重組聚半乳糖醛酸酶PGB的生化特征及其酶解產(chǎn)物活性分析

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(1.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院與工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457)

重組聚半乳糖醛酸酶PGB的生化特征及其酶解產(chǎn)物活性分析

諶新然1,黃永生2,田康明1,2,*,金鵬1,董自星1,劉曉光1,路福平2,王正祥1,2

(1.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院生物化工系,天津 300457;2.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院與工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457)

解析重組聚半乳糖醛酸酶PGB的酶學(xué)性質(zhì),研究PGB制備的果膠水解物的基本成分和生物學(xué)活性。通過搖瓶發(fā)酵制備聚半乳糖醛酸酶酶液,研究其基本酶學(xué)性質(zhì)。再在最優(yōu)作用條件下對果膠進行水解,并考察水解產(chǎn)物的組成、抗菌活性和抗氧化活性。在搖瓶發(fā)酵水平,黑曲霉聚半乳糖醛酸酶PGB的酶活達到10790 U/mL;該酶的最適作用溫度和pH分別為55 ℃和5.0;在40 ℃或pH4.0～6.0條件下具有較好穩(wěn)定性。Mg2+和Cu2+對其活性有促進作用,K+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Fe2+等對其活性均有不同程度的抑制作用;它對低酯果膠的Km和Vmax分別是0.756 mg/mL和9.225 mg/(mL·min)。高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)的分析表明,PGB對果膠的酶解產(chǎn)物是半乳糖醛酸單體和聚合度2～4為主的寡聚半乳糖醛酸,它對金黃色葡萄球菌的生長有顯著抑制作用,其最小抑菌濃度和抗氧化活性分別為0.64 mg/mL和6.125 U/mL。

聚半乳糖醛酸酶,生化特征,果膠,寡聚半乳糖醛酸

果膠是植物細胞壁基質(zhì)多糖的主要組成成分,其主鏈?zhǔn)怯赏桶肴樘侨┧?Homogalacturonan,HG)和鼠李糖半乳糖醛酸(Rhamnogalacturonan,RG)[1]組成,其中RGI上連接著阿拉伯糖、半乳糖和阿拉伯半乳糖等中性糖鏈[1-2]。果膠不完全降解產(chǎn)生的不同聚合度的半乳糖醛酸,稱為寡聚半乳糖醛酸,是第一個被發(fā)現(xiàn)的功能性多糖[3]。寡聚半乳糖醛酸是一類酸性寡糖,由2～20個α-1,4-D-吡喃半乳糖醛酸組成[4],部分半乳糖醛酸以甲酯化形式存在。寡聚半乳糖醛酸可作為植物抗病防病的誘導(dǎo)劑[5],食品添加劑中的抗氧化劑[6]及抑菌劑[7],并有可能作為化妝品中的有抑菌活性和抗氧化活性的添加劑。

寡聚半乳糖醛酸是通過水解(降解)果膠大分子為低聚或寡聚分子而得,常見的制備方法包括熱處理[8]、酸水解方法[9]及酶法水解[10]。當(dāng)利用熱處理法降解果膠時,果膠的降解效果與其甲酯化程度呈負相關(guān),水解效果不明顯。果膠在強酸性溶液中是不穩(wěn)定的,會發(fā)生長鏈的部分水解,即糖苷鍵的斷裂,形成許多分子量大小不等的片段,高度水解則大部分變成單體(糖)。與前兩種方法相比較,酶法水解有處理方式簡單、高效且產(chǎn)物組分明確可控等優(yōu)勢,其作用過程是隨機水解果膠結(jié)構(gòu)內(nèi)部的(1→4)-α-D-半乳糖醛酸鍵。可以依據(jù)不同酶的運用以及通過控制酶解條件,生產(chǎn)出不同聚合度的寡聚半乳糖醛酸[11]。可見,酶法制備寡聚半乳糖醛酸是主要的發(fā)展方向,相關(guān)酶制劑的獲得則是本制備方法成功實施的關(guān)鍵所在。

目前,商品化的果膠酶酶制劑絕大多數(shù)是復(fù)合型果膠酶,無法直接用其對特定的果膠底物進行水解制備寡聚物。在前期工作中,本課題組對黑曲霉果膠水解酶系進行了系統(tǒng)研究與篩查,其中聚半乳糖醛酸酶PGB為未公開報導(dǎo)的新酶,對果膠分子具有較好內(nèi)切水解活性。本研究進一步對其酶學(xué)特征進行了系統(tǒng)分析,探討應(yīng)用此酶水解果膠制備寡聚半乳糖醛酸的可能性,并檢驗其生理學(xué)功能。對果膠的深度生物加工、衍生新產(chǎn)品的開發(fā)及其在食品、保健品和化妝品中的應(yīng)用具有重要參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌種:畢赤酵母GS115、重組畢赤酵母GS115-PGB(表達黑曲霉聚半乳糖醛酸酶PGB,課題組前期構(gòu)建,未發(fā)表數(shù)據(jù))以及金黃色葡萄球菌 均保藏于天津科技大學(xué)生物催化與生物轉(zhuǎn)化研究室；畢赤酵母培養(yǎng)基有YPD、BMGY、BMMY 均參照Invitrogen的畢赤酵母操作手冊進行配制,其培養(yǎng)溫度為30 ℃；金黃色葡萄球菌 采用LB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)；胰蛋白胨(Tryptone)和酵母提取物(Yeast Extract) 英國OXOID公司產(chǎn)品;低酯果膠(酯化度30%～40%) 購自江蘇銳陽生物科技有限公司;寡聚半乳糖醛酸 由Sigma公司提供；其它試劑 均為國產(chǎn)分析純。

回旋式恒溫調(diào)速搖床 上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司;HG75-3電熱恒溫培養(yǎng)箱 南京實驗儀器廠;GL20A型冷凍離心機 梅田科學(xué)儀器有限公司;SP-2012UV型分光光光度計 上海光譜儀器有限公司;HW SY21-K電熱恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器儀表公司;Infinite M200 PRO型多功能酶標(biāo)儀 天津志卓生物科技有限公司;ICS5000多功能離子色譜儀 美國戴安公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組酶的制備 按照畢赤酵母表達操作手冊(Invotrogen),將甘油管中保藏的重組菌GS115-PGB接種于YPD平板,三區(qū)劃線后于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h,挑取單菌落轉(zhuǎn)接于25 mL YPD液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16～18 h。待菌體OD600達2.0～6.0,移取250～500 μL于25 mL BMGY液體培養(yǎng)基中,于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16～18 h,4 ℃、8000 r/min離心5 min收集菌體,將菌體用BMMY培養(yǎng)基稀釋至OD600=1.0,于30 ℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)。每隔24 h補加0.5%(v/v)的甲醇進行誘導(dǎo),并取樣進行酶活測定。發(fā)酵結(jié)束后,離心收集發(fā)酵上清液,即為粗酶液,-20 ℃保存,備用。采用鹽析(30%～80%硫酸銨)[12]和透析對重組酶PGB進行初步純化,得到純化后的PGB酶液。

1.2.2 重組酶的酶活測定 PGB酶活的測定按照文獻介紹的方法進行[13],其一般步驟是:取經(jīng)過適當(dāng)稀釋的200 μL粗酶液,加入1.8 mL 1%(w/v)低酯果膠(溶于0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液,pH3.5),50 ℃下反應(yīng)30 min。再加入1 mL去離子水和2.5 mL DNS溶液置于沸水中煮沸5 min顯色,冷卻并定容到12.5 mL后,于540 nm測定吸光度。以加熱滅活的PGB發(fā)酵液為對照。在50 ℃、pH3.5條件下,每小時酶解果膠生成1 mg半乳糖醛酸定義為一個酶活單位,用U/mL表示。其中,DNS試劑的配制方法如下:稱取酒石酸鉀鈉18.2 g,溶于50 mL蒸餾水中,加熱,于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸0.63 g,NaOH 2.1 g,苯酚0.5 g,攪拌至溶解,冷卻后用蒸餾水定容至100 mL,貯于棕色瓶中,室溫保存。

1.2.3 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.3.1 重組酶的最適作用溫度和pH分析 固定反應(yīng)體系的pH為3.5,在30～80 ℃下進行反應(yīng),然后按照1.2.2的方法進行酶活測定,確定重組酶PGB的最適反應(yīng)溫度。在50 ℃下,分別在pH2.0～7.0的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中進行反應(yīng),然后進行酶活測定,以酶活最高者為100%計算相對酶活力，確定PGB的最適反應(yīng)pH。

1.2.3.2 重組酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性分析 將重組酶PGB在40～80 ℃條件下保溫2 h,每隔30 min取樣并終止反應(yīng),測定酶活,以未進行熱處理的酶液酶活力為100%,計算相對酶活,確定聚半乳糖醛酸酶的熱穩(wěn)定性。pH穩(wěn)定性實驗在pH2.0～8.0的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液中于最適作用溫度下保溫1 h后,測定酶活,以酶活最高者為100%計算殘余酶活力,確定聚半乳糖醛酸酶的pH穩(wěn)定性。

1.2.3.3 金屬離子對重組酶酶活的影響 在聚半乳糖醛酸酶與其底物進行反應(yīng)體系中,加入不同的金屬離子,并使其最終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L,以不加金屬離子的反應(yīng)體系的酶活為100%表示不同金屬離子或化合試劑下的相對酶活性。

1.2.3.4 聚半乳糖醛酸酶動力學(xué)常數(shù)的測定 以不同濃度(4～10 mg/mL)的低酯果膠為底物,在50 ℃、0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L檸檬酸的緩沖液(pH3.5)中測定酶活力。按雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)計算出其Km和Vmax。

1.2.4 酶解產(chǎn)物分析 在PGB的最適作用條件(55 ℃、pH5.0)下,根據(jù)酶活力計算酶液添加量,加入5 U/mL PGB作用于10 mg/mL低酯果膠,果膠被水解生成聚合度較小的寡聚物,并利用HPAEC-PAD對水解產(chǎn)物進行分析。HPAEC-PAD法:參照文獻方法進行[14]。采用CarboPac PA200分析柱(3 mm×250 mm),柱溫:30 ℃,淋洗液:(A)超純水;(B)200 mmol/L NaOH(50%);(C)1 mol/L醋酸鈉(20%～50%),流速為0.5 mL/min,脈沖安培檢測器(PAD),進樣量為1 mL。取果膠水解產(chǎn)物及寡聚半乳糖醛酸(1 mg/mL)進行檢測分析。

1.2.5 抑菌實驗及最小抑菌濃度測定 抑菌實驗按照文獻方法進行[15]。挑取金黃色葡萄球菌的單菌落接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約1.5,吸取500 μL培養(yǎng)液加入到融化的LB固體培養(yǎng)基中,混勻倒平板,待平板凝固后于平板上等距離打孔,加入果膠酶解液。37 ℃培養(yǎng)過夜,觀察菌落生長情況。以加入滅活PGB的果膠溶液為對照。

采用微量肉湯稀釋法[16]測定最小抑菌濃度。首先,將果膠酶解液進行倍比稀釋,吸取稀釋后的溶液100 μL加入96孔板,并加入1.0×106CFU/mL的金黃色葡萄球菌菌液100 μL吹吸混勻。然后,于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng),采用多功能酶標(biāo)儀測定菌體OD600,并以在96孔板的小孔內(nèi)抑制細菌生長的最低果膠水解物濃度為最小抑菌濃度。以加入滅活PGB的果膠溶液為對照。

1.2.6 總抗氧化活性分析 采用Fe3+還原法對果膠水解產(chǎn)物的總抗氧化活性進行分析[17]。在37 ℃時,每分鐘每毫升提取液使反應(yīng)體系的吸光值增加0.01為1個總抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)單位(U/mL)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

相關(guān)實驗均設(shè)置三個平行實驗,數(shù)據(jù)分析及圖的繪制借助Origin 8.0軟件處理完成。采用軟件SAS 9.4進行方差分析(AVONA)。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚半乳糖醛酸酶PGB的酶學(xué)性質(zhì)

2.1.1 最適反應(yīng)溫度和pH 對酶活達到10790 U/mL的重組酶PGB進行研究，研究不同溫度或pH對重組酶PGB酶活的影響,結(jié)果見圖1。PGB的最適作用溫度為55 ℃,最適作用pH為5.0;在40～65 ℃之間或pH4.0～5.5之間有較好的酶活力,相對酶活力在80%以上。

圖1 聚半乳糖醛酸酶PGB最適作用溫度(a)和pH(b)Fig.1 The optimal temperature(a)and pH(b)of PGB

圖2 溫度(a)和pH(b)對聚半乳糖醛酸酶PGB穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of temperature(a) and pH(b)on the stability of PGB

2.1.2 溫度和pH穩(wěn)定性 分別將重組酶PGB在不同溫度或pH條件下維持一定時間后,測定殘余酶活,研究其對酶的穩(wěn)定性的影響,結(jié)果見圖2。由圖2可知,PGB在40、50和60 ℃下保溫2 h,其相對酶活力分別保存72.7%、53.8%、43.7%;在70 ℃、80 ℃條件下孵育2 h后,殘留酶活分別為40%和20%左右;在pH4.0～5.5下處理1 h后酶活仍能保持80%以上,在pH小于2.5或大于7.0條件下處理1 h后酶活力降到40%以下。

2.1.3 金屬離子對重組酶PGB活性的影響 在酶促反應(yīng)中加入不同的金屬離子(終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L),研究其對PGB酶活性的影響,結(jié)果見圖3。Cu2+和Mg2+對其活性有不同程度的促進作用,其中5 mmol/L Cu2+的促進作用高于1 mmol/L,而1 mmol/L Mg2+的促進作用比5 mmol/L強,這可能是因為高濃度的Mg2+又會導(dǎo)致蛋白的變性而使酶活性喪失。1 mmol/L和5 mmol/L的K+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Fe3+和Fe2+等對其的活性均有不同程度的抑制作用。

圖3 金屬離子對聚半乳糖醛酸酶酶PGB活性的影響Fig.3 Effects of metal ions on the enzymatic activity of PGB

2.1.4 酶促動力學(xué)參數(shù) 固定PGB的添加量(5 U/mL),以不同濃度(4、6、8和10 mg/mL)低酯果膠溶液為底物,測定酶反應(yīng)速度。采用雙倒數(shù)作圖法,繪制PGB水解果膠的動力學(xué)曲線,結(jié)果如圖4所示。經(jīng)過計算,求得PGB的Km值為0.756 mg/mL,Vmax為9.225 mg/(mL·min)。

圖4 雙倒數(shù)曲線確定PGB的動力學(xué)參數(shù)Fig.4 Determination of kinetic parameters of PGB by Lineweaver-Burk plot

2.2 果膠酶解物的組成分析

在55 ℃、pH5.0條件下,加入5 U/mL PGB作用于10 mg/mL低酯果膠,果膠被水解生成聚合度較小的寡聚物,并利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)對水解產(chǎn)物進行分析。結(jié)果表明,經(jīng)PGB作用后的果膠水解物是一定量的半乳糖醛酸單體和聚合度2～4為主的寡聚半乳糖醛酸(圖5)。經(jīng)計算,水解產(chǎn)物中各組分含量比為(GalA)1∶(GalA)2∶(GalA)3∶(GalA)4=30∶38∶24∶3.5。與Parenicová L[18]報道的PgaB的酶解相比,本文中酶解的底物是果膠,組成較之使用的聚半乳糖醛酸復(fù)雜,且水解產(chǎn)物中半乳糖醛酸聚合度1～3的含量較之有大幅度提高。據(jù)報道,當(dāng)寡聚半乳糖醛酸的聚合度為3或更小時,其抑制有害菌生長、調(diào)整腸道菌群平衡等功能會顯著增強[19]。

圖5 HPAEC-PAD分析果膠酶解液的組成Fig.5 Analysis of pectin hydrolyzate composition by HPAEC-PAD注:Ⅰ:寡聚半乳糖醛酸標(biāo)品;Ⅱ:果膠水解產(chǎn)物。每個峰上方的數(shù)字代表半乳糖醛酸的聚合度。

2.3 寡聚半乳糖醛酸的生物學(xué)活性

抑菌作用分析:經(jīng)PGB水解的果膠水解液的抑菌效果如圖6a所示。重組酶PGB水解果膠的產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌抑菌效果明顯,抑菌圈直徑為12 mm。果膠水解液經(jīng)過倍比稀釋的抑菌效果見圖6b,確定經(jīng)過12次倍比稀釋后的果膠酶解液濃度為最低抑菌濃度(MIC),經(jīng)計算為0.64 mg/L。本研究獲得的果膠水解物對金黃色葡萄球菌的抑菌直徑大于李大峰等[20]獲得的果膠水解液對該菌的抑菌直徑(8.0～9.7 mm);MIC也小于其研究結(jié)果(3.75～7.5 g/L)。

圖6 寡聚半乳糖醛酸的抑菌活性Fig.6 Antimicrobial activity of oligogalacturonic acid注:a圖為寡聚半乳糖醛酸對金黃色葡萄球菌生長抑制圖,A:滅活PGB作用的果膠溶液,B:果膠水解產(chǎn)物。b圖為對果膠酶解液的倍比稀釋次數(shù)對應(yīng)的菌體生長情況。

抗氧化活性分析:采用Fe3+還原法對果膠酶解液的總抗氧化活性進行測定。不同濃度的果膠酶解液抗氧化能力測定結(jié)果見圖7。最適條件下果膠酶作用得到的酶解液有一定的抗氧化能力,且抗氧化能力隨濃度的增大而增大。在果膠酶解液濃度為0.25 mg/mL時,其總抗氧化活性(T-AOC)達到最大,為6.125 U/mL。該果膠水解液抗氧化活性顯著,可用于具有增強機體抗氧化活性、延緩衰老的功能性食品、保健品、化妝品的開發(fā)。

圖7 寡聚半乳糖醛酸的總抗氧化能力Fig.7 Total antioxidant capacity (T-AOC)of oligogalacturonic acid

3 結(jié)論

寡聚半乳糖醛酸有良好的生物學(xué)活性,但其復(fù)雜的制備工藝限制了其應(yīng)用。本研究初步解析了黑曲霉聚半乳糖醛酸酶PGB的基本酶學(xué)性質(zhì),包括最適反應(yīng)pH和溫度、pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性、金屬離子對酶活的影響以及動力學(xué)常數(shù)等。利用重組酶PGB對低酯果膠進行酶解,得到了聚合度以2～4為主的寡聚半乳糖醛酸。生物學(xué)活性的研究表明,該寡聚半乳糖醛酸能較好地抑制金黃色葡萄球菌的生長,且具有較高的抗氧化能力,這為其作為防腐劑、抗氧化添加劑等應(yīng)用于食品和化妝品行業(yè)提供了有效的理論基礎(chǔ)和科學(xué)根據(jù)。

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歡迎訂閱《食品工業(yè)科技》

BiochemicalcharacterizationoftherecombinantpolygalacturonasePGBandtheactivityanalysisofitsenzymatichydrolysisproduct

CHENXin-ran1,HUANGYong-sheng2,TIANKang-ming1,2 *,JINPeng1,DONGZi-xing1,LIUXiao-guang1,LUFu-ping2,WANGZheng-xiang1,2

(1.Department of Biochemical Engineering,College of Chemical Engineeringand Materials Science,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China;2.Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

To analyze the enzymatic properties of recombinant polygalacturonase PGB and to study the compositions and biological activities of pectin hydrolysate prepared by PGB. Polygalacturonase was prepared by shake flask fermentation and its enzymatic properties were investigated. Pectin was hydrolyzed by PGB under optimum conditions,followed by investigation of its compositions,and antioxidant and antibacterial activities. At the shake flask fermentation level,the activity of PGB reached 10790 U/mL. Its optimum temperature and pH was 55 ℃ and 5.0,respectively. And it was quite stable at 40 ℃ or pH4.0～6.0. Mg2+and Cu2+enhanced its activity,while K+,Ca2+,Zn2+,Mn2+,Co2+,Fe3+and Fe2+had different inhibitory effects on its activity. The Kmand Vmaxof PGB toward low-ester pectin was determined to be 0.756 mg/mL and 9.225 mg/(mL·min). After hydrolyzed by PGB,pectin hydrolysate was identified as galacturonic acid and oligogalacturonic acid with a polymerization degree of 2 to 4 by high performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detector(HPAEC-PAD). This oligomer significantly inhibited the growth of Staphylococcus aureus,and its minimum inhibitory concentration and antioxidant activity was 0.64 mg/mL and 6.125 U/mL,respectively.

polygalacturonase;biochemical characterization;pectin;oligogalacturonic acid

2017-05-05

諶新然(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：酶工程與技術(shù)，E-mail:1243720808@qq.com。

*通訊作者:田康明(1985-)，男，博士，講師，研究方向：酶制劑的應(yīng)用及新材料單體的制造，E-mail:jinantkm@163.com。

TS245.9

A

1002-0306(2017)23-0119-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.024