寧泌泰膠囊對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

劉桂杰，倪騰鳳

寧泌泰膠囊對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用

劉桂杰1，倪騰鳳2

目的：檢測(cè)寧泌泰膠囊對(duì)表皮葡萄球菌體外培養(yǎng)生物膜的抑制作用，探討其抗菌機(jī)制。方法：體外培養(yǎng)表皮葡萄球菌產(chǎn)膜菌株，使用半定量粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫染色法及剛果紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，評(píng)估寧泌泰膠囊對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的抑制作用。寧泌泰膠囊處理后，檢測(cè)表皮葡萄球菌對(duì)氧化脅迫耐受及抗生素敏感性（最小抑菌濃度）的變化，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)氧化應(yīng)激響應(yīng)基因serp2195和gpxA-2轉(zhuǎn)錄水平變化。結(jié)果：結(jié)晶紫染色法顯示，寧泌泰膠囊能夠顯著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成（P＜ 0.001），剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致。在寧泌泰膠囊20 mg/mL濃度條件下，表皮葡萄球菌對(duì)氧化脅迫耐受性減弱了8倍，對(duì)氯霉素及紅霉素敏感性均增強(qiáng)了4倍；實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，與陰性對(duì)照組相比氧化應(yīng)激響應(yīng)基因serp2195和gpxA-2轉(zhuǎn)錄水平分別降低至22.9%和24.5%。結(jié)論：寧泌泰膠囊對(duì)表皮葡萄球菌生物膜具有顯著抑制作用，減弱細(xì)菌對(duì)氧化脅迫耐受性，其機(jī)制可能通過下調(diào)表皮葡萄球菌氧化應(yīng)激響應(yīng)基因serp2195和gpxA-2表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)；同時(shí)寧泌泰膠囊可以減弱表皮葡萄球菌對(duì)抗生素耐藥性。

寧泌泰膠囊；表皮葡萄球菌；生物膜；氧化脅迫；細(xì)菌耐藥性

慢性細(xì)菌性前列腺炎致病因素主要為病原體感染，以逆行感染為主，病原體主要為葡萄球菌屬，其次為大腸埃希菌、棒狀桿菌屬及腸球菌屬等[1]。生物膜是病原體持續(xù)存在和感染復(fù)發(fā)的重要原因[2]，細(xì)菌具有高度耐藥性的同時(shí)還能逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，危害性嚴(yán)重[3]。表皮葡萄球菌具有顯著形成生物膜的能力，是前列腺炎重要致病菌之一[4]。寧泌泰膠囊廣泛應(yīng)用于治療下尿路感染、慢性前列腺炎，具有明確的抗菌作用[5-6]。本研究通過對(duì)體外表皮葡萄球菌生物膜測(cè)定，觀察寧泌泰膠囊對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的作用，檢測(cè)表皮葡萄球菌對(duì)氧化脅迫耐受及抗生素敏感性的變化，為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基 產(chǎn)膜菌株表皮葡萄球菌SE1457，培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯TSB（英國OXOID 公司）。

1.2 試劑 結(jié)晶紫購于生工生物工程(上海)股份有限公司，過氧化氫液購于Sigma公司，氯霉素和紅霉素購于大連美侖生物技術(shù)有限公司，寧泌泰膠囊購于貴陽新天藥業(yè)股份有限公司?？俁NA提取試劑盒購于德國Qiagen公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒購于日本Takara公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于日本東洋紡績(jī)株式會(huì)社。

1.3 結(jié)晶紫染色法檢測(cè)生物膜形成 根據(jù)Chrietensen等方法略作改動(dòng)[7]。表皮葡萄球菌使用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，按1:1000比例稀釋（實(shí)驗(yàn)組將寧泌泰膠囊用無菌TSB培養(yǎng)基配制成系列濃度稀釋液，即20 mg/mL、10 mg/mL、5.0 mg/mL 3組，無菌濾膜過濾除去未溶解成份；陰性對(duì)照組加入同等體積的生理鹽水），滴加至無菌的96 孔板中（200 μL/孔），5個(gè)復(fù)孔，37 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)24 h。用移液槍小心棄除培養(yǎng)液，無菌的磷酸鹽緩沖液PBS（200 μL/孔）洗去未粘附菌，重復(fù)洗滌3次。干燥，加入99%甲醇（200 μL/孔），固定15 min 。棄去液體，室溫干燥。加入2%結(jié)晶紫（200 μL/孔），孵育20 min。去離子水輕輕沖洗干凈未結(jié)合的結(jié)晶紫，在酶標(biāo)儀上以570 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸收值A(chǔ)。

1.4 剛果紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)生物膜形成 根據(jù)Arciola[8]等方法配制剛果紅培養(yǎng)基（剛果紅0.8 g/L，腦心浸液干粉37 g/L，蔗糖36 g/L，瓊脂粉20 g/L），實(shí)驗(yàn)組使用過濾后的寧泌泰膠囊水溶液（濃度梯度設(shè)置為20 mg/mL、10 mg/mL、5.0 mg/mL）溶解上述成分；陰性對(duì)照組使用去離子水溶解。表皮葡萄球菌使用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，剛果紅平板劃線培養(yǎng)，37 ℃恒溫箱靜置24 h，菌落形成后室溫培養(yǎng)24～72 h。觀察記錄細(xì)菌菌落顏色，生物膜陽性細(xì)菌菌落為黑色，生物膜陰性細(xì)菌菌落為紅色[8]。

1.5 表皮葡萄球菌對(duì)過氧化氫及抗生素敏感性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)組為無菌TSB培養(yǎng)基溶解寧泌泰膠囊配制成的系列濃度稀釋液，陰性對(duì)照組加入同等體積的生理鹽水。各培養(yǎng)基中加入過氧化氫或抗生素，以倍比稀釋法稀釋，滴加至96 孔板中（50 μL/孔）。表皮葡萄球菌使用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，分別以實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M培養(yǎng)基按1:1000比例接稀釋，滴加至96 孔板中（50 μL/孔），37 ℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)24 h。觀察記錄細(xì)菌存活情況。1.6 表皮葡萄球菌基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) 表皮葡萄球菌使用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期后，按1:1000比例稀釋，接種至含寧泌泰膠囊（濃度梯度設(shè)置20 mg/mL、10 mg/mL、5.0 mg/mL 3組）的TSB培養(yǎng)基中，陰性對(duì)照組為不加入寧泌泰膠囊的TSB培養(yǎng)基。37 ℃ 培養(yǎng)6 h，采用總RNA提取試劑盒提取總RNA。cDNA合成按照逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒方法操作。使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)寧泌泰膠囊處理前后相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒操作，內(nèi)參基因采用gyrB（引物 5引物B因采用BIRD SYBR qRTPCR Kit 5'-CACCGTGAAGACCGCCAGATA-3'）；目的基因檢測(cè)serp2195（引物5'-CCATTTGTCTTCCG AATGGT-3'/5'-GCCCATATCCTTGGATTGAA-3）及gpxA-2（引物5'-TTTGCGAACCAAATAATCC TG-3'/ 5'-TGAGCTTCCCTTGCAATGAT-33）表達(dá)變化[9]。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)表皮葡萄球菌生物膜的作用 與陰性對(duì)照組相比，寧泌泰膠囊對(duì)表皮葡萄球菌體外培養(yǎng)生物膜具有抑制作用，且呈現(xiàn)出濃度梯度依賴性。寧泌泰膠囊在5.0 mg/mL濃度條件下能夠顯著抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成（P＜ 0.001），而濃度的升高進(jìn)一步增強(qiáng)了這種抑制作用。圖1為結(jié)晶紫染色檢測(cè)表皮葡萄球菌胞外粘附基質(zhì)的半定量粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖2為剛果紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表皮葡萄球菌胞外粘質(zhì)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果。陰性對(duì)照組表皮葡萄球菌生物膜形成能力顯著，細(xì)菌菌落為明顯的黑色。寧泌泰膠囊5.0 mg/mL濃度條件下，部分表皮葡萄球菌菌落呈現(xiàn)黑色及生物膜陽性（黃色箭頭所示），部分菌落顏色則呈現(xiàn)紅色生物膜陰性（綠色箭頭所示），表明細(xì)菌生物膜形成受到部分抑制。而寧泌泰膠囊等于及高于10.0 mg/mL濃度條件下，菌落顏色幾乎全部為紅色，顯示表皮葡萄球菌生物膜形成受到明顯抑制。

圖1 結(jié)晶紫染色檢測(cè)細(xì)菌胞外粘附基質(zhì)

圖2 剛果紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表皮葡萄球菌生物膜

2.2 減弱表皮葡萄球菌對(duì)過氧化氫的耐受 如表1所示，減號(hào)代表細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，加號(hào)代表細(xì)菌生長(zhǎng)未受到抑制。陰性對(duì)照組在沒有加入寧泌泰膠囊時(shí)（0 mg/mL），表皮葡萄球菌對(duì)過氧化氫液耐受程度為 4.4～8.8 μ M。加入寧泌泰膠囊后，表皮葡萄球菌對(duì)過氧化氫液耐受降低。在寧泌泰膠囊20 mg/mL濃度條件下，表皮葡萄球菌對(duì)過氧化氫液耐受降低為0.55～1.1 μM，對(duì)氧化脅迫耐受性減弱了8倍。

表1 表皮葡萄球菌對(duì)過氧化氫的耐受性

寧泌泰膠囊濃度在10 mg/mL時(shí)，serp2195和gpxA-2轉(zhuǎn)錄水平分別降低為57.9%和64.0%；寧泌泰膠囊濃度在20 mg/mL時(shí)，serp2195和gpxA-2轉(zhuǎn)錄水平分別降低為22.9%和24.5%。這表明寧泌泰膠囊通過下調(diào)氧化應(yīng)激響應(yīng)基因的表達(dá)，增強(qiáng)了表皮葡萄球菌對(duì)氧化脅迫的敏感性。見圖3。

圖 3 氧化應(yīng)激響應(yīng)基因serp2195和gpxA-2轉(zhuǎn)錄水平

2.3 增強(qiáng)表皮葡萄球菌對(duì)抗生素的敏感性 陰性對(duì)照組在沒有加入寧泌泰膠囊時(shí)（0 mg/mL），氯霉素和紅霉素對(duì)表皮葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為20 μ g/mL和1.25 μ g/mL。加入寧泌泰膠囊后，表皮葡萄球菌對(duì)抗生素敏感性增強(qiáng)。在寧泌泰膠囊20 mg/mL濃度條件下，表皮葡萄球菌對(duì)氯霉素和紅霉素最小抑菌濃度分別為5.0 μ g/mL和0.32 μ g/mL，即對(duì)兩種抗生素敏感性均增強(qiáng)了4倍。見表2。

表2 抗生素對(duì)表皮葡萄球菌最小抑菌濃度

3 討論

細(xì)菌生物膜是指細(xì)菌粘附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物，猶如一個(gè)“菌巢”[10]。在細(xì)菌性前列腺炎中，細(xì)菌的生物膜在下尿路感染的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[11-12]。Bartoletti研究報(bào)道，慢性細(xì)菌性前列腺炎病人常見病原體為產(chǎn)膜細(xì)菌，顯著減弱了臨床抗生素治療的效果[12]。Kanamaru則證實(shí)，細(xì)菌性前列腺炎和細(xì)菌生物膜之間存在明確聯(lián)系[13]。Mazzoli評(píng)估了從NIH-II型前列腺炎病人身上分離得到的150種細(xì)菌菌株產(chǎn)膜能力[14]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的大腸桿菌（93%）、革蘭氏陰性菌雜集（90%）、葡萄球菌屬（80%）、腸糞球菌（72%）為中高度產(chǎn)膜菌株。因而針對(duì)細(xì)菌生物膜的治療，日益引起前列腺炎和下尿路感染臨床用藥的重視。

寧泌泰膠囊為經(jīng)典苗藥，組方選擇四季紅、大風(fēng)藤、連翹、三棵針、仙鶴草、木芙蓉葉、白茅根，運(yùn)用現(xiàn)代制藥技術(shù)精制而成的純天然中藥制劑，多種單體化合物成分已被證實(shí)具備抑制生物膜的作用。沒食子酸對(duì)大腸桿菌和變異鏈球菌生物膜形成具有抑制作用[15]，槲皮素能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌生物膜形成[16]。木犀草素能夠減弱尿道致病性大腸桿菌粘附和侵襲，抑制其生物膜形成[17]。連翹中連翹苷對(duì)表皮葡萄球菌生物膜形態(tài)有顯著影響，顯微鏡下觀察，連翹苷可使部分表皮葡萄球菌被膜的形態(tài)發(fā)生改變[18]。小檗堿通過酚可溶性調(diào)控蛋白抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜形成，并增強(qiáng)了細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性[19]。兒茶素則能夠抑制變異鏈球菌生物膜形成[20]。綜上所述，寧泌泰膠囊具備抑制細(xì)菌生物膜的潛能。

本實(shí)驗(yàn)分別通過半定量粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫染色法和剛果紅實(shí)驗(yàn)證實(shí)，寧泌泰膠囊能夠抑制表皮葡萄球菌體外培養(yǎng)的生物膜，具有濃度梯度依賴性。表皮葡萄球菌生物膜受到抑制后，必將更容易受到宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。宿主消滅細(xì)菌的重要途徑為對(duì)病原體產(chǎn)生氧化脅迫，過氧化氫是其中的一種主要形式。本文使用過氧化氫液模擬氧化脅迫，證實(shí)表皮葡萄球菌生物膜在受到寧泌泰膠囊抑制后，對(duì)過氧化氫液耐受明顯下降。表皮葡萄球菌中基因serp2195編碼二氫硫辛酰胺脫氫酶，基因gpxA-2編碼谷胱甘肽過氧化物酶，這兩個(gè)蛋白酶能夠還原過氧化物消除氧化壓力，在受到氧化脅迫時(shí)基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高[9]。寧泌泰膠囊減弱表皮葡萄球菌對(duì)氧化脅迫的耐受，其機(jī)制可能通過下調(diào)氧化應(yīng)激響應(yīng)基因serp2195和gpxA-2表達(dá)水平實(shí)現(xiàn)。這兩個(gè)基因已被證實(shí)受生物膜形成相關(guān)基因abfr調(diào)控[9]，而寧泌泰膠囊抑制生物膜形成，是否通過影響abfr功能進(jìn)而調(diào)控serp2195和gpxA-2表達(dá)尚需進(jìn)一步深入研究。與此相對(duì)應(yīng)，表皮葡萄球菌對(duì)相關(guān)抗生素敏感性增強(qiáng)。臨床上也有大量的研究證實(shí)，寧泌泰膠囊聯(lián)用抗生素在尿路感染及前列腺炎等疾病治療中，效果優(yōu)于單用抗生素[21]。對(duì)細(xì)菌生物膜的抑制，為寧泌泰膠囊臨床應(yīng)用提供了重要的科學(xué)依據(jù)，但細(xì)菌生物膜受到抑制的具體環(huán)節(jié)和途徑尚需進(jìn)一步深入研究。

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統(tǒng)計(jì)學(xué)方法記述要求

統(tǒng)計(jì)學(xué)符號(hào)一律按GB 3358-1982《統(tǒng)計(jì)學(xué)名詞及符號(hào)》的有關(guān)規(guī)定，采用斜體排印。常用的符號(hào)有：(1)樣本的算術(shù)平均數(shù)x(中位數(shù)仍用M)，(2)標(biāo)準(zhǔn)差用s，(3)標(biāo)準(zhǔn)誤用sx，(4)t檢驗(yàn)用t，(5)F檢驗(yàn)用F，(6)卡方檢驗(yàn)用希文小寫χ2，(7)相關(guān)系數(shù)用r，(8)自由度用希文小寫υ，(9)概率用P。對(duì)于定量資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)計(jì)類型、資料特點(diǎn)和分析目的，選用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，不應(yīng)盲目套用t檢驗(yàn)和單因素方差分析；對(duì)于定性資料，應(yīng)根據(jù)所采用的設(shè)計(jì)類型、定性變量的性質(zhì)和頻數(shù)所具備的條件及分析目的，選用合適的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，不應(yīng)盲目套用χ2檢驗(yàn)。對(duì)于回歸分析，應(yīng)結(jié)合專業(yè)知識(shí)和散布圖，選用合適的回歸類型，不應(yīng)盲目套用簡(jiǎn)單直線回歸分析；對(duì)具有重復(fù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)檢驗(yàn)回歸分析資料，不應(yīng)簡(jiǎn)單化處理；對(duì)于多因素、多指標(biāo)資料，要在一元分析的基礎(chǔ)上，盡可能運(yùn)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，以便對(duì)因素之間的交互作用和多指標(biāo)之間的內(nèi)在聯(lián)系做出全面、合理的解釋和評(píng)價(jià)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的記述不能籠統(tǒng)記錄為SPSS或SAS軟件，而應(yīng)寫明所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的具體名稱，如：成組設(shè)計(jì)資料均數(shù)比較的t檢驗(yàn)、兩因素析因設(shè)計(jì)資料的方差分析、多個(gè)均數(shù)之間兩兩比較的q檢驗(yàn)等，必要時(shí)給出統(tǒng)計(jì)量的具體值（如：t=4.35，χ2=5.33，F(xiàn)=12.09等）；在用不等式表示P值時(shí)，一般情況下選用P＞0.05、P＜0.05和P＜0.01 3種表達(dá)方式，無須再細(xì)分。當(dāng)涉及到總體參數(shù)（如總體均數(shù)、總體率等）時(shí)，在給出顯著性檢驗(yàn)結(jié)果的同時(shí)，再給出95%可信區(qū)間。

Inhibition of Ningmitai Capsule on Biofilm Formation of Staphylococcus Epidermidis

LIU Gui-jie, NI Teng-feng Shanghai Haitian Medical Technology and Development Limited Company, Shanghai (200023),China

ObjectiveTo observe the effect of Ningmitai capsule on biofilm formation of Staphylococcus epidermidis, and to explore the possible anti-microbial mechanism of Ningmitai capsule.MethodsBiofilm of Staphylococcus epidermidis was prepared in vitro. The effect of Ningmitai capsule on the biofilm-forming ability of Staphylococcus epidermidis was evaluated via 96-well cell culture microtiter plates with crystal violet staining as well as Congo red experiment. Then the change of tolerance to oxidative stress and sensibility to antibiotics for Staphylococcus epidermidis being treated by Ningmitai capsule was measured. qRT-PCR analysis was performed to show the relative transcript level ofserp2195andgpxA-2upon Sepidermidis strain exposed to Ningmitai capsule at different concentrations.ResultsNingmitai capsule significantly prevented biofilm formation in Staphylococcus epidermidis (P＜ 0.001) during crystal violet staining and Congo red experiment. Under the concentration of 20 mg/ml, Ningmitai capsule weakened the tolerance of Staphylococcus epidermidis towards oxidative stress for 8 fold. Similarly, Ningmitai capsule enhanced the sensibility of Staphylococcus epidermidis towards both chloramphenicol and erythromycin for 4 fold. Further study showed that Ningmitai capsule could downregulate the transcript level ofserp2195andgpxA-2to 22.9% and 24.5%, compared to the negative control respectively.ConclusionDue to the inhibition on biofilm formation, Ningmitai capsule can reduce bacterial drug resistance and work in synergy with other antibiotics in urinary tract infections and chronic prostatitis caused by biofilm-producing bacteria.

Ningmitai capsule; staphylococcus epidermidis; biofilm; oxidative stress; bacterial drugresistance

R285.5

A

1007-6948（2017）06-0638-05

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.06.015

1.上海海天醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司（上海 200023）

2.中國科學(xué)院上海藥物研究所新藥研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 201203）

倪騰鳳，E-mail：nitengfeng@163.com

（收稿：2017-08-16 修回：2017-11-10）

張亞強(qiáng) 劉洪斌）