超聲輔助提取金針菇中麥角甾醇及其HPLC測(cè)定方法

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(陜西理工大學(xué)，維生素D生理與應(yīng)用研究所,陜西漢中 723000)

超聲輔助提取金針菇中麥角甾醇及其HPLC測(cè)定方法

胡代花,張嘉昕,李翠麗,陳旺,趙浩名,王文博

(陜西理工大學(xué)，維生素D生理與應(yīng)用研究所,陜西漢中 723000)

采用超聲輔助提取方法,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),對(duì)影響麥角甾醇提取效果的主要因素提取溶劑、提取時(shí)間、料液比和提取溫度進(jìn)行研究,并建立金針菇中麥角甾醇HPLC測(cè)定方法。結(jié)果表明,各因素對(duì)金針菇中麥角甾醇得率的影響程度依次為提取次數(shù)、料液比、提取溫度和提取時(shí)間。最佳提取條件為無(wú)水乙醇超聲提取2次,每次20 min,料液比1∶50,提取溫度50 ℃,在該提取條件下,麥角甾醇得率高達(dá)2.28 mg·g-1。麥角甾醇的線性范圍為10.00～100.00 μg·mL-1,相關(guān)系數(shù)為0.9998,平均回收率(n=9)為100.31%,RSD(n=9)為2.69%,分析周期11 min。該法與傳統(tǒng)皂化回流提取相比,提取效率及重現(xiàn)性均較好。

金針菇,麥角甾醇,超聲輔助提取,高效液相色譜法

超聲波是一種高頻機(jī)械振蕩波,其空化效應(yīng)可以強(qiáng)化萃取效果,其產(chǎn)生的熱效應(yīng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)、生物效應(yīng)、凝聚效應(yīng)等次級(jí)效應(yīng)也能加速有效成分在溶劑中的擴(kuò)散釋放,因此超聲提取法具有縮短提取時(shí)間,減少溶劑用量,提高提取率等諸多優(yōu)勢(shì)而得到較廣泛應(yīng)用[21-23]。

本論文擬采用超聲波輔助提取法,應(yīng)用單因素和正交實(shí)驗(yàn),通過(guò)考察提取溶劑、提取次數(shù)、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等5個(gè)方面對(duì)金針菇粉中麥角甾醇的提取效果的影響,對(duì)其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,并建立金針菇中麥角甾醇的HPLC含量檢測(cè)方法,旨在為其深加工和高值化開(kāi)發(fā)利用提供理論參考和技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金針菇粉 鮮金針菇(購(gòu)自漢中市蔬菜市場(chǎng))剪去根部約2 cm,置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干后研磨成粉,過(guò)200目篩,冷卻至室溫,裝袋密封4 ℃保存?zhèn)溆?麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品(美侖生物技術(shù)有限公司,純度98%,20 mg);丙酮、乙醚、氯仿、乙醇 均為分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司;乙醇、乙腈、甲酸 均為色譜級(jí),購(gòu)自Sigma-Aldrich公司;KOH-EtOH溶液 25 g KOH用40 mL去離子水溶解,乙醇定容至100 mL。

1260高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司;BSA224S-CW萬(wàn)分之一電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司;5810 R低速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;KQ-500E超聲波清洗儀(固定功率500 W,頻率40 kHz) 昆山舒美公司;FW177中草藥粉碎機(jī)、101-3A電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;BCD-278TAJ冰箱 青島海爾有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 金針菇粉麥角甾醇的提取和得率測(cè)定 取一定量金針菇粉,按一定料液比加入提取溶劑,于一定溫度下超聲提取(功率500 W,頻率40 kHz)一定時(shí)間和一定次數(shù)后,3500 r·min-1離心10 min,上清液定容至一定體積,0. 22 μm微孔濾膜濾過(guò),直接進(jìn)色譜系統(tǒng)分析。參照線性回歸方程、溶液總體積和稱樣量計(jì)算麥角甾醇得率。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)。麥角甾醇得率(mg/g)=待測(cè)液濃度×待測(cè)液總體積/稱樣量。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 不同提取溶劑對(duì)麥角甾醇得率的影響 固定反應(yīng)條件為提取溫度40 ℃,提取時(shí)間15 min,提取次數(shù)2次,提取料液比1∶50 (g/mL),考察不同提取溶劑(乙醇、乙醚、丙酮和氯仿)對(duì)麥角甾醇得率的影響。

1.2.2.2 不同提取次數(shù)對(duì)麥角甾醇得率的影響 固定反應(yīng)條件為提取溶劑無(wú)水乙醇,提取溫度40 ℃,提取時(shí)間15 min,提取料液比1∶50 (g/mL),考察不同提取次數(shù)(1、2、3次)對(duì)麥角甾醇得率的影響。

1.2.2.3 不同提取時(shí)間對(duì)麥角甾醇得率的影響 固定反應(yīng)條件為提取溶劑無(wú)水乙醇,提取溫度40 ℃,提取次數(shù)2次,提取料液比1∶50 (g/mL),考察不同提取時(shí)間(10、15、20、30、40 min)對(duì)麥角甾醇得率的影響。

1.2.2.4 不同提取料液比對(duì)麥角甾醇得率的影響 固定反應(yīng)條件為提取溶劑無(wú)水乙醇,提取溫度40 ℃,提取時(shí)間15 min,提取次數(shù)2次,考察不同提取料液比(1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶50 g/mL)對(duì)麥角甾醇得率的影響。

1.2.2.5 不同提取溫度對(duì)麥角甾醇得率的影響 固定反應(yīng)條件為提取溶劑無(wú)水乙醇,提取料液比1∶40 (g/mL),提取時(shí)間15 min,提取次數(shù)2次,考察不同提取溫度(20、30、40、50、60、70 ℃)對(duì)麥角甾醇得率的影響。

1.2.3 正交實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以無(wú)水乙醇為提取溶劑,超聲功率500 W,選取提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比、提取溫度作為影響麥角甾醇得率因素,以四因素三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1 The factors and levels table of the orthogonal test

1.2.4 含量測(cè)定方法學(xué)考察

1.2.4.1 色譜條件的選擇 柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)282 nm。比較了不同比例的乙腈-0.1%甲酸流動(dòng)相(80∶20、95∶5、96∶4、97∶3、98∶2),4.6×100 mm(3.5 μm)和4.6×250 mm(5 μm)兩種Agilent RP C18色譜柱,以及0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min四種流速對(duì)分離效果的影響。

1.2.4.2 溶液的制備 對(duì)照品溶液:精密稱取麥角甾醇對(duì)照品100 mg,置于50 mL棕色容量瓶中,乙醇溶解后定容至刻度,配制成對(duì)照品母液。經(jīng)逐步定量稀釋,制成10、20、40、60、80、100 μg·mL-1的系列對(duì)照品溶液;供試品溶液參照1.2.1方法制備。

1.2.4.3 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 對(duì)照品溶液、供試品溶液各進(jìn)樣10 μL,利用液相色譜儀測(cè)定,記錄色譜圖。

1.2.4.4 線性關(guān)系考察 系列對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣10 μL,以282 nm處的吸收峰面積對(duì)濃度作曲線,進(jìn)行擬合。

1.2.4.5 精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)照品溶液進(jìn)樣10 μL,連續(xù)進(jìn)樣5 次,測(cè)定麥角甾醇峰面積。

1.2.4.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液,分別在0、2、4、8、12和24 h各進(jìn)樣10 μL,測(cè)定麥角甾醇峰面積。

1.2.4.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取不同批次金針菇粉末樣品,按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,計(jì)算含量。

1.2.4.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知麥角甾醇含量的金針菇粉3 份,分別加入0.330、0.416、0.500 mg麥角甾醇標(biāo)準(zhǔn)品,按“1.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,依法測(cè)定,計(jì)算回收率,每處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 傳統(tǒng)皂化回流提取 精確稱取1.0 g金針菇粉,混懸于32 mL KOH-EtOH溶液中,85～90 ℃回流提取3 h,待提取液冷卻后,倒入分液漏斗中,正庚烷提取三次(3×10 mL),蒸除溶劑,無(wú)水乙醇溶解定容至10 mL,0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),直接進(jìn)色譜系統(tǒng)分析。每個(gè)處理進(jìn)行3次重復(fù)[12,24]。

1.2.6 超聲輔助提取(EtOH-KOH為提取液) 精確稱取200 mg金針菇粉,混懸于10 mL KOH-EtOH溶液中,60 ℃超聲提取2次,每次40 min,合并提取液,倒入分液漏斗中,正庚烷提取三次(3×10 mL),蒸除溶劑,無(wú)水乙醇溶解定容至10 mL,0.22 μm微孔濾膜濾過(guò),直接進(jìn)色譜系統(tǒng)分析。每處理3個(gè)重復(fù)[12,24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用Tukey’s HSD進(jìn)行方差分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑對(duì)麥角甾醇得率的影響 由圖1可知,不同提取溶劑對(duì)金針菇中麥角甾醇提取效率影響較大,其中無(wú)水乙醇為溶劑的得率最高,分別是丙酮、氯仿及乙醚為溶劑時(shí)提取得率的1.44、1.46和2.57倍,并與丙酮和乙醚為溶劑時(shí)提取得率差異顯著(p<0.05),但與氯仿為溶劑時(shí)提取得率相比無(wú)顯著差異(p>0.05)。當(dāng)以氯仿為提取溶劑時(shí),由于混懸液分層不明顯,給實(shí)際操作帶來(lái)了一定影響。綜合考慮提取效率、提取溶劑安全性和經(jīng)濟(jì)性,確定麥角甾醇提取溶劑為無(wú)水乙醇。

圖1 提取溶劑對(duì)麥角甾醇得率的影響Fig.1 Effect of solvent on extraction yield of ergosterol 注:不同小寫字母表示差異顯著,p<0.05;圖2～圖5同。

2.1.2 提取次數(shù)對(duì)麥角甾醇得率的影響 由圖2可知,不同提取次數(shù)對(duì)麥角甾醇提取得率影響較大,隨著提取次數(shù)增加,提取得率逐漸升高,提取一次、兩次、三次的麥角甾醇得率依次為(1.40±0.21)、(1.82±0.01)和(1.91±0.06) mg·g-1,其中兩次與三次提取得率之間在5%水平無(wú)顯著性差異,而提取一次與提取兩次、三次的得率間均有顯著性差異。綜合考慮提取得率及經(jīng)濟(jì)性,確定麥角甾醇提取次數(shù)為兩次。

圖2 提取次數(shù)對(duì)麥角甾醇得率的影響Fig.2 Effect of extraction on extraction yield of ergosterol

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)麥角甾醇得率的影響 由圖3可知,不同提取時(shí)間對(duì)麥角甾醇提取得率影響較大,在10～40 min提取時(shí)間范圍內(nèi),隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),提取得率先升高后趨于穩(wěn)定。提取10、15、20、30、40 min的麥角甾醇提取得率分別為(1.24±0.22)、(1.96±0.06)、(1.95±0.07)、(1.96±0.04)和(2.06±0.10) mg·g-1。其中提取10 min與提取15、20、30、40 min的得率均有顯著性差異(p<0.05),而提取15、20、30、40 min的得率差異無(wú)顯著(p>0.05)。綜合考慮提取得率及經(jīng)濟(jì)性,確定麥角甾醇提取時(shí)間為15 min。

圖3 提取時(shí)間對(duì)麥角甾醇得率的影響Fig.3 Effect of time on extraction yield of ergosterol

2.1.4 料液比對(duì)麥角甾醇得率的影響 由圖4可知,不同料液比對(duì)麥角甾醇提取得率影響極大,在1∶5～1∶50料液比范圍內(nèi),提取得率隨著料液比增加先升高后趨于平緩,料液比(g/mL)為1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶50時(shí)麥角甾醇提取得率分別為(0.32±0.07)、(0.62±0.02)、(1.42±0.35)、(1.68±0.08)和(1.99±0.01) mg·g-1,其中料液比為1∶40的提取得率與1∶20和1∶50間均無(wú)顯著性差異,而與料液比為1∶5和1∶10間的提取得率差異顯著。綜合考慮提取得率且減少不必要浪費(fèi),確定麥角甾醇提取料液比為1∶40。

圖4 料液比對(duì)麥角甾醇得率的影響Fig.4 Effect of ratios of solvent to material on extraction yield of ergosterol

2.1.5 提取溫度對(duì)麥角甾醇得率的影響 由圖5可知,不同提取溫度對(duì)麥角甾醇提取得率有較大影響,20、30、40、50、60、70 ℃時(shí)麥角甾醇提取得率依次為(1.55±0.03)、(1.70±0.04)、(1.68±0.08)、(1.83±0.09)、(1.96±0.05)和(1.75±0.23) mg·g-1。其中60 ℃與20 ℃提取得率間有顯著性差異,與其余溫度提取得率間均無(wú)顯著性差異;20 ℃與其余溫度提取得率間均無(wú)顯著性差異。綜合考慮提取得率、能耗及可操作性,確定麥角甾醇提取溫度為40 ℃。

圖5 提取溫度對(duì)麥角甾醇得率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction yield of ergosterol

表4 麥角甾醇測(cè)定的回歸方程、線性范圍、回收率、精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性Table 4 The linear equation,linear range,recovery,precision,stability and repeatability of ergosterol determination

2.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以無(wú)水乙醇為提取溶劑,超聲功率500 W,選取提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比、提取溫度作為影響金針菇中麥角甾醇得率因素,以四因素三水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析(n=3)Table 2 Trials and results of orthogonal experiment(n=3)

由表2中R值可知,影響金針菇中麥角甾醇得率的先后順序依次為:提取時(shí)間(B)>料液比(C)>提取次數(shù)(A)>提取溫度(D)。由表3方差分析結(jié)果可知,提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)對(duì)麥角甾醇得率的影響極為顯著,提取溫度對(duì)麥角甾醇得率的影響不顯著。正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得出的條件為A2B3C3D3,即無(wú)水乙醇超聲提取2次,每次20 min,料液比1∶50 (g/mL),提取溫度50 ℃。對(duì)優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),麥角甾醇得率高達(dá)(2.28±0.03) mg·g-1(n=3)。

表3 方差分析表Table 3 Analysis results of variance

注:**表示p<0.01,極顯著。

2.3 含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.3.1 色譜條件的選擇 比較了不同比例的乙腈-0.1%甲酸流動(dòng)相(80∶20、95∶5、96∶4、97∶3、98∶2),結(jié)果表明在80∶20比例下麥角甾醇色譜峰的分離效果不佳,在95∶5比例時(shí),麥角甾醇與其相鄰組分分離效果較好,當(dāng)繼續(xù)增加乙腈比例時(shí),麥角甾醇色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,且保留時(shí)間增長(zhǎng);比較了4.6 mm×100 mm(3.5 μm)和4.6 mm×250 mm(5 μm)兩種C18柱色譜柱,結(jié)果表明前者麥角甾醇保留時(shí)間為7.7 min,而后者麥角甾醇保留時(shí)間超過(guò)30 min;比較了0.6、0.8、1.0、1.2 mL/min四種流速,結(jié)果表明0.6、0.8、1.0 mL/min下麥角甾醇保留時(shí)間分別為13.86、10.18、7.7 min,而1.2 mL/min流速的保留時(shí)間為6.91 min,但峰形較寬。綜合以上因素,最終確定色譜條件為:Agilent RP C18色譜柱(4.6 mm×100 mm,3.5 μm),流速1.0 mL·min-1,流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(95∶5)。麥角甾醇測(cè)定的回歸方程、線性范圍、回收率、精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性結(jié)果見(jiàn)表4。

2.3.2 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 由圖6可知,該色譜條件下,麥角甾醇與相鄰色譜峰能達(dá)到較好的分離,且出峰時(shí)間合適,峰形較好,干擾少。

圖6 麥角甾醇對(duì)照品溶液(A)及樣品溶液(B)HPLC色譜圖Fig.6 Ergosterol HPLC chromatogram of standard solution(A)and sample solution(B)

2.4 三種提取方法比較

由表5可知,乙醇超聲輔助(EtOH-UAE)比EtOH-KOH超聲輔助提取(EtOH-KOH-UAE)和傳統(tǒng)回流提取(RE)對(duì)金針菇麥角甾醇的提取更完全,具有提取時(shí)間短、得率高、操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性佳、樣品用量少等優(yōu)勢(shì),適用于快速高效準(zhǔn)確提取麥角甾醇;EtOH-KOH-UAE相比EtOH-UAE提取率較低,RSD值較高,且后處理還需多次萃取、減壓蒸除溶劑和定容等步驟,進(jìn)一步增加了提取成本及樣品處理時(shí)間;而傳統(tǒng)皂化回流提取相比提取率最低,耗時(shí)最長(zhǎng)且重現(xiàn)性較差。

表5 傳統(tǒng)回流提取、皂化液超聲輔助提取和乙醇超聲輔助提取比較Table 5 Comparison of conventional extraction and EtOH-KOH ultrasonic-assisted extraction with EtOH microwave assisted extraction

注:①以傳統(tǒng)回流提取方法的提取率為100%計(jì)算;②3次實(shí)驗(yàn)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3 結(jié)論

采用超聲輔助提取方法,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn),對(duì)影響麥角甾醇提取效果的主要因素進(jìn)行研究,并建立金針菇中麥角甾醇HPLC測(cè)定方法。結(jié)果表明,各因素對(duì)金針菇中麥角甾醇得率的影響程度依次為提取時(shí)間,料液比,提取次數(shù)和提取溫度。最佳提取條件為無(wú)水乙醇超聲提取2次,每次20 min,料液比1∶50,提取溫度50 ℃,在該提取條件下,麥角甾醇得率高達(dá)2.28 mg·g-1。麥角甾醇的線性范圍為10.00～100.00 μg·mL-1,相關(guān)系數(shù)為0.9998,平均回收率(n=9)為100.31%,RSD(n=9)2.69%,且分析周期在11 min以內(nèi)。該法與EtOH-KOH-UAE法和RE法兩種方法同比,結(jié)果表明EtOH-UAE法比EtOH-KOH-UAE法和RE法對(duì)金針菇麥角甾醇的提取更完全,具有提取時(shí)間短、得率高、操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性佳、樣品用量少等優(yōu)勢(shì),適用于金針菇生產(chǎn)及對(duì)生物量的間接測(cè)定,也可以被借鑒于其他真菌的相關(guān)研究和應(yīng)用中。

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Optimizationofultrasonic-assistedextractionprocessofergosterolfromFlammulinavelutipesanditsdeterminationbyHPLC

HUDai-hua,ZHANGJia-xin,LICui-li,CHENWang,ZHAOHao-ming,WANGWen-bo

(Vitamin D Research Institute,Shaanxi University of Technology,Hanzhong 723000,China)

The main factors affecting the ultrasonic-assisted extraction efficiency of solvent types,times,ratios of solvent to material,duration and temperature on the yield of ergosterol inFlammulinavelutipeswere researched respectively by single-factor experiments,and the extraction process were optimized by orthogonal tests. The results showed that the factors affecting the extraction rate of ergosterol were in the order of extraction duration,extraction ratios of solvent to material,extraction times and extraction temperature. The optimum extraction conditions were as follows:the extraction time 20 min and number of extraction 2 times,the ratio of material to ethanol was 1∶50 (g/mL),extraction temperature 50 ℃. Under these conditions,the average extraction yield of ergosterol was 2.28 mg·g-1. The linear range of ergosterol was 10.00～100.00 μg·mL-1(R2=0.9998),the average recoveries(n=9)was 100.31% with RSD 2.69%,and the analysis cycle was within 11 minutes. This method showed significantly higher extraction yield and reproducibility compared with conventional reflux.

Flammulinavelutipes;ergosterol;ultrasonic-assisted extraction;HPLC

2017-06-16

胡代花(1983-)，女，博士，講師，主要從事維生素D類保健食品研發(fā)方面的工作，E-mail:hudaihua007@163.com。

陜西理工大學(xué)博士后項(xiàng)目(SLGBH16-04)；陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2012KCT-29)；陜西省2011協(xié)同中心項(xiàng)目(QBXT-Z(P)-15-15)；陜西理工大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目(SLGQD16-10)；漢中市科技局項(xiàng)目(2013FZ24)。

TS209

A

1002-0306(2017)23-0192-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.036