JNK抑制劑SP600125對(duì)金魚(yú)胚胎發(fā)育及JNK1表達(dá)的影響

鄒立軍， 龔 婧， 黃 文， 莊遠(yuǎn)紅， 廖海艷， 吉 璐

(湖南第一師范學(xué)院 基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410205)

JNK抑制劑SP600125對(duì)金魚(yú)胚胎發(fā)育及JNK1表達(dá)的影響

鄒立軍， 龔 婧， 黃 文， 莊遠(yuǎn)紅， 廖海艷， 吉 璐

(湖南第一師范學(xué)院 基礎(chǔ)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室， 長(zhǎng)沙 410205)

為探明JNK信號(hào)通路在魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用，通過(guò)使用JNK信號(hào)特異性抑制劑SP600125對(duì)金魚(yú)胚胎進(jìn)行浸泡處理，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)JNK1 mRNA和蛋白在胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)。結(jié)果顯示：從受精卵發(fā)育至原腸胚期后，SP600125能夠顯著阻滯胚胎的發(fā)育時(shí)間，同時(shí)伴隨大腦、眼睛、心臟和體節(jié)等組織器官的發(fā)育遲緩并出現(xiàn)畸形。qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示JNK1在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中的表達(dá)模式?jīng)]有明顯變化，均表現(xiàn)為“升高-降低-升高-降低”的趨勢(shì)。Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示JNK1蛋白的表達(dá)在對(duì)照組中的表達(dá)模式與mRNA的表達(dá)水平吻合，而實(shí)驗(yàn)組中，胚胎發(fā)育至原腸胚后JNK1蛋白持續(xù)保持較低水平的增加。研究表明，JNK信號(hào)通路在魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育和組織器官發(fā)生及發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

JNK1；SP600125；胚胎發(fā)育；金魚(yú)；器官發(fā)生

SP600125 又稱(chēng)為Anthrapyrazolone(吡唑蒽酮)或1,9-Pyrazoloanthrone(1,9-吡唑并蒽酮)，是一種廣泛使用的JNK高選擇性小分子抑制劑；其作用機(jī)制為與ATP 相互競(jìng)爭(zhēng)來(lái)獲取 JNK 上相關(guān)結(jié)合位點(diǎn)而抑制 JNK活性[12]。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)分子克隆技術(shù)獲得了JNK1全長(zhǎng)并發(fā)現(xiàn)其在金魚(yú)的性腺發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)存在顯著差異[13]，因此推測(cè)JNK1可能在金魚(yú)組織器官的形成和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究利用SP600125浸泡處理金魚(yú)受精卵，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)了JNK1 mRNA和蛋白在胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式，為初步探討JNK信號(hào)通路對(duì)魚(yú)類(lèi)胚胎發(fā)育以及器官形成的影響提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料采集

取本實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖金魚(yú)，在繁殖季節(jié)采用人工授精的方法使魚(yú)卵在水中受精。在受精卵發(fā)育過(guò)程中，根據(jù)顯微鏡下觀察到的發(fā)育特征，分別收集不同發(fā)育階段的胚胎，包括兩細(xì)胞期、多細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、視原基期、肌肉效應(yīng)期、色素期和出膜期等9個(gè)發(fā)育時(shí)期的胚胎，用液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑

總RNA提取試劑盒RNAiso Plus和反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Takara，日本)；JNK抑制劑SP600125(Merck-Millipore，美國(guó))；SYBR?Select Master Mix，蛋白酶抑制劑Cocktail，PageRulerTMPrestained Protein Ladder和NBT/BICP 顯色劑(Thermo Scientific，美國(guó))；兔抗JNK1單克隆抗體，鼠抗β-actin單克隆抗體和IgG-AP二抗(Santa Cruz，美國(guó))；DNA Ladder，RIPA裂解液，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天，中國(guó))；JNK1和β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3 主要儀器

徠卡DM3000生物顯微鏡和CH-9435 CCD攝像頭(Leica, 瑞士)； NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國(guó))；Microfuge?20R Centrifuge 臺(tái)式溫控離心機(jī)(Beckman，美國(guó))；凝膠電泳槽(北京六一，中國(guó))；GDS7500 凝膠成像系統(tǒng)(UVP，美國(guó))；ABI Veriti?PCR儀和ABI 7500 HT platform實(shí)時(shí)定量PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))；蛋白電泳Mini-PROTEAN Tetra系統(tǒng)(BioRad，美國(guó))；Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件；Gel-Pro圖像分析軟件和SPSS 19.0軟件。

1.2 方法

1.2.1 SP600125處理胚胎

據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年云南大學(xué)的在校留學(xué)生共923人，在“一帶一路”五周年之際，留學(xué)生數(shù)量相比2013年增加了70%[37]。本研究選取云南大學(xué)校本部的留學(xué)生為研究對(duì)象。據(jù)實(shí)地調(diào)查，云南大學(xué)校本部的留學(xué)生生源主要來(lái)自于東南亞、南亞、東亞及歐美各國(guó)，以東南亞、南亞國(guó)家為主。留學(xué)生多為本科生、語(yǔ)言班學(xué)生，近年來(lái)，研究生、博士生的比例有所提高。

JNK抑制劑SP600125粉末用二甲基亞砜(DMSO)配制并分裝，貯存于-80℃冰箱備用。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，使用不同的JNK抑制劑濃度(0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2和2.4 μm)處理金魚(yú)受精卵，結(jié)果顯示抑制劑濃度太低對(duì)胚胎發(fā)育沒(méi)有影響，而濃度太高則導(dǎo)致胚胎在早期就出現(xiàn)大量死亡?；陬A(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選取2.0 μm的SP600125對(duì)約2000顆受精卵進(jìn)行浸泡處理(實(shí)驗(yàn)組)；曝氣水中自然發(fā)育則設(shè)置為對(duì)照組；且每6 h更換一次抑制劑和曝氣水，始終保持抑制劑濃度為2.0 μm。在高倍顯微鏡下每隔10 min間斷觀察胚胎變化，同時(shí)記錄室溫、距離受精時(shí)長(zhǎng)以及發(fā)育進(jìn)程。

1.2.2 總RNA提取及cDNA 第一條鏈合成

取金魚(yú)各發(fā)育時(shí)期胚胎約20顆加入一定量的液氮充分研磨后參照RNAiso Plust說(shuō)明書(shū)提取總RNA，隨后用1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證各組織RNA片段的完整性。用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度；檢測(cè)結(jié)果較好的總RNA(1.8

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)

采用Quantitative Real-time PCR(qPCR)檢測(cè)JNK1(β-actin作內(nèi)參)在金魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的mRNA表達(dá)水平。qPCR反應(yīng)體系為：5 μL SYBR Mix，0.3 μL正向/反向基因特異引物(JNK1正向引物：5′-GAATAAGCGTGAGAAGGA-3′，反向引物 5′-AAGGGTCGGCTAAGTTTC-3′；β-actin正向引物：5′-GTGACCCACACTGTACCCA-3′，反向引物：5′-TCCAGAGAGGAAGAGGAGGC-3′)，1 μL cDNA 第一條鏈及3.4 μL RNase-free H2O，總體系為10 μL。反應(yīng)條件為：50℃預(yù)變性2 min；95℃變性10 min，95℃退火15 s，60℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序，95℃，60 s；60℃，60 s，從60℃開(kāi)始上升至95℃獲得熔解曲線；每個(gè)樣品均進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定。根據(jù)不同樣本的擴(kuò)增曲線，確定擴(kuò)增循環(huán)數(shù)(Ct值)，參照Livak等[14]提出的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)量R=2-ΔΔCt(目的基因-內(nèi)參基因)，并對(duì)相對(duì)定量的結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western Blotting)

取金魚(yú)各發(fā)育時(shí)期胚胎約40顆用少量液氮研磨至粉末狀，再加入含蛋白酶抑制劑的蛋白抽提液，12 000 r/min 4℃離心20 min，取上清，利用Bradford法測(cè)定總蛋白濃度，隨后蛋白分裝保存于-80℃冰箱。Western Blotting各個(gè)步驟均按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作(蛋白上樣量均為50 μg)。一抗稀釋濃度為：兔抗JNK單克隆抗體(200 g/L，1∶2000)，鼠抗β-actin單克隆抗體(200 g/L，1∶10 000)；二抗稀釋濃度為：抗兔或抗鼠的堿性磷酸酶偶聯(lián)的IgG二抗(1∶10 000)。顯影結(jié)果采用Gel-Pro軟件分析獲得JNK1和β-actin的灰度值，通過(guò)計(jì)算JNK1/β-actin獲得蛋白相對(duì)表達(dá)數(shù)值。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 JNK抑制劑對(duì)金魚(yú)胚胎發(fā)育影響

JNK抑制劑處理的金魚(yú)胚胎在發(fā)育進(jìn)程上較對(duì)照組有明顯滯后的現(xiàn)象，實(shí)驗(yàn)組的胚胎出膜時(shí)間較對(duì)照組推遲約18 h。其中，在受精完成至原腸胚期的發(fā)育時(shí)間和正常發(fā)育時(shí)間基本一致；從原腸胚發(fā)育開(kāi)始，抑制劑處理的胚胎發(fā)育時(shí)間要明顯放緩(表1)，并出現(xiàn)胚胎大量死亡的現(xiàn)象。存活下來(lái)的胚胎繼續(xù)發(fā)育，與對(duì)照組比較，呈現(xiàn)體長(zhǎng)變短，卵黃囊吸收不均勻，且都出現(xiàn)大腦、眼睛、心臟和體節(jié)等組織器官發(fā)育畸形(圖1)。

2.2 JNK1 mRNA在金魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平

采用qPCR對(duì)JNK1 mRNA在金魚(yú)胚胎(對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)進(jìn)行分析。反應(yīng)結(jié)束后，ABI 7500 HT platform系統(tǒng)顯示JNK1和β-actin引物的熔解曲線分別為特異性單峰，表明qPCR擴(kuò)增的是目的產(chǎn)物，引物設(shè)計(jì)符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)和要求。隨后的數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，JNK1在金魚(yú)9個(gè)胚胎發(fā)育中均被檢測(cè)到有一定的表達(dá)，且呈“升高-降低-升高-降低”的波動(dòng)表達(dá)趨勢(shì)，且在肌肉效應(yīng)期表達(dá)量最高(P<0.05)，具體見(jiàn)圖2。在實(shí)驗(yàn)組中，JNK1 mRNA 水平的表達(dá)模式和對(duì)照組中的趨勢(shì)基本一致。

表1 金魚(yú)胚胎對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組發(fā)育時(shí)間

圖1 SP600125抑制JNK信號(hào)通路對(duì)金魚(yú)胚胎發(fā)育的影響
Fig 1 Effect of JNK inhibition on the embryo of goldfish

A～C：SP600125處理組，分別為原腸胚期、色素期和出膜期；D～E：對(duì)照組，分別為原腸胚期、色素期和出膜期

2.3 JNK1蛋白在金魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平

通過(guò)Western Blotting技術(shù)檢測(cè)了JNK1在金魚(yú)胚胎不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，結(jié)果顯示，JNK1在胚胎正常發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)呈“降低-升高-降低”的趨勢(shì)(圖3-A、C)，其中在視原基期的表達(dá)量最高(P<0.05)，在兩細(xì)胞期、神經(jīng)胚期和肌肉效應(yīng)期的表達(dá)水平較高，而出膜期的表達(dá)量最低。實(shí)驗(yàn)組中，JNK1的表達(dá)也呈現(xiàn)明顯的波動(dòng)趨勢(shì)，其中在兩細(xì)胞期和色素期的表達(dá)量較高，胚胎發(fā)育至原腸胚后JNK1持續(xù)保持較低水平的增加；且原腸胚期、神經(jīng)胚期、視原基期和肌肉效應(yīng)期的相對(duì)表達(dá)豐度低于對(duì)照組(圖3-B、C)。

圖2 JNK1在金魚(yú)胚胎不同發(fā)育時(shí)期的mRNA表達(dá)水平Fig 2 Expression level of JNK1 mRNA in in different developmental phases of embryo in control group and experimental group

1：兩細(xì)胞期；2：多細(xì)胞期；3：囊胚期；4：原腸期；5：神經(jīng)胚期；6：視原基期；7：肌肉效應(yīng)期；8：色素期；9：出膜期。數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)，圖中標(biāo)有不同的字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

圖3 JNK1在對(duì)照組(A)和實(shí)驗(yàn)組(B)胚胎不同發(fā)育時(shí)期的蛋白表達(dá)水平以及蛋白豐度柱形圖(C)Fig 3 Protein expression level of JNK1 in different developmental phases of embryo in control group (A) and experimental group (B) and protein abundance column chart (C)

1：兩細(xì)胞期；2：多細(xì)胞期；3：囊胚期；4：原腸期；5：神經(jīng)胚期；6：視原基期；7：肌肉效應(yīng)期；8：色素期；9：出膜期。 數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)，圖中標(biāo)有不同的字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

3 討論

JNK是高等動(dòng)物體內(nèi)廣泛存在的一類(lèi)Ser/Thr蛋白激酶，自1993年Hibi等[15]發(fā)現(xiàn)JNK至今，對(duì)于其在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程中的作用機(jī)制及調(diào)控方式等方面的研究取得了一系列成果。JNK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過(guò)蛋白激酶間的酶促磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，可以簡(jiǎn)單概括為MAPK激酶(MAPK kinase kinases,MAP3Ks)→ MAPK激酶(MAPK kinases, MAP2Ks)→ JNK→ 轉(zhuǎn)錄因子(c-Jun等)[16]。

大量的研究證實(shí)，MPAK/JNK信號(hào)通路能夠?qū)ιL(zhǎng)因子、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)等細(xì)胞因子[17]，紫外輻射、熱激等多種環(huán)境刺激產(chǎn)生應(yīng)答，從而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、運(yùn)動(dòng)、凋亡以及DNA損傷修復(fù)等多種生理生化反應(yīng)。JNK 作為細(xì)胞由正常狀態(tài)向病理狀態(tài)轉(zhuǎn)變過(guò)程中的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)激酶；其功能與神經(jīng)退行性疾病、慢性炎癥、出生缺陷、癌癥等多種疾病的發(fā)生直接相關(guān)[18]。細(xì)胞的增殖方式主要是通過(guò)有絲分裂進(jìn)行的，而JNK激酶對(duì)有絲分裂過(guò)程中的細(xì)胞周期具有重要的調(diào)控作用[16, 19]。一系列研究證明JNK抑制劑SP600125能夠抑制誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡并使癌細(xì)胞阻滯于G2/M時(shí)期[20-22]。在本研究中，JNK抑制劑處理的金魚(yú)胚胎發(fā)育至原腸胚時(shí)期后，與對(duì)照組相比，發(fā)育緩慢，并發(fā)生胚胎的大量死亡，推測(cè)可能是抑制JNK活性后細(xì)胞周期阻滯并誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生凋亡所致。Huang等[23]通過(guò)顯微注射將JNK的顯性突變體(DNM-JNK)轉(zhuǎn)染至金魚(yú)的受精卵進(jìn)而抑制JNK活性，結(jié)果導(dǎo)致金魚(yú)胚胎死亡率顯著增加，同時(shí)引起多種器官(眼睛、神經(jīng)管以及肌肉)出現(xiàn)畸形。He等[12]通過(guò)SP600125處理斑馬魚(yú)胚胎后發(fā)現(xiàn)胚胎大量死亡，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)JNK抑制劑處理后神經(jīng)丘細(xì)胞在分裂過(guò)程中出現(xiàn)缺陷并伴隨caspase-3大量表達(dá)，表明SP600125能顯著誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。本研究中，JNK抑制劑處理的金魚(yú)胚胎在發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)大腦、眼睛、心臟和體節(jié)等組織器官畸形，推測(cè)可能由于JNK活性受抑制進(jìn)而誘導(dǎo)上述組織發(fā)生細(xì)胞凋亡所致；表明JNK信號(hào)通路在組織器官的發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。Chambon等[24]研究發(fā)現(xiàn)JNK信號(hào)的適時(shí)激活是海鞘(ascidian)蝌蚪幼體尾部細(xì)胞發(fā)生凋亡所必需的，從而引起尾巴發(fā)生退化；隨后通過(guò)SP600125處理早期海鞘蝌蚪幼體后，發(fā)現(xiàn)能夠抑制其尾部細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而完全阻斷尾部退化及變態(tài)過(guò)程。Rana等[25]通過(guò)RNA干擾敲降了精子相關(guān)抗原9基因(sperm-associate antigen 9，SPAG9)后發(fā)現(xiàn)其與JNK激酶存在相互作用的結(jié)構(gòu)同源性，表明JNK可能參與生殖細(xì)胞的分化調(diào)控。最新的研究證明SP600125能夠通過(guò)P53信號(hào)通路誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞的體外多倍體化[26]。

本研究中，通過(guò)qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，JNK1在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的mRNA表達(dá)模式基本一致，表明JNK抑制劑對(duì)于JNK1的影響不是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。在蛋白水平，對(duì)照組中JNK1在視原基時(shí)期蛋白表達(dá)量較高，采用JNK抑制處理后，JNK1的表達(dá)趨勢(shì)發(fā)生變化，原腸胚時(shí)期以后(除色素期)相對(duì)表達(dá)豐度低于對(duì)照組；隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)程出現(xiàn)胚胎大量死亡并出現(xiàn)組織器官(大腦、眼睛、心臟和體節(jié)等)畸形。這些結(jié)果說(shuō)明JNK信號(hào)通路在金魚(yú)胚胎發(fā)育及器官形成的過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用；但是對(duì)于JNK1作為一個(gè)獨(dú)立的調(diào)節(jié)基因來(lái)調(diào)控胚胎發(fā)育的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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EffectsofSP600125onembryonicdevelopmentandexpressionofJNK1ingoldfishCarassiusauratus

ZOU Li-jun, GONG Jing, HUANG Wen, ZHUANG Yuan-hong, LIAO Hai-yan, JI Lu

(Laboratory of Basic Biology, Hunan First Normal University, Changsha 410205, China)

The objective of this study was to explore the correlation of the c-Jun amino-terminal kinase (JNK) signaling pathway in the process of embryonic development of Goldfish (Carassiusauratus). SP600125, a JNK-specific inhibitor, gives rise to high mortality in goldfish; the expression of JNK1 was studied and analyzed in different developmental phases of embryo by using Quantitative Real-time PCR and Western Blotting. It was found that SP600125 could significantly block the embryo development time after gastrula stage. SP600125 is also responsible for the severe abnormality of organs, especially the brain, eyes, heart and skeletal system. The qPCR analysis revealed thatJNK1 appeared as "high-low-high-low"expression pattern during different stages of embryonic development in experimental group and control group. Western Blotting analysis showed that expression tendency of JNK1 protein was in line with that ofJNK1 mRNA in the control group. However, in the experimental group, JNK1 protein maintained a low level increase after gastrula stages compare to the control group. Together, these results suggested that JNK signaling pathway plays an important role in embryonic development and organogenesis of fish.

JNK1; SP600125; embryonic development; goldfish; organogenesis

2016-12-16；

2016-12-26

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014FJ4261)；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目(14C0252)

鄒立軍，博士，講師，從事動(dòng)物發(fā)育中的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制研究, E-mail: zoulijun123@163.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.023

Q78

A

2095-1736(2017)06-0023-05