(如圖4所示)。

抗體是最早被應(yīng)用于主動靶向脂質(zhì)體設(shè)計中的。在1975年就有報道IgM修飾的脂質(zhì)體的入胞效率高出無修飾組的100倍[37]。這種修飾了單克隆抗體或其片段的脂質(zhì)體又稱為“免疫脂質(zhì)體”，其通過利用抗體與抗原的特異性結(jié)合將脂質(zhì)體靶向目的組織，并識別表面過度表達抗原的靶細胞。常用于修飾的抗體可分為3類：完整抗體、抗體片段和單鏈抗體(scFv)。三者之中，由于抗體片段在具有免疫原性低，性質(zhì)易控等優(yōu)點的同時，依然能特異性結(jié)合細胞表面抗原，而更為常用[35]。還有報道表明由于抗體片段修飾的脂質(zhì)體具有良好的藥物代謝分布和較長的血液循環(huán)時間，使得脂質(zhì)體更易滲透入實體腫瘤組織[38]。

鑒于葉酸分子與細胞膜上表達的葉酸受體或葉酸結(jié)合蛋白之間具有極高的親和力(KD ～ 10-9)，使之成為了在靶向傳遞中應(yīng)用最為廣泛的配體之一[35]。加上葉酸受體過量表達于卵巢癌、子宮癌、骨肉瘤、腦膜瘤等各種癌細胞上而正常組織表達較少，所以Patil等[39]制備了修飾有葉酸分子的絲裂霉素C脂質(zhì)體，并應(yīng)用于過表達葉酸受體的KB HiFR細胞系，結(jié)果表明加入靶向分子的脂質(zhì)體所表現(xiàn)的細胞殺傷力強于未修飾脂質(zhì)體。

由于人體某些組織細胞膜上還大量表達能與糖基特異性結(jié)合的受體，所以可在脂質(zhì)體雙分子層中摻入多糖制備出的糖基脂質(zhì)體?？蓳饺氲亩嗵前ò肴樘恰⑼该髻|(zhì)酸、甘露(聚) 糖衍生物、 支鏈淀糖、右旋糖苷等。其中一個例子就是Ravar等[40]利用覆蓋了透明質(zhì)酸的脂質(zhì)體成功增強了細胞對紫杉醇脂質(zhì)體的內(nèi)吞作用，并在小鼠的體內(nèi)試驗中發(fā)現(xiàn)靶向脂質(zhì)體在腫瘤組織處的蓄積量高于單純藥物或者無靶向組。

蛋白類靶向分子中最具代表性的是轉(zhuǎn)鐵蛋白 (Transferrin Receptor，TfR)，它是一種大量表達于代謝旺盛且需要大量鐵的組織如腫瘤細胞、 血腦屏障的細胞膜糖蛋白[41]。Leto和同事[42]將親水的轉(zhuǎn)鐵蛋白和親脂的青蒿素共價連接形成雙親性脂質(zhì)分子，其構(gòu)成的脂質(zhì)體在回盲腸癌細胞HCT-8中表現(xiàn)出的內(nèi)吞效率和細胞毒性均高于無轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的脂質(zhì)體，說明TfR確實能顯著增加脂質(zhì)體對癌細胞的靶向性。而多肽作為配體分子，相比于大分子量的蛋白質(zhì)具有易制備、免疫原性低及穩(wěn)定性高的特點[2]。αVβ3整合素是一種高表達于腫瘤細胞并參與血管再生的常用受體[43]。而與之對應(yīng)的是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)多肽。Sonali等[44]制備了RGD多肽修飾的藥物-分子探針雙載脂質(zhì)體(RGD-TPGS)，評價其在小鼠體內(nèi)的腦靶向效果。結(jié)果顯示注射RGD-TPGS 2和4 h后的腦組織熒光強度分別是無靶向組的6.47和6.98倍，說明修飾RGD會明顯增強脂質(zhì)體的靶向效果。

使用寡核苷酸適配子作為靶向配基是一種革新的技術(shù)。寡核苷酸適配子是一種來源于RNA或者DNA的寡核苷酸短鏈(～15kD)。由于寡核苷酸適配子具有分子量小、缺乏免疫原性、更易進行腫瘤滲透和靶向以及不會被化學修飾改變親和力等優(yōu)勢，使其在靶向脂質(zhì)體的設(shè)計中具有極高的潛力[35]。

3.3 環(huán)境敏感

在脂質(zhì)體傳遞治療劑的過程中，所處的微環(huán)境會出現(xiàn)動態(tài)變化，因而很多新型脂質(zhì)體依據(jù)這些微環(huán)境變化(如機體自身的pH、酶、溫度等)而使其在特定病灶組織釋放荷載物，這被稱為“觸發(fā)釋放”。從脂質(zhì)體進入機體血循環(huán)開始，到將荷載物傳遞入細胞質(zhì)或細胞核為止，微環(huán)境會出現(xiàn)如下變化：①兩次pH梯度式降低，包括從周圍正常組織進入腫瘤組織的pH變化(腫瘤組織pH < 6.5，正常組織pH ～ 7.4)和載體進入細胞內(nèi)含體/溶酶體后pH再次下降(pH < 5.5)[45]；②血漿(2.8 μM)與細胞質(zhì)(1～10 mM)之間還原型谷胱甘肽(GSH)濃度的差異[46]；③腫瘤組織高表達磷脂酶A2、組織蛋白酶或基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinase，MMP)等[47-49]。

pH敏感型脂質(zhì)體是應(yīng)用較廣泛的一種環(huán)境敏感型脂質(zhì)體。因為pH敏感型脂質(zhì)體可以通過結(jié)構(gòu)設(shè)計改變響應(yīng)方式從而實現(xiàn)不同的功能。①在脂質(zhì)體中加入最經(jīng)典的pH 敏感脂質(zhì)——DOPE及其衍生物，這種脂質(zhì)體能夠在內(nèi)含體環(huán)境下發(fā)生層狀至六角狀的相變(Lα→HII)，繼而破壞內(nèi)含體膜，增加脂質(zhì)體逃出溶酶體的概率[50, 51]。②在脂質(zhì)體中加入或者修飾能夠具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”的基團或分子。例如Shigeta等[52]設(shè)計了一種用組氨酸修飾的陽離子脂質(zhì)體，由于組氨酸的咪唑環(huán)在pH 6.0左右會質(zhì)子化，繼而脹破內(nèi)含體膜，避免了DNA在內(nèi)含體中的降解，增強了DNA的轉(zhuǎn)染效率。③pH響應(yīng)型電荷翻轉(zhuǎn)脂質(zhì)體。如圖5所示，Jiang等[53]使用二甲基馬來酸酐(DMA)修飾的DSPE制備成荷載紫杉醇的脂質(zhì)體(DSPE-Lys-DMA，DLD)。負電性的DMA在微酸環(huán)境中可以與陽離子氨基脫離，使得脂質(zhì)體在腫瘤組織處發(fā)生負電荷到正電荷的電荷翻轉(zhuǎn)，因而利于DLD在pH 6.8時與負電性細胞膜吸附以增加入胞量。④pH降解脂質(zhì)體，在“脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)設(shè)計”一節(jié)已有具體論述。

圖5 pH敏感型脂質(zhì)體的遞藥示意圖[53]Fig.5 Schematic design of pH-sensitive Trojan horse liposomes for tumor drug delivery[53]

對于還原敏感型脂質(zhì)體的報道雖然也相當多，但是主要為加入二硫鍵的還原降解脂質(zhì)體，在“脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)設(shè)計”一節(jié)已有具體論述。然而，Yue等[54]對以二硫鍵(OEI-SSx)和二硒鍵(OEI-SeSex)為連接鍵的OEI進行對比，結(jié)果表明經(jīng)過10 mM GSH的處理后，OEI-SeSex/DNA復(fù)合物的粒徑、電位以及形態(tài)均發(fā)生明顯改變，而OEI-SSx/DNA復(fù)合物經(jīng)過10 μM GSH處理后就有相似改變，說明二硒鍵同樣具有還原響應(yīng)能力，但是其響應(yīng)能力弱于二硫鍵。因此，可以考慮設(shè)計出含有二硒鍵的還原敏感型脂質(zhì)體。

由于MMP在腫瘤組織中特異的高表達，且MMP-2和 MMP-9 與人體腫瘤的生長都有著密切關(guān)系[55]。因此利用 MMPs 進行酶觸發(fā)釋放藥物可提高抗腫瘤效率。Ji等[56]合成了用β-環(huán)糊精修飾的MMP-2敏感型脂質(zhì)體，其進入腫瘤組織后被MMP-2酶分為兩個功能基團，一為可以釋放抗纖維化藥物的β-環(huán)糊精，一為可以釋放化療藥物的RGD修飾的脂質(zhì)體。這種脂質(zhì)體在星狀胰腺細胞中能夠明顯增強藥物入胞的功能。

除了借助腫瘤組織與正常組織之間的環(huán)境差異來增加脂質(zhì)體的靶向效率外，利用腫瘤治療過程中產(chǎn)生的環(huán)境變化也是一種設(shè)計思路。例如，通過局部加熱腫瘤組織至41 ～ 45 ℃并維持數(shù)十分鐘以上，可以有效殺死腫瘤細胞[49]。而溫敏脂質(zhì)是一種在相變溫度 ( Phase Transition Temperature，θm)時，其脂膜可由“膠晶”態(tài)轉(zhuǎn)變到“液晶”態(tài)，而脂質(zhì)的脂酰鏈紊亂度及活動度增加， 增大了膜流動性，從而加快了藥物的釋放。二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)就是一種典型的溫敏脂質(zhì)(θm = 42 ℃)。Pradhan等[57]按80∶20∶4.5∶0.5的摩爾比混合DPPC∶膽固醇∶DSPE-PEG2000∶DSPE-PEG2000-Folate，所得到的脂質(zhì)體可以在荷載的磁性材料產(chǎn)生磁熱療時釋放其荷載的藥物，從而進一步增加對腫瘤細胞的殺傷力。

3.4 多功能化脂質(zhì)體

雖然以上所介紹的單一功能化脂質(zhì)體均表現(xiàn)出較好的傳遞效率，但是由于機體內(nèi)環(huán)境的變化是復(fù)雜多變的，單一功能化并不能完全應(yīng)對傳遞過程中的障礙。因而越來越多的研究者將不同功能化方法進行合理的疊加，使得脂質(zhì)體能夠更加智能地應(yīng)對復(fù)雜的機體環(huán)境，從而達成更佳的治療效果。

比如上文所介紹的PEG化導(dǎo)致入胞率降低或者溶酶體逃逸的問題，就可以聯(lián)合其他的環(huán)境敏感鍵來解決。Nie等[58]使用腙鍵將PEG和膽固醇類脂質(zhì)體連接合成出OPSS-PEG-HZN-Chol，這種脂質(zhì)體在低pH的內(nèi)含體/溶酶體中處發(fā)生腙鍵斷裂而去PEG化。根據(jù)實驗結(jié)果可知OPSS-PEG-HZN-Chol與PEI/DNA復(fù)合物組成的納米粒在pH 5.5時僅30 min就可以完成去PEG化，并利用暴露氨基的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”逃出溶酶體，其轉(zhuǎn)染效率高于非敏感納米粒40倍的。這種環(huán)境敏感型PEG化不僅延長了脂質(zhì)體的體內(nèi)循環(huán)時間，還避免了PEG化導(dǎo)致的入胞率降低或者溶酶體逃逸。而Xu等[59]和Chen等[60]也發(fā)現(xiàn)了設(shè)計為環(huán)境敏感型的PEG化脂質(zhì)體可以有效減弱重復(fù)注射導(dǎo)致的ABC現(xiàn)象，甚至不會誘導(dǎo)產(chǎn)生該現(xiàn)象。

除此之外，Zhang等[61]合成了兩種由不同功能的脂質(zhì)分子組成的仿病毒載體：DMA修飾氨基的電荷翻轉(zhuǎn)脂質(zhì)分子和生物素化的靶向脂質(zhì)分子(如圖6)。通過測試DMA修飾脂質(zhì)分子在不同pH環(huán)境下的粒徑、電位以及分子層面上的變化，證明了其確實具有pH響應(yīng)型電荷翻轉(zhuǎn)能力。兩者混合制備成的荷載阿霉素雙功能脂質(zhì)體(D-CTVMs)在生理環(huán)境下穩(wěn)定存在，且負電荷外圍避免了蛋白非特異性吸附。當環(huán)境pH降低后，D-CTVMs發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)，從而增加入胞量，加之利用生物素與細胞受體結(jié)合進一步增加了載體的腫瘤靶向、滯留以及內(nèi)化能力。D-CTVMs在小鼠乳腺癌4T1細胞中表現(xiàn)出優(yōu)于單一功能化脂質(zhì)體的入胞效率和細胞毒性，并在小鼠體內(nèi)抑瘤實驗中表現(xiàn)出更高的腫瘤靶向性和更強的抑瘤率。

圖6 脂肽組成的仿病毒納米粒的作用機理[61]Fig.6 Schematic illustrations for virus-mimicking nanostructures assembled from specially made dendritic lipopeptides[61]

在腫瘤化療過程中，多藥耐藥性(Multidrug Resistance，MDR)的存在會阻礙藥物產(chǎn)生治療效果。MDR按照產(chǎn)生機理可以分為獲得性MDR與固有性MDR，其中獲得性MDR主要是由于細胞過表達藥物外排泵，而固有性MDR則與線粒體相關(guān)。因而，Jiang等[62]將DMA修飾的促凋亡多肽D[KLAKLAK]2(KLA)與DSPE共價連接合成一種具有pH響應(yīng)和線粒體靶向雙功能的脂質(zhì)體DSPE-KLA-DMA。在腫瘤組織環(huán)境(pH 6.8)中，荷載紫杉醇(PTX)的DSPE-KLA-DMA不僅可以通過電荷翻轉(zhuǎn)大幅增加人肺癌細胞耐藥株(A549/Taxol)對PTX的攝入量，而且被激活的KLA多肽促進脂質(zhì)體選擇性聚集于線粒體并定向釋放PTX。在體內(nèi)試驗中，DSPE-KLA-DMA對耐藥腫瘤的抑瘤率可以達到86.7%之高。

以上的實驗結(jié)果都說明將多種功能賦予脂質(zhì)體后，確實有助于解決脂質(zhì)體在傳遞過程中所遇到的各種阻礙，表現(xiàn)出更好的生物醫(yī)學應(yīng)用潛力。

4 脂質(zhì)體的生物醫(yī)學應(yīng)用

4.1 脂質(zhì)體作為藥物載體

脂質(zhì)體一般在水中所形成的囊泡，其直徑一般在25 ～ 500 nm之間，膜壁厚度在5 nnm左右。而利用藥物的親/疏水性，或?qū)⒂H水性藥物包載入脂質(zhì)體內(nèi)部的水相，或?qū)⑹杷运幬锊迦胫|(zhì)分子構(gòu)成的雙分子層中。而且通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)分子親/疏水部分的比例，可以改變囊泡的形態(tài)，從而增加對不同藥物的荷載量[63]。脂質(zhì)體作為藥物載體，①增加疏水性藥物的溶解性；②增加藥物在體內(nèi)的穩(wěn)定性；③延長治療劑的釋放時間；④降低了正常組織對藥物的攝取，一定程度上減少了治療劑的副作用；⑤通過對脂質(zhì)體進行功能化修飾，從而增加患病部位對藥物敏感性、定點釋放藥物以及增加細胞對藥物的吞噬量[64]。

一般來說，因為水溶性小分子藥物本身的性質(zhì)，較少采用脂質(zhì)體包載。但對于疏水性小分子藥物來說，利用脂質(zhì)體的協(xié)助更有利于溶解、緩釋以及定位釋放。一般脂質(zhì)體所荷載的親脂性藥物分為抗感染藥物和抗腫瘤藥物兩大類，尤其抗腫瘤藥物脂質(zhì)體是近年來研究一大熱點。早在20世紀70年代開始，就已經(jīng)有關(guān)于制備荷載阿霉素(Doxorubicin，DOX)脂質(zhì)體的報道[65]。除此之外，紫杉醇、喜樹堿、多西他賽等抗腫瘤藥物均可作為脂質(zhì)體的內(nèi)容物。但是由于這些第一代脂質(zhì)體，或者說經(jīng)典脂質(zhì)體都有著體內(nèi)非特異性吸附、易被MPS系統(tǒng)清除等問題，現(xiàn)在研究的重點都放在多功能化的載藥脂質(zhì)體上。Shi等[66]就設(shè)計了一種多功能脂質(zhì)體荷載紫杉醇(PTX)治療黑素癌。他們將pH敏感型穿膜肽(TH)和RGD肽串聯(lián)后修飾于PEG-DSPA制備了能夠靶向過表達αVβ3黑色素瘤細胞(B16F10)并在腫瘤組織環(huán)境下啟動穿膜功能的脂質(zhì)體(TR-Lip)。TR-Lip在pH 6.5時的入胞效率分別是PEG-，RGD-和TH修飾脂質(zhì)體的41.67，30.67和11.90倍，充分說明了在TH和RGD協(xié)作下的脂質(zhì)體入胞效率遠高于單一多肽修飾的脂質(zhì)體，同時也將PTX對黑色素瘤細胞的殺傷力提高了近兩倍。對建立B16F10黑色素瘤模型的小鼠進行抑瘤實驗，結(jié)果顯示荷載PTX的TR-Lip的抑瘤率為85%且小鼠的生存率明顯高于其他實驗組。以上的體外及體內(nèi)實驗都說明TR-Lip這類多功能化的脂質(zhì)體都有潛力成為高效的藥物傳遞體系。

通過對脂質(zhì)體進行功能化修飾，可以在一定程度上解決傳遞過程中所遇到的生理障礙，但是提高藥物的包封率、減小體內(nèi)傳遞過程中的滲漏卻同樣是阻礙脂質(zhì)體實際應(yīng)用的關(guān)鍵問題。傳統(tǒng)上，人們多采用的是被動載藥法(Passive Loading)，即先將藥物和載體材料溶于有機相中， 然后按一定的方法制備載藥脂質(zhì)體。由于這種載藥方法受油水分配系數(shù)，介質(zhì)pH和離子強度等影響較大，因而對于弱酸弱堿類的兩親性藥物來說，所得脂質(zhì)體的載藥量較低。并且被動載藥法還有可能造成不同批次的載藥量不一致。因此，Nichols等[67]在前人跨膜濃度梯度測量細胞和細胞器△pH的啟發(fā)下，發(fā)明了pH梯度法以制備出了高載藥量的兒茶酚胺脂質(zhì)體。利用脂質(zhì)體內(nèi)外水相的離子或化合物梯度進行的主動載藥法(Active Loading)能提高脂質(zhì)體對兩親性藥物的包封率，減少藥物滲漏，同時克服了被動載藥早期突釋的不良因素。目前常用的主動載藥方法包括pH梯度(pH Gradient)法、 胺(銨)離子梯度(Ammonium ion Gradient)法、 醋酸鈣梯度(Calcium Acetate Gradient)法和細胞離子載體(Ionophore Drug Loading)法。但是以上的主動載藥法均需要改變制備介質(zhì)的pH值或者離子強度，反而限制了在某些功能化的脂質(zhì)體中的應(yīng)用，例如pH敏感型脂質(zhì)體等。因而，有些研究者將疏水性藥物作為脂質(zhì)體的尾部合成了一種新型脂質(zhì)體——藥質(zhì)體(Pharmacosomes，PS)。比起普通脂質(zhì)體，藥質(zhì)體可以大幅提高載藥量，防止藥物在傳遞過程中滲漏，無需除去游離藥物，生產(chǎn)制備方便，同時還可以利用這種脂質(zhì)前藥達到緩控釋藥物的目的。Ai和同事[68]合成了地達諾新的藥質(zhì)體，利用透射電鏡和原子力顯微鏡觀察其形態(tài)和粒徑，并通過大鼠體內(nèi)分布實驗證明該藥質(zhì)體可以進行肝靶向且在靶組織處的半衰期為10 d。

4.2 脂質(zhì)體作為生物大分子載體

隨著越來越多與疾病相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)，能夠從分子水平上修復(fù)、置換或者糾正異?；虻幕蛑委熞仓饾u被人給予厚望，但是鑒于病毒載體的高免疫原性和病毒復(fù)制不可控等風險，這就為非病毒載體的發(fā)展開辟了道路。據(jù)此，陽離子脂質(zhì)體作為極有潛力的非病毒基因載體而逐漸被人所重視。

4.2.1 脂質(zhì)體作為DNA載體

最初，基因治療的研究對象是DNA，而常用的基因載體就是傳統(tǒng)陽離子脂質(zhì)體。傳統(tǒng)的陽離子脂質(zhì)體是由脂肪酸或膽固醇類衍生而來，包括上文所述的DOTAP、DSPE、DOTMA等。除了這些供正電荷的脂質(zhì)外，作為轉(zhuǎn)染的陽離子脂質(zhì)體還會加入中性脂質(zhì)DOPE、 磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)、中性磷脂酰膽堿 PC 或膽固醇等輔助脂質(zhì)。輔助脂質(zhì)的加入可以幫助穩(wěn)定陽離子脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，對抗血清中蛋白質(zhì)對膜的破壞，一定程度上減小電荷比率而降低毒性。特別是DOPE的相變有利于基因在轉(zhuǎn)染過程中逃出溶酶體，增加轉(zhuǎn)染成功率。Lipofectamine 2000就是一種用于基因轉(zhuǎn)染的典型的商品化陽離子脂質(zhì)體。鑒于傳統(tǒng)脂質(zhì)體的細胞毒性、體內(nèi)易清除等問題，各種生物啟發(fā)型或者仿病毒脂質(zhì)體被設(shè)計出來。有研究表明含有大量精氨酸的穿膜肽是病毒表現(xiàn)出高轉(zhuǎn)染性的原因之一，而Xu等[12]就在此啟發(fā)下，設(shè)計了一種以富含精氨酸的樹狀大分子為頭部的新型脂質(zhì)組裝體(AVN)。載體所荷載的基因可以在精氨酸的保護下避開體內(nèi)DNA酶的降解，利用精氨酸的胍基與膜磷脂成氫鍵加強載體的穿膜能力完成溶酶體逃逸(如圖7所示)，最后酰胺鍵在細胞質(zhì)中降解并釋放DNA，完成整個轉(zhuǎn)染過程。這種DNA載體在體外細胞轉(zhuǎn)染實驗中表現(xiàn)出優(yōu)良的轉(zhuǎn)染效率以及良好的生物相容性。之后，Jiang等[13]使用相同的載體進行瘤內(nèi)注射，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)果依然高于對照陽離子基因載體。就像藥物載體的發(fā)展歷程一樣，單純陽離子載體在轉(zhuǎn)染過程中會受到各種生理屏障阻礙傳遞，因而為了模仿病毒的應(yīng)對方法，長循環(huán)脂質(zhì)體、環(huán)境敏感型脂質(zhì)體、生物靶向型脂質(zhì)體以及仿病毒式多功能化載體被設(shè)計出來，且均不同程度的優(yōu)化了脂質(zhì)體的基因轉(zhuǎn)染效率。

圖7 荷載熒光標記DNA的PEI與AVN的溶酶體逃逸實驗[12]Fig.7 CLSM images for intracellular delivery of the fluorescence-labelled DNA-packaged PEI and DNA-packaged AVNs in HepG2 cells for 5.0 h[12]

4.2.2 脂質(zhì)體作為RNA載體

DNA作為治療劑有著分子量大，不易荷載，必須入核進行轉(zhuǎn)錄等不利因素，RNA干擾(RNAi)治療法作為基因治療的另一種選擇逐漸為人所矚目[69]。RNAi是一種通過使用包括small interfering RNA (siRNA)，short hairpin RNA (shRNA)，mRNA以及micro RNA (miRNA)等雙鏈RNA對機體中序列特異的目的基因進行下調(diào)或者沉默，迅速阻斷基因活性從而治療疾病的方法。

siRNA通常由19 ～ 23個堿基對構(gòu)成，其3’端有兩個核苷酸組成懸臂[70]。與DNA不同的是，siRNA只需進入細胞質(zhì)后可以沉默疾病相關(guān)基因達到治療目的。即便如此，由于siRNA比DNA更易降解，直接應(yīng)用會引起免疫刺激且治療效果低，因此尋找一種高效低毒的siRNA載體就變得十分關(guān)鍵。第一篇報道利用陽離子脂質(zhì)體作為siRNA載體的文章在2003年才被發(fā)表，但對成年大鼠腹腔注射和靜脈注射這種荷載siRNA的DOTAP脂質(zhì)體后，切片結(jié)果顯示了siRNA能夠成功被傳遞入各種細胞，并介導(dǎo)了TNF-α和IL-6的生成[71]。自此以后，已經(jīng)有2萬多篇關(guān)于用于傳遞siRNA的陽離子脂質(zhì)體的報道，暗示了陽離子脂質(zhì)體已經(jīng)是siRNA傳遞中的一種重要載體。

miRNA是通常由18 ～ 25個核苷酸構(gòu)成，它能夠在體內(nèi)合成并加快mRNA的降解，從而阻礙轉(zhuǎn)錄的進行[69]。miRNA與siRNA最大的不同在于，某些miRNA能夠調(diào)控不止一種mRNA[72]。這使得miRNA比起siRNA更適合作為治療劑。Takahashi和同事[73]使用PEG修飾的氣泡脂質(zhì)體來荷載miR-126，這是一種能夠下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor ,VEGF)以促進血管生成的miRNA。為建立下肢缺血模型的ICR小鼠靜脈注射此脂質(zhì)體并在下肢處施加診斷用超聲波，由于脂質(zhì)體中含有氣體，當其循環(huán)至靶部位后在超聲的作用下破裂并釋放miR-126。運用此方法傳遞miR-126成功誘導(dǎo)了缺血下肢完成血管再生以及增加了血流量。

4.2.3 脂質(zhì)體作為蛋白質(zhì)載體

經(jīng)過20多年的研究，來源于蛋白質(zhì)或者多肽的生物活性成分也開始作為治療疾病的可選藥物，例如酶、肽類激素以及細胞因子等?；谂R床考慮，對于某些由體內(nèi)酶的功能異常導(dǎo)致的遺傳病和癌癥來說，利用脂質(zhì)體將酶傳遞到細胞質(zhì)或者溶酶體中是一種重要的治療方法[74]。將用脂質(zhì)體包載的天冬酰胺酶注射入患有天冬酰胺酶依賴型P1543腫瘤的小鼠體內(nèi)，最終此組小鼠的生存率比注射單純天冬酰胺酶的實驗組更高[75]。除了蛋白質(zhì)外，許多多肽也可以作為脂質(zhì)體的內(nèi)容物進行高效傳遞。Kazunori等[76]在荷載了胰島素的脂質(zhì)體外包裹PEG層，其在口服后可以利用聚合物與胃部或者腸道中粘液層的吸附而長時間停留于胃腸道，既增加了藥物與胃腸道的接觸時間，又通過脂質(zhì)體防止多肽被酶降解。

4.3 脂質(zhì)體在醫(yī)學診斷中的應(yīng)用

診斷用分子探針一般通過3種方式進行荷載與脂質(zhì)體：①通過“相似相溶”原理將分子探針荷載于脂質(zhì)體的水相或者有機相中；②通過“靜電吸附”原理將分子探針吸附在脂質(zhì)體表面；③將分子探針共價連接于脂質(zhì)體上[77]。利用經(jīng)典脂質(zhì)體本身性質(zhì)或者功能化脂質(zhì)體可以將分子探針高效定向地傳遞到肝、腎、脾、心血管、腫瘤以及炎癥部位，并保證蓄積濃度[78]。

核磁共振成像(MRI)是一種應(yīng)用廣泛且診斷精確的診斷成像方法。但對于某些疾病來說，單純分子探針的使用會被生理屏障所限制。比如血腦屏障的存在阻礙了分子探針進入腦部，使得腦膠質(zhì)瘤的診斷有所受限。Liu等[79]使用修飾了白介素13(IL-13)的脂質(zhì)體荷載Gd-DTPA制備出了IL-13-liposome-Gd-DTPA。如圖8所示，該脂質(zhì)體在體內(nèi)試驗中并未顯示出明顯的毒性，且通過IL-13與腦膠質(zhì)瘤細胞過表達的IL-13受體α2(IL-13Rα2)的結(jié)合，使得患病小鼠腦部MRI信號強度是正常小鼠腦組織的1.15倍，說明IL-13-liposome-Gd-DTPA可以穿過血腦屏障聚集于患病腦組織，并且比傳統(tǒng)增強型MRI更易發(fā)現(xiàn)初期階段的腦膠質(zhì)瘤。

近紅外成像技術(shù)不僅是可以用于診斷疾病，并且有很多研究將其作為一種外源性刺激來控制脂質(zhì)體的藥物釋放。Yuan等[80]合成了一種分子結(jié)構(gòu)類似DSPE-PEG的光熱分子探針PEG-IR780-C13 (PIC)，其能夠像DSPE-PEG一樣形成具有雙分子層的囊泡并包載DOX(DOX@PIC-Lipo)。這種光敏感的載藥脂質(zhì)體在近紅外光的照射下會產(chǎn)生高熱并釋放所荷載的DOX，這將有利于協(xié)同治療腫瘤以及達到診療一體化的目的。

4.4 脂質(zhì)體作為疫苗載體

鑒于抗原或者疫苗佐劑可以通過吸附或者共價連接在脂質(zhì)體，所以脂質(zhì)體逐漸成為一種重要的疫苗載體。一般來說，通過肌肉注射或者皮下注射進入人體的脂質(zhì)體中所包載的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的基本過程如下：首先利用脂質(zhì)體的功能滲透組織并到達淋巴系統(tǒng)，接著脂質(zhì)體保持了抗原構(gòu)像的完整性的同時，也緩慢釋放抗原，釋放出來的抗原與B細胞受體結(jié)合，從而激活了機體的免疫反應(yīng)(如圖9 所示)。除了以上過程外，還有可能通過交叉遞呈，使得抗原被主要組織相容性I型復(fù)合體遞呈給CD8+T細胞(如圖9 所示)[81]?？勺鳛榭乖姆肿佣喾N多樣，包括多肽、蛋白質(zhì)、DNA、RNA以及糖蛋白。Yanasarn和同事[82]利用卵清蛋白(OVA)、陽離子化的卵清蛋白(cOVA)以及炭疽菌抗原測試了中性、正電性以及負電性三種脂質(zhì)體的佐劑活性，實驗結(jié)果顯示OVA與不同脂質(zhì)體混合產(chǎn)生不同的抗體反應(yīng)，而OVA與負電性脂質(zhì)體混合產(chǎn)生的免疫性與OVA/正電性脂質(zhì)體混合物相似。綜合考慮發(fā)現(xiàn)負電性脂質(zhì)體的佐劑活性較好，且僅需與抗原簡單混合就直接應(yīng)用。

圖8 注射IL-13-liposome-Gd-DTPA與Gd-DTPA后，小鼠腦部的T1信號強度(a)與腦部切片照片(b)[79]Fig.8 The plots of an average signal intensity time-course measured in T1-weighted images post injections of IL-13-Lip-Gd-DTPA (a-a1) or Magnevist (a-a3) into the brain parenchyma and pituitary gland. Confocal microscopy images of brain slides (b)[79]

免疫佐劑是某種能夠增強疫苗免疫反應(yīng)的成分，通常在與抗原一起注射或者預(yù)先注射后，有效延長抗原的釋放時間，增加抗原與抗原呈遞細胞的接觸機會。免疫佐劑被分為免疫刺激劑和傳遞系統(tǒng)兩大類，而脂質(zhì)體本身就是一種免疫刺激。而某些陽離子脂質(zhì)體不僅可以作為傳遞系統(tǒng)，同時還可以加強抗原的免疫反應(yīng)。CAF01就是這樣一種特殊的免疫佐劑，它是由人工合成的結(jié)核分枝桿菌索狀因子糖脂TDB和陽離子膜脂質(zhì)DDA組成。其中，TDB能夠通過與C型凝集素Mincle結(jié)合來激活抗原呈遞細胞，從而產(chǎn)生強烈的MyD88依賴型TH1和TH17免疫反應(yīng)[83, 84]。

4.5 脂質(zhì)體作為共載體系

基于治療劑所具有的不同化學特性，通過混合、吸附以及共價連接等手段就可以將藥物、基因、分子探針或者蛋白質(zhì)等荷載于脂質(zhì)體的不同部位。這一特性使得脂質(zhì)體十分易于制備成共載體系，通過不同治療劑的協(xié)同作用獲得更佳的治療作用或者達到“診療一體化”。通常脂質(zhì)體共載體系可以分為兩種：一種是將不同的治療劑荷載于不同的脂質(zhì)體中順序或者混合使用；另一種是將不同的治療劑荷載于同一脂質(zhì)體中直接使用。鑒于不同脂質(zhì)體在體內(nèi)的最佳給藥途徑、作用時間以及毒性都有所差異而不利于控制其治療效果，更多的研究者將注意力集中在設(shè)計能夠同時荷載不同治療劑的脂質(zhì)體共載體系[70]。

為了克服由過表達藥物外排泵(例如P糖蛋白，P-gp)導(dǎo)致的獲得性MDR，Torchilin課題組[85]在由EPC，CHOL，DOTAP和PEG2kPE組成的長循環(huán)脂質(zhì)體中同時裝載了PTX和P-gp抑制劑(Tariquidar)。對用單純Tariquidar和脂質(zhì)體裝載的Tariquidar處理卵巢癌細胞耐藥株SKOV-3TR后，后者可以有效提高細胞內(nèi)染料的濃度，說明Tariquidar被脂質(zhì)體傳遞入細胞內(nèi)更有利于最大程度地抑制P-gp作用。利用脂質(zhì)體將PTX和Tariquidar共同傳遞到SKOV-3TR后，Tariquidar對腫瘤細胞P-gp的抑制增加了細胞內(nèi)PTX的濃度，最終使得PTX對SKOV-3TR的半數(shù)致死量(IC50)從2743 nM(游離PTX)降至27.11 nM。

圖9 納米粒介導(dǎo)免疫效應(yīng)的機理示意圖[81]Fig.9 Mechanisms by which nanoparticles alter the induction of immune responses[81]

腫瘤治療基因一般是在遺傳物質(zhì)層面上通過阻礙血管生成、抑制腫瘤生長、防止腫瘤細胞轉(zhuǎn)移等方法治療癌癥。雖然基因治療從根源上針對腫瘤，基本上不產(chǎn)生多藥耐藥性等問題，但是起效慢、轉(zhuǎn)染效率低等問題嚴重限制了基因治療的應(yīng)用。使用基因-藥物共載體系可以利用兩者不同的治療機理相互彌補缺陷，達到協(xié)同治療的目的[86]。為了達到基因和藥物共載以及智能傳遞釋放之目的，常用功能化的陽離子脂質(zhì)體作為共載體系。舉例來說，Sun和同事[87]設(shè)計了一種修飾了多肽angiopep-2的陽離子脂質(zhì)體能夠同時荷載編碼人類腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體基因pEGFP-hTRAIL和PTX(CLP/PTX/pEGFP-hTRAIL)用于腦膠質(zhì)瘤的治療。利用腦膠質(zhì)瘤細胞U87 MG與正常的牛肉瘤上皮細胞BCEC共培養(yǎng)模型考察不同樣品的誘導(dǎo)凋亡能力，實驗結(jié)果顯示CLP/PTX/pEGFP-hTRAIL不僅能夠區(qū)分U87 MG和BCEC，并且能夠穿過單層BCEC模仿的血腦屏障后誘導(dǎo)81.99 ± 3.28%的U87 MG發(fā)生凋亡(如圖10所示)。共載脂質(zhì)體比單載pEGFP-hTRAIL或者PTX的脂質(zhì)體造成的細胞凋亡率分別高出2.8倍或者1.98倍?？墒牵醒芯勘砻鞴草d體系釋放不同治療劑的順序和時機是影響治療效果的一大因素，例如化療藥物的提前釋放對細胞造成殺傷會嚴重阻礙基因的轉(zhuǎn)染[88]。但是目前對于如何解決該問題的研究還十分有限。

圖10 在體外血腦屏障模型中，不同樣品對U87 MG細胞造成的凋亡率[87]Fig.10 Advanced apoptosis (%) of different nanoparticles against U87 MG cells in in vitro BBB models[87]

除了上述的藥物共載脂質(zhì)體、基因-藥物共載脂質(zhì)體外，還有將分子探針和藥物共載以達到“診療一體化”的目的。Tagami等[89]就將MRI分子探針Gd-DTPA和化療藥物DOX共同包載于熱敏脂質(zhì)體中，以便在治療過程中獲得示蹤藥物分布、監(jiān)控治療之效果。

5 脂質(zhì)體的臨床醫(yī)用現(xiàn)狀

脂質(zhì)體作為藥物載體系統(tǒng)的優(yōu)異之處在種種研究中均體現(xiàn)，但從1995年第一個被美國食品藥物管理局(FDA)批準的脂質(zhì)體制劑Doxil?(Ben Venue Laboratories, Inc Bedford, OH)開始[90]，目前只有13種脂質(zhì)體類藥物被批準上市，更多的依然處于不同的臨床研究階段(見表1)。這些上市的脂質(zhì)體制劑在臨床治療中已占據(jù)了舉足輕重的地位，尤其AmBisome?和Doxil?每年有著數(shù)億的銷售額。雖然脂質(zhì)體可以通過不同的給藥途徑進入人體，但在臨床應(yīng)用中一般都是通過靜脈注射給藥。除此之外，荷載甲肝抗原的Epaxal?(Berna Biotech Ltd, Berne Switzerland)和荷載流感病毒抗原的Inflexal?V (Berna Biotech Espaa SA, Madrid, Spain) 脂質(zhì)體疫苗是通過肌肉注射給藥[91, 92]，以及荷載治療年齡相關(guān)性黃斑變性的維替泊芬的Visudyne?則是通過眼部給藥[93]。雖然研究口服給藥的脂質(zhì)體制劑的報道很多，但脂質(zhì)體易被膽汁崩解的問題一直沒有得到解決[94]。最新上市的脂質(zhì)體制劑是在2015年10月22日批準的Onivyde?，這是一種荷載伊立替康以治療胰腺癌的長循環(huán)脂質(zhì)體制劑[95]。

表1 已上市的脂質(zhì)體以及脂質(zhì)產(chǎn)品Table 1 Marketed liposomal and lipid-based products

6 結(jié) 語

經(jīng)過50年的研究，脂質(zhì)體已經(jīng)從一個概念發(fā)展到現(xiàn)在公認的主流載體系統(tǒng)。脂質(zhì)體從最初的經(jīng)典構(gòu)成開始，先后發(fā)展出長循環(huán)脂質(zhì)體、環(huán)境敏感脂質(zhì)體以及主動靶向脂質(zhì)體等，并由研究者進行有機的組合獲得了更適應(yīng)臨床應(yīng)用潛力的多功能化脂質(zhì)體。雖然脂質(zhì)體的設(shè)計和應(yīng)用潛力逐漸走向成熟，但是不能忽視脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)的某些短板：①PEG化脂質(zhì)體重復(fù)給藥后出現(xiàn)的ABC現(xiàn)象；②脂質(zhì)體的基因傳遞效率仍遠低于病毒載體；③如何將脂質(zhì)體設(shè)計成靶向效率更高、治療劑緩控釋更加智能的載體系統(tǒng)；④如何利用功能化修飾達到順序釋放治療劑的目的。堅信隨著科研技術(shù)的日漸進步，以上短板對脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)的影響會不斷趨于減弱，甚至消除，而更高效的脂質(zhì)體將越來越廣泛地應(yīng)用于臨床，在多種疾病的治療中發(fā)揮重要作用領(lǐng)域。

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JIANG Qian1，YUE Dong1，GU Zhongwei1,2

(1.National Engineering Research Center for Biomaterials, Sichuan University, Chengdu 610064, China)(2.College of Materials Science and Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China)

Since the pioneering observation of Alec Bangham that phospholipids in aqueous systems can form closed bilayered structures in 1965, liposomes have moved a long way from being just another exotic object of biophysical research to becoming a pharmaceutical carrier of choice for numerous practical applications. The speciality of liposome is beneficial as delivery systems, such as nanoscale, mimetic biomembrane structure, better biocompatibility and facile modification at surface. In light of amphipathicity, water-soluble drug and water-insoluble drug can be loaded into aqueous liposome interior and the liposomal membrane, respectively. Furthermore, liposome also can be used as gene delivery system because of its cationic surface charge. And molecular probes loaded liposome can be used for diagnosis. In addition, liposome can load with two or three therapeutic agents for synergistic treatment and/or molecular probes for theranostics. In this paper，the structural design, therapeutic agent and clinical application of liposomal delivery system were summarized and commented．

liposome; drug delivery; biomacromolecule delivery; molecular probe; co-delivery

2017-02-11

國家自然科學基金(51133004,81361140343)

姜 倩，女，1990年生，博士研究生

顧忠偉，男，1949年生，教授，博士生導(dǎo)師，Email:

zwgu1006@hotmail.com

10.7502/j.issn.1674-3962.2017.11.02

R944.9

A

1674-3962(2017)11-0813-14

(編輯 吳 琛)