多花黃精組培體系建立及薯蕷皂苷等含量測(cè)定

劉芳源， 王 鈺， 開桂青， 謝 楓

(1. 安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院， 合肥 230601； 2. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230601)

多花黃精組培體系建立及薯蕷皂苷等含量測(cè)定

劉芳源1， 王 鈺1， 開桂青2， 謝 楓1

(1. 安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院， 合肥 230601； 2. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230601)

為了加快繁殖多花黃精，建立多花黃精組培體系，對(duì)組培快繁培養(yǎng)基配方等進(jìn)行研究，并利用UPLC法測(cè)定多花黃精中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的含量。結(jié)果顯示，最適快繁培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA，煉苗最適基質(zhì)為泥炭土+沙子(2∶1)，多花黃精中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元總含量范圍為90.49～174.42 μg/g。

多花黃精；組織培養(yǎng)；薯蕷皂苷；薯蕷皂苷元；UPLC

多花黃精(PolygonatumsibiricumHua)，隸屬百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)，為中國(guó)傳統(tǒng)大宗藥材[1]。多花黃精性平、味甘，具有滋陰潤(rùn)燥、補(bǔ)腎益精、降血脂、降血糖、降血壓、提高人體免疫力、抗衰老、抗腫瘤等功效[2-6]，為滋補(bǔ)上品。多花黃精是藥食同源不可多得的植物，具有很好的開發(fā)與應(yīng)用價(jià)值。然而由于種子發(fā)芽率低、育苗周期長(zhǎng)，多花黃精無法滿足市場(chǎng)需求。與傳統(tǒng)栽培方式相比，組織培養(yǎng)具有不受季節(jié)制約、繁殖系數(shù)較高的優(yōu)點(diǎn)，可在短期內(nèi)大規(guī)模繁殖性狀穩(wěn)定的優(yōu)良種苗[7]。因此，本文通過建立多花黃精組織培養(yǎng)體系，以期為多花黃精快繁、開發(fā)利用和種質(zhì)改良提供參考。

多花黃精中的甾體皂苷主要有薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元[8-9]，具有降血糖、抗腫瘤、抗HIV的生物活性[10-11]。甾體皂苷被認(rèn)為是黃精的主要有效成分之一[4]，但2005 版《中國(guó)藥典》中僅以葡萄糖的含量作為控制黃精藥材質(zhì)量的指標(biāo)，專屬性、實(shí)用性差，不能準(zhǔn)確可靠地控制藥材黃精的質(zhì)量。為更好地利用黃精資源，控制黃精藥材的質(zhì)量，本文采用UPLC法同時(shí)測(cè)定多花黃精中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)所用安徽多花黃精采摘于安徽省池州市九華山境內(nèi)，貴州、湖北、河南產(chǎn)地多花黃精根莖購(gòu)于亳州藥材市場(chǎng)。

1.2 主要儀器與試劑

蘇州凈化SW-CJ-ID型超凈工作臺(tái)，Acquity UPLC 色譜儀系統(tǒng)(包括四元溶劑管理器、自動(dòng)進(jìn)樣器、PDA檢測(cè)器、Waters Acquity UPLC色譜柱、Waters Empower 色譜工作站，美國(guó)Waters公司)，SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE52-99(上海亞榮生化儀器廠)。

氯化高汞(HgCl2)、無水乙醇、甲醇、乙腈、瓊脂、蔗糖、6-芐基氨基酸腺嘌呤(6-BA)、α-萘乙酸(NAA)、吲哚-3-乙酸(IAA)，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 組織培養(yǎng)

1)培養(yǎng)條件。光照強(qiáng)度為2000 Lx，光周期為16 h /d，培養(yǎng)溫度為(24±2) ℃?；A(chǔ)培養(yǎng)基MS，含有30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂，pH 5.8～6.0。實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基均經(jīng)121℃，蒸汽滅菌20 min。

2)種子萌發(fā)。取安徽野生多花黃精種子，沖洗干凈后用75%的乙醇漂洗20 s，無菌水沖洗2次，0.1% 升汞溶液消毒5 min，無菌水沖洗4～5次，接種MS培養(yǎng)基中，接種后放培養(yǎng)室培養(yǎng)觀察，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率。

3)快繁培養(yǎng)基優(yōu)化。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，選用L9(33)進(jìn)行正交試驗(yàn)(表1)，添加IAA、NAA和6-BA 3種激素，將各長(zhǎng)勢(shì)相同多花黃精塊狀莖接種到培養(yǎng)基中，每組接種20瓶，每瓶接種3棵，培養(yǎng)30 d，每3 d觀察并記錄多花黃精芽增殖數(shù)。多花黃精芽增殖平均數(shù)=萌發(fā)不定芽總數(shù)/接種外植體數(shù)

表1 正交試驗(yàn)因素水平

4)煉苗移栽。組培苗長(zhǎng)至5 cm左右，根4～6條時(shí)，將組培苗放置于無菌環(huán)境下開瓶，用鑷子將苗從培養(yǎng)瓶中取出，用大量清水沖洗附在根部的培養(yǎng)基，分別移栽至蛭石+珍珠巖+松木屑(1∶1∶1)、泥炭土+蛭石+珍珠巖(1∶1∶1)、泥炭土+沙子(2∶1) 的基質(zhì)中，每天對(duì)苗進(jìn)行噴霧。煉苗28 d移栽到土壤中，土壤取自校園樹林距地表20 cm處，統(tǒng)計(jì)移栽存活率。

1.3.2 野生植株及組培苗中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元含量測(cè)定

1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備。精密稱取薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元對(duì)照品各20.0 mg置于燒杯中，加甲醇溶解，加入到20 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得1.0 mg/mL對(duì)照品的母液。

2)供試品溶液制備。組培苗(培養(yǎng)60 d)根莖和野生植株根莖放置在烘箱中，于50 ℃下烘至恒重，然后用研缽研磨成精細(xì)粉末，過80目篩。準(zhǔn)確稱取1.00 g粉末，置錐形瓶?jī)?nèi)，精密加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)75%乙醇10 mL，冷浸12 h，超聲處理2 h，過濾，濾液加正丁醇萃取，靜置24 h，取正丁醇相烘干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得供試品。

3)UPLC色譜條件。Waters Acquity UPLC C18色譜柱(2.1 mm×50 mm, 1.7 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0～2 min，45% A；2～5 min，45%～85% A；5～14 min，85%～100% A；14～17 min，100%～45%A)，檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm，體積流量0.3 mL/min，柱溫28℃，進(jìn)樣量5 μL。

4)線性關(guān)系考察。分別精密吸取對(duì)照品母液2.0、3.0、4.0、5.0和6.0 mL，置于5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成0.40、0.60、0.80、1.00和1.20 mg/mL對(duì)照品溶液。取制備好的系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按UPLC色譜條件進(jìn)樣，以對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。

5)含量測(cè)定。取對(duì)照品和供試品溶液，按UPLC 色譜條件進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算供試品中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生多花黃精種子萌發(fā)

野生多花黃精種子萌發(fā)周期較長(zhǎng)，萌發(fā)率極低。本實(shí)驗(yàn)直接處理黃精種子，接種到MS培養(yǎng)基中，發(fā)芽率為27.6%，發(fā)芽周期為45 d。

2.2 不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)多花黃精芽增殖的影響

將各長(zhǎng)勢(shì)相同多花黃精塊狀莖接入繼代增殖培養(yǎng)基一周后，開始有新芽出現(xiàn)，隨后培養(yǎng)基中新芽進(jìn)行繁殖，30 d 后統(tǒng)計(jì)繁殖系數(shù)，結(jié)果見表2。

由表3方差分析所得結(jié)果可知：IAA、NAA、6-BA各水平間的P<0.01，均有極顯著性差異。由結(jié)果可知，篩選出的多花黃精最適培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA，在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的黃精芽增殖系數(shù)較高，達(dá)到3.2，并且長(zhǎng)勢(shì)良好，未添加任何激素的培養(yǎng)基中的黃精芽沒有增殖。

2.3 煉苗移栽

在培養(yǎng)基中培養(yǎng)60 d左右的組培苗根系較為發(fā)達(dá)。煉苗移栽采用了3種基質(zhì)，蛭石+珍珠巖+松木屑(1∶1∶1)的基質(zhì)中，多花黃精存活率為53.3%，泥炭土+蛭石+珍珠巖(1∶1∶1)的基質(zhì)中，存活率為66.7%，泥炭土+沙子(2∶1)的基質(zhì)中，存活率為80%。泥炭土+沙子(2∶1)為較優(yōu)的煉苗基質(zhì)。煉苗28 d后移栽到土壤中。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

A：R2=1.000(調(diào)整R2=0.998)

2.4 野生植株及組培苗中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元含量測(cè)定

2.4.1 線性關(guān)系考察

以對(duì)照品濃度X(mg/mL) 對(duì)色譜峰面積Y進(jìn)行線性回歸分析，得薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元回歸方程分別為Y=5.9×105X+792(R2=0.9996)和Y=1.0×106X-36 609(R2=0.9996)，結(jié)果表明薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元濃度在0.40～1.20 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 多花黃精各時(shí)期生長(zhǎng)情況

A：萌發(fā)的芽； B：叢生芽； C：組培移栽苗(7 d)； D：組培移栽苗(60 d)

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按照UPLC色譜條件測(cè)得薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元峰面積的RSD分別為0.68%和0.82%，表明儀器的精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0、4、8、16、24和48 h后在UPLC色譜條件下測(cè)定。計(jì)算薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元峰面積的RSD分別為2.2%和1.6%，結(jié)果表明供試品溶液中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元在48 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

每種黃精稱取6份樣品，每份各1.00 g，按1.3.2中方法制備供試品溶液，在UPLC色譜條件下分析測(cè)定，求得各樣品中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的濃度，計(jì)算得各黃精的RSD分別為：薯蕷皂苷0.97%，薯蕷皂苷元2.03%，結(jié)果表明此方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

稱取已知含量的安徽黃精粉末6份，每份為1.00 g，分別加入薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元對(duì)照品適量，按1.3.2中方法制備供試品溶液，在UPLC色譜條件下測(cè)定，計(jì)算回收率，分別為99.48%和99.63%，RSD分別為1.71%和0.81%。

2.4.6 不同供試品中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元含量測(cè)定

湖北、貴州、河南、安徽產(chǎn)地多花黃精和組培苗各稱取6份樣品，按1.3.2中方法制備供試品溶液，在UPLC色譜條件下測(cè)定，并計(jì)算薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的平均含量，結(jié)果見表4。

通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)組培苗和不同產(chǎn)地的野生植株中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的含量都存在差異，薯蕷皂苷變化范圍為38.28～90.36 μg/g，薯蕷皂苷元變化范圍為52.21～87.95 μg/g。薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元總含量從高到低的順序?yàn)椋喊不?組培苗>貴州>湖北>河南，所檢測(cè)的成分在組培塊狀莖中的總含量較安徽野生植株低，這與李鶯等研究結(jié)果一致[12]，不同產(chǎn)地間含量的差異與趙欣等研究結(jié)果一致[13]。

表4 樣品測(cè)定結(jié)果

圖2薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元混合對(duì)照品(A)和供試品(B)的UPLC圖

Fig 2 UPLC of yam saponins and diosgenin mixed reference substances(A) and samples(B)

1：薯蕷皂苷；2：薯蕷皂苷元；a：湖北；b:貴州；c:河南；d:安徽;e:組培苗

3 討論

利用黃精種子育苗，建立組培體系較易獲得成功。直接從田間取樣的多花黃精外植體用于組培，接種后會(huì)出現(xiàn)內(nèi)生菌[14]。選用種子培養(yǎng)，播種在MS培養(yǎng)基中，出苗后再進(jìn)行試管苗培養(yǎng)，可以避免自然環(huán)境中雜菌的感染，較易建立多花黃精組培體系。

薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元是黃精中的主要皂苷類成分，測(cè)定薯蕷皂苷元和薯蕷皂苷的含量，對(duì)控制生物制藥和制劑的質(zhì)量非常有必要。現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)于藥材質(zhì)量控制大多只涉及薯蕷皂苷元1種成分，皂苷元的獲得須經(jīng)水解、萃取、調(diào)節(jié)pH等步驟，操作煩瑣，收率不穩(wěn)定，易產(chǎn)生副反應(yīng)，而對(duì)薯蕷皂苷含量測(cè)定鮮有報(bào)道。本研究所建立的超高效液相色譜測(cè)定方法不但能夠同時(shí)反映薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的真實(shí)含量，而且操作簡(jiǎn)單快速、靈敏度高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表4和圖2)顯示安徽薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元總量較其他3個(gè)產(chǎn)地含量高，與前人研究結(jié)果一致[15]，造成這種結(jié)果的原因可能是：黃精生長(zhǎng)喜陰喜濕，安徽九華山雨水較多，土壤濕潤(rùn)，適宜黃精生長(zhǎng)。組培苗中薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元總含量比野生植株的低，但組培苗具有繁殖率高、生長(zhǎng)速度快的優(yōu)點(diǎn)，方便實(shí)行工業(yè)化生產(chǎn)，為薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元的制備提供原料。

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EstablishmentoftissueculturesystemanddeterminationofyamsaponinsanddiosgenininPolygonatumsibiricumHua

LIU Fang-yuan1, WANG Yu1, KAI Gui-qing2, XIE Feng1

(1. School of Resources and Environmental Engineering; 2. School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230601, China)

In order to accelerate the reproduction ofPolygonatumsibiricumHua, the paper established the tissue culture system ofPolygonatumsibiricumHua and studied the rapid propagation of tissue culture medium. The UPLC method was used for the determination of yam saponins and diosgenin inPolygonatumsibiricumHua. The results showed that the optimal medium was MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+0.3 mg/L IAA. The optimal medium for hardening was peat soil and sand(2∶1). The total content of yam saponins and diosgenin was in the range of 90.49-174.42 μg/g.

PolygonatumsibiricumHua; tissue culture; yam saponins; diosgenin; UPLC

2016-10-24；

2016-11-09

安徽大學(xué)研究生學(xué)術(shù)創(chuàng)新研究項(xiàng)目(YQH100245)

劉芳源，碩士，研究方向?yàn)榉N植資源保護(hù)與利用，E-mail:liufy522@163.com

王 鈺，教授，博士，研究方向?yàn)榉N植資源保護(hù)與利用，E-mail: 03136@ahu.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.093

Q946.83

B

2095-1736(2017)06-0093-04