三疣梭子蟹多克隆抗體與4種經(jīng)濟蟹類血細胞交叉反應的研究

蔡 鑫，鄧 燈，王 穎，王文琪

( 1.青島農(nóng)業(yè)大學 海洋科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學 合作社學院，山東 青島 266109 )

三疣梭子蟹多克隆抗體與4種經(jīng)濟蟹類血細胞交叉反應的研究

蔡 鑫1，鄧 燈2，王 穎1，王文琪1

( 1.青島農(nóng)業(yè)大學 海洋科學與工程學院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學 合作社學院，山東 青島 266109 )

采用激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)、免疫印跡技術(shù)和流式細胞術(shù)3種方法對鼠抗三疣梭子蟹血細胞多克隆抗體與黃道蟹、日本蟳、中華絨螯蟹、勘察加帝王蟹血細胞的免疫交叉反應進行分析。激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果表明，該抗體與黃道蟹、日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹血細胞均發(fā)生了免疫交叉反應，且發(fā)生反應的抗原決定簇均位于細胞膜上；流式細胞術(shù)測定該抗體與黃道蟹顆粒血細胞和透明血細胞交叉反應陽性率最高，分別為99.45%、98%，與中華絨螯蟹顆粒血細胞和透明血細胞交叉反應陽性率最低，陽性率分別為81.34%、78.56%；免疫印跡結(jié)果顯示該抗體與日本蟳血細胞結(jié)合的蛋白分子量是80、38.5 ku；與勘察加帝王蟹血細胞結(jié)合的蛋白分子量是80、93 ku；與中華絨螯蟹血細胞結(jié)合的蛋白分子量是82、41、30 ku；與黃道蟹血細胞結(jié)合的蛋白分子量是70、43 ku。

三疣梭子蟹;多克隆抗體;交叉反應

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)、黃道蟹(Cancermagister)、日本蟳(Charybdisjaponica)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、勘察加帝王蟹(Paralithodescamtschaticus)均屬于甲殼類，因味道鮮美而深受大眾喜愛[1-2]，具有較高的經(jīng)濟價值[3]，但近年來隨著工廠集約化養(yǎng)殖規(guī)模擴大，各種疾病大規(guī)模爆發(fā)[4]。由于甲殼類動物缺乏適應性免疫，主要依靠非特異性免疫抵抗病原體，而參與非特異性免疫的細胞主要為血細胞，可通過吞噬、包埋、傷口修復、聚集、增生等方式消滅入侵的病原體[5-7]。目前甲殼類血細胞分類尚無統(tǒng)一標準，其分類存在爭議，多數(shù)學者根據(jù)形態(tài)學特點及多種染色法，將甲殼類血細胞分為3類，即透明血細胞、半顆粒血細胞和顆粒血細胞[8-9]。由于流式細胞術(shù)可精確判斷血細胞大小及顆粒度，目前采用該技術(shù)對甲殼類動物血細胞分類的研究逐漸增多[9-12]。交叉反應是指不同抗原分子上有相同或相似的抗原決定簇，一種抗體可以與兩種或兩種以上的抗原發(fā)生反應，其本質(zhì)是抗原決定簇與抗體的特異性結(jié)合[13-14]。多克隆抗體因具有易獲得、穩(wěn)定性好、效價高等優(yōu)點，成為疾病診斷、疫苗研制等研究領(lǐng)域的重要工具[15-17]。目前已有學者利用抗體研究甲殼類血細胞間的交叉反應[18-20]，但是利用多克隆抗體分析日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹和黃道蟹血細胞之間的免疫交叉反應未見報道，筆者在制備鼠抗三疣梭子蟹血細胞多克隆抗體的基礎(chǔ)上，應用激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)、免疫印跡技術(shù)分析了該抗體與4種蟹類血細胞的免疫交叉反應情況，并利用流式細胞術(shù)進一步定量免疫交叉反應的比率，以期為蟹類血細胞分類研究進一步積累資料，提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

三疣梭子蟹、黃道蟹、日本蟳、中華絨螯蟹、勘察加帝王蟹均購自青島水產(chǎn)批發(fā)市場；Wistar大鼠購于青島動物檢疫監(jiān)督所。

異硫氰酸熒光素標記羊抗大鼠IgG、堿性磷酸酶標記羊抗大鼠IgG，均購自Sigma公司；5-溴-4-氯-3-吲哚—磷酸、氯化硝基四氮唑藍、硝化纖維膜均購自生工生物工程(上海)股份公司。

1.2 方法

1.2.1 血細胞制備

購買健康無病、肢體健全的5種蟹在條件控制為充氧24 h、20 ℃的水循環(huán)系統(tǒng)中暫養(yǎng)2 d，用無菌注射器從游泳足基部軟膜抽取血淋巴，置于4 ℃預冷的抗凝劑[21](450 mmol/L NaCl，10 mmol/L KCl，10 mmol/L EDTA，10 mmol/L HEPES，pH 7.3)，以1∶1比例混合。4 ℃，1000 r/min離心5 min，去上清液，用磷酸鹽緩沖液重懸血細胞，重復3次，調(diào)整血細胞密度至107個/mL備用。

1.2.2 三疣梭子蟹多克隆抗體制備及純化

采用文獻[22]描述的方法進行免疫，取1 mL三疣梭子蟹血細胞懸液腹腔免疫大鼠，兩周后進行二次免疫，以后每隔一周進行一次加強免疫，第四次免疫結(jié)束后3 d，心臟取血，4 ℃自然沉降12 h，2000 r/min離心10 min，取上層血清。采用辛酸—硫酸銨法對血清進行純化，分裝后-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察交叉反應

調(diào)整血細胞密度為107個/mL，20 μL滴片，室溫自然沉降5 h后用含0.5% Triton的磷酸鹽緩沖液浸洗10 min，而后磷酸鹽緩沖液洗5 min；10%山羊血清的磷酸鹽緩沖液，室溫封閉45 min；滴加鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗50 μL(1∶256)，37 ℃濕盒中孵育1 h，然后用含0.05% Tween20的磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min；加50 μL(1∶3000)異硫氰酸熒光素標記羊抗大鼠IgG，37 ℃濕盒孵育1 h，而后磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色5 min，滴加防淬滅劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照，并用Image Pro Plus分析熒光強度。

1.2.4 免疫印跡技術(shù)分析抗原決定簇分子量

取10 μL制備好的血細胞與5 μL示蹤染料混合，100 ℃水浴5 min后進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，5%濃縮膠恒流30 mA，12%分離膠60 mA，示蹤染料到達最底端時結(jié)束電泳；一塊膠用考馬斯亮藍R250染液染色，染色結(jié)束后進行脫色并用凝膠成像系統(tǒng)進行拍照；同時制備的另一塊膠與硝化纖維膜進行“三明治”電轉(zhuǎn)膜，4 ℃ 200 mA恒流，轉(zhuǎn)移5 h。結(jié)束后將硝化纖維膜置于含3%牛血清蛋白的磷酸鹽緩沖液中37 ℃封閉1 h；加鼠抗三疣梭子蟹血細胞多克隆抗體 37 ℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5 min；加堿性磷酸酶標記的羊抗大鼠IgG，37 ℃濕盒中孵育1 h，結(jié)束后磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次5 min。5-溴-4-氯-3-吲哚—磷酸—氯化硝基四氮唑藍底物發(fā)色15 min，加終止液終止反應，拍照。

1.2.5 流式細胞術(shù)測定交叉反應陽性率

取200 μL制備好的血細胞加鼠抗三疣梭子蟹血細胞多克隆抗體37 ℃振蕩孵育1 h，1500 r/min離心5 min，棄上清液，磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，重復3次。加異硫氰酸熒光素標記的羊抗大鼠IgG，37 ℃振蕩孵育1 h(陰性對照只加入異硫氰酸熒光素標記的羊抗大鼠IgG孵育)，1500 r/min離心5 min，去上清液，而后磷酸鹽緩沖液重懸沉淀，重復3次，調(diào)整細胞密度至107個/mL。流式細胞儀檢測，以前向角散射為橫坐標，側(cè)向角散射為縱坐標，生成等高圖，并根據(jù)細胞群聚集程度強弱對血細胞進行分類，Win MDI 2.9軟件分析結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察交叉反應結(jié)果

結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡觀察結(jié)果及細胞質(zhì)內(nèi)有無顆粒，將日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹、黃道蟹血細胞分為兩大類，即顆粒血細胞和透明血細胞(圖1a3～d3)。細胞經(jīng)4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色后細胞核為藍色(圖1a～d)，鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與4種蟹子血細胞均發(fā)生交叉反應(圖1a1～d1)，點狀熒光信號在血細胞細胞膜上呈環(huán)狀密集分布，其中該抗體與黃道蟹血細胞交叉反應的陽性信號最強烈(圖1d2)，熒光強度整體處于最高水平(圖1d4)；與日本蟳和勘察加帝王蟹血細胞交叉反應的陽性信號比較強烈(圖1a2,b2)，熒光強度整體處于相對較高水平(圖1a4,b4)；與中華絨螯蟹血細胞交叉反應的陽性信號最弱(圖1c2)，熒光強度整體較低(圖1c4)。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察鼠抗三疣梭子蟹血細胞多克隆抗體與4種蟹血細胞的免疫交叉反應(1)a～d 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚通道；a1～d1 異硫氰酸熒光素標記羊抗大鼠IgG通道；a2～d2 合并通道；a3～d3 光鏡、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚、異硫氰酸熒光素標記羊抗大鼠IgG通道；a4～d4 熒光強度.(2)a～a3 日本蟳血細胞；b～b3 勘察加帝王蟹血細胞；c～c3 中華絨螯蟹血細胞；d～d3 黃道蟹血細胞.

2.2 免疫印跡分析抗原決定簇分子量結(jié)果

電泳圖譜中，4種蟹血細胞蛋白條帶豐富。免疫印跡結(jié)果顯示鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與日本蟳血細胞交叉反應的蛋白條帶有2條，其分子量分別為80、38.5 ku；與勘察加帝王蟹交叉反應的蛋白條帶有2條，其分子量分別為90、80 ku；與中華絨螯蟹血細胞交叉反應的蛋白條帶有3條，其分子量分別為82、41、30 ku；與黃道蟹血細胞交叉反應的蛋白條帶有2條，分別為70、43 ku(圖2)。

圖2 電泳圖譜(a)和免疫印跡(b)分析交叉反應結(jié)果十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中各條帶分別為M marker、A 日本蟳、B帝王蟹、C中華絨螯蟹、D黃道蟹.免疫印跡中各條帶分別為M marker、a 日本蟳、b帝王蟹、c中華絨螯蟹、d黃道蟹.

2.3 流式細胞術(shù)檢測陽性率結(jié)果

根據(jù)前向角散射和側(cè)向角散射流式等高圖，將日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹血細胞分為兩類，即透明血細胞(紅色環(huán)形標記)和顆粒血細胞(深藍色環(huán)形標記)(圖3a～c)；將黃道蟹血細胞分為透明血細胞(紅色環(huán)形標記)，顆粒血細胞(深藍色環(huán)形標記)和半顆粒血細胞(青色環(huán)形標記)，3類(圖3d)。

圖4熒光直方圖中黑線為陰性對照，藍線為發(fā)生交叉反應的4種蟹顆粒血細胞，紅線為發(fā)生交叉反應的4種蟹透明血細胞，青色線則為黃道蟹半顆粒血細胞。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與黃道蟹發(fā)生交叉反應的陽性率最高，發(fā)生交叉反應的顆粒血細胞占總顆粒血細胞的99.45%、發(fā)生反應的透明血細胞占總透明血細胞的98%(圖4d1, d)；鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與中華絨螯蟹發(fā)生交叉反應的陽性率最低，其中發(fā)生交叉反應的顆粒血細胞占總顆粒血細胞的81.34%、發(fā)生交叉反應的透明血細胞占總透明血細胞的78.56%(圖4c1, c)。另外，根據(jù)流式細胞術(shù)結(jié)果可知該抗體與4種蟹血細胞發(fā)生交叉反應時顆粒血細胞的陽性率均高于透明血細胞(表1)。

圖3 流式細胞術(shù)檢測4種蟹血細胞等高圖 a 日本蟳、b 勘察加帝王蟹、c 中華絨螯蟹、d 黃道蟹.H為透明血細胞；SG為半顆粒血細胞；G為顆粒血細胞,下同.

圖4 鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與4種蟹血細胞發(fā)生交叉反應的熒光直方圖鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與透明血細胞發(fā)生交叉反應陽性率：a 日本蟳、b 勘察加帝王蟹、c 中華絨螯蟹、d 黃道蟹.鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與顆粒血細胞發(fā)生交叉反應陽性率：a1 日本蟳、b1 勘察加帝王蟹、c1 中華絨螯蟹、d1 黃道蟹.鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與半顆粒細胞發(fā)生交叉反應陽性率：d2黃道蟹.N代表陰性，為黑色線；紅線為與鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗發(fā)生陽性交叉反應的透明血細胞；藍色線為與鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗發(fā)生陽性交叉反應的顆粒血細胞.

表1 鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與4種蟹的細胞亞群交叉反應陽性率 %

3 討 論

利用激光共聚焦掃描顯微鏡檢測鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與4種蟹類血細胞的交叉反應情況，發(fā)現(xiàn)4種蟹類血細胞的細胞膜上均有陽性信號，激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)能精確地、高靈敏度地探測細胞熒光，通過激光斷層掃描，可以反映出從亞細胞器到離子水平的形態(tài)學方面結(jié)構(gòu)、同時借助其良好的橫向和縱向分辨率，使樣本的二維圖像非常清晰[23-24]，本試驗采用該技術(shù)對鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗特異性結(jié)合的抗原決定簇進行了準確的定性和細胞定位分析。隨后采用了免疫印跡技術(shù)尋找含有共同抗原決定簇的血細胞蛋白的分子量，該方法具有特異性強、靈敏性高的優(yōu)點[17]，采用該方法確定了4種蟹類血細胞與鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗發(fā)生特異性結(jié)合的血細胞蛋白多肽的分子量。在此基礎(chǔ)上為進一步明確發(fā)生交叉反應的血細胞種類及比率，采用流式細胞術(shù)對4種蟹類血細胞進行分類并檢測交叉反應比例，流式細胞術(shù)可檢測細胞大小及內(nèi)部顆粒，在單細胞水平上短時間內(nèi)對群體細胞進行檢測分析，同時在分類收集某一亞群細胞時，能避免主觀性因素造成的不確定性，使統(tǒng)計數(shù)據(jù)更為準確[25-26]。由流式細胞術(shù)結(jié)果可知，日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹血細胞分為顆粒血細胞、透明血細胞兩類，而黃道蟹血細胞則分為顆粒血細胞、半顆粒血細胞和透明血細胞3類，且鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與黃道蟹發(fā)生交叉反應的陽性率最高，與中華絨螯蟹的陽性率最低。

Roulston等[27]利用流式細胞術(shù)與Percoll離心將蜘蛛蟹(Hyasaraneus)血細胞分為透明前體血細胞、透明血細胞、半顆粒血細胞及顆粒血細胞4類；王穎等[21]利用流式細胞術(shù)將三疣梭子蟹血細胞分為顆粒血細胞和透明血細胞兩類；Battison等[28]根據(jù)形態(tài)學將美國龍蝦(Homarusamericanus)血細胞分為11類。盡管目前對甲殼類血細胞分類標準尚不明確，但兩大類血細胞已確定，即細胞質(zhì)內(nèi)含顆粒的顆粒血細胞和不含顆粒的透明血細胞[9]，本文由激光共聚焦掃描顯微鏡結(jié)果可將4種蟹血細胞均分為顆粒血細胞和透明血細胞兩類，流式細胞術(shù)結(jié)果也將日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹血細胞分為兩類。Oliver等[10]利用流式細胞術(shù)將凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)分為顆粒血細胞和透明血細胞兩類；William等[29]將岸蟹(Carcinusmaenas)血細胞也分為顆粒血細胞和透明血細胞兩類。這些研究結(jié)果與本文結(jié)論類似。但本研究應用流式細胞術(shù)卻將黃道蟹血細胞分為的顆粒血細胞、半顆粒血細胞和透明血細胞3類，Denis等[8,11-12]應用流式細胞術(shù)將印度淡水蟹(Paratelphusajacquemontii)、藍蟹(Callinectessapidus)和羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)血細胞也分為顆粒血細胞、半顆粒血細胞和透明血細胞3類。本試驗利用流式細胞術(shù)與激光共聚焦掃描顯微鏡技術(shù)針對蟹類血細胞分類得出不同結(jié)果，Xue等[30]指出顯微觀察不利于血淋巴細胞亞群的定量功能評估，而流式細胞術(shù)可以準確、快速和定量分析血細胞形態(tài)學及相關(guān)免疫功能，為研究甲殼類血細胞提供一種更為準確的方法。因此本研究以流式細胞術(shù)結(jié)果為主。

激光共聚焦掃描顯微鏡、免疫印跡與流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與4種蟹血細胞均發(fā)生交叉反應，說明三疣梭子蟹血細胞與該4種蟹血細胞上存在共同抗原決定簇；激光共聚焦掃描顯微鏡觀察鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與黃道蟹血細胞免疫交叉反應陽性信號最強，且流式細胞術(shù)檢測鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與黃道蟹血細胞交叉反應陽性率最高，Kumar等[18]利用抗鋸緣青蟹(Scyllaserrata)血細胞抗體檢測其與紫螯青蟹(S.tranquebarica)、斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)、羅氏沼蝦等甲殼類血細胞交叉反應時，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系近的物種，其交叉反應的免疫熒光信號強；Van de Braak等[19]利用斑節(jié)對蝦血細胞單抗分析斑節(jié)對蝦血細胞與羅氏沼蝦、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)等甲殼類血細胞交叉反應時，發(fā)現(xiàn)該抗體與羅氏沼蝦血細胞具有較高的陽性熒光強度，其認為是由于該兩種對蝦親緣關(guān)系較近，抗原決定簇具有更好的保守性。由此推測三疣梭子蟹血細胞與黃道蟹血細胞的抗原決定簇更為接近，即三疣梭子蟹與黃道蟹親緣關(guān)系較其他3種蟹親緣關(guān)系更近。

流式細胞術(shù)檢測鼠抗三疣梭子蟹血細胞多抗與4種蟹血細胞交叉反應時，發(fā)現(xiàn)4種蟹的顆粒血細胞陽性率均高于透明血細胞陽性率。Kumar等[18,20-21]應用抗體分析甲殼類血細胞交叉反應，也得到同樣的結(jié)果。究其原因為顆粒血細胞相比透明血細胞，其細胞中含有較多免疫因子，如酚氧化酶原、細胞黏附蛋白、抗菌肽等，其分子結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象更復雜，免疫原性更強[1,6]，從而刺激機體產(chǎn)生更多針對顆粒血細胞的抗體。

本研究發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹血細胞抗體與日本蟳、勘察加帝王蟹、中華絨螯蟹、黃道蟹均發(fā)生交叉反應，說明三疣梭子蟹血細胞與4種蟹血細胞細胞膜上存在共同抗原決定簇，從分子水平為蟹類血細胞發(fā)生與分化的研究提供試驗依據(jù)，同時對梳理三疣梭子蟹與4種蟹的親緣關(guān)系有一定參考意義。

[1] S?derh?ll K. Invertebrate Immunity[M].New York: Springer US, 2010:239-259.

[2] Jiang K, Zhang F, Pi Y, et al. Amino acid, fatty acid, and metal compositions in edible parts of three cultured economic crabs:Scyllaparamamosain,Portunustrituberculatus, andEriocheirsinensis[J]. J Aquat Food Prod T, 2014,23(1):73-86.

[3] 洪宇航, 楊筱珍, 張金彪, 等. 中華絨螯蟹血細胞原代培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].動物學雜志,2012,47(2):52-58.

[4] 王曉璐. 凡納濱對蝦抗脂多糖因子ALF-AVK基因的克隆及其特性研究[D].青島:中國海洋大學, 2013.

[5] Lv S, Xu J, Zhao J, et al. Classification and phagocytosis of circulating haemocytes in Chinese mitten crab (Eriocheirsinensis)and the effect of extrinsic stimulation on circulating haemocytes in vivo[J]. Fish & Shellfish Immun, 2014,39(2):415-422.

[6] Johansson M W, Keyser P, Sritunyalucksana K, et al. Crustacean haemocytes and haematopoiesis[J]. Aquaculture,2000,191(1):45-52.

[7] Seksan M, Piyachat S, Tanatchaporn U, et al. Characterization of the circulating hemocytes in mud crab (Scyllaolivacea) revealed phenoloxidase activity[J]. Dev Comp Immunol, 2013, 44(1):116-123.

[8] Denis M, Thayappan K, Ramasamy S M, et al. Opsonic function of sialic acid specific lectin in freshwater crabParatelphusajacquemontii[J]. Springer Plus, 2014, 4(1):1-15.

[9] Matozzo V, Marin M G. First cytochemical study of haemocytes from the crabCarcinusaestuarii(Crustacea, Decapoda)[J]. Eur J Histochem, 2010,54(1): 44-49.

[10] Oliver J D,Dusty Loy J,Parikh G, et al. Comparative analysis of hemocyte phagocytosis between six species of arthropods as measured by flow cytometry[J]. J Invertebr Pathol, 2011, 108(2):126-130.

[11] Alvarez J V, Chung J S.The involvement of hemocyte prophenoloxidase in the shell-hardening process of the blue crab,Callinectessapidus[J]. Plos One, 2015,10(9):e0136916.

[12] Du J, Zhu H, Ren Q, et al. Flow cytometry studies on theMacrobrachiumrosenbergiihemocytes sub-populations and immune responses to novel pathogen spiroplasma MR-1008[J]. Fish & Shellfish Immun, 2012,33(4):795-800.

[13] 王欣欣, 繩秀珍, 戰(zhàn)文斌. 降低交叉反應的魚類病原菌檢測抗體芯片初步研究[J]. 海洋湖沼通報, 2013(1):23-28.

[14] 陳路, 張新紅. 醫(yī)學免疫學與病原生物學[M]. 北京：化學工業(yè)出版社, 2013:8-9.

[15] 李華, 李重實, 李明, 等. 抗鯰愛德華氏菌多克隆抗體的制備及特性分析[J]. 中國海洋大學學報:自然科學版, 2010,40(10):29-32.

[16] 竇勇, 寧喜斌. 副溶血弧菌多克隆抗體的制備及其特性分析[J]. 食品與生物技術(shù)學報, 2007,26(3):85-89.

[17] 戰(zhàn)文斌, 齊繼光, 劉洪明, 等. 水產(chǎn)動物6種主要病原菌與抗血清的免疫交叉反應[J]. 中國水產(chǎn)科學, 2004,11(1):14-19.

[18] Kumar B,Deepika A,Makesh M, et al. Production and characterization of monoclonal antibodies to the hemocytes of mud crab,Scyllaserrata[J].J Invertebr Pathol, 2012, 111(1):86-89.

[19] Van de Braak C B, Botterblom M H, Taverne N, et al. Monoclonal antibodies against haemocyte molecules ofPenaeusmonodonshrimp react with haemolymph components of other crustaceans and disparate taxa[J].Dev Comp Immunol,2001,25(4):279-283.

[20] Winotaphan P,Sithigorngul P,Muenpol O, et al. Monoclonal antibodies specific to haemocytes of black tiger prawnPenaeusmonodon[J].Fish & Shellfish Immun, 2005,18(3):189-198.

[21] 王穎, 王文琪, 程順峰. 三疣梭子蟹顆粒血細胞單克隆抗體的研制及7種甲殼類動物血細胞的交叉反應研究[J]. 水產(chǎn)學報, 2015, 39(6):810-817.

[22] 陳騁. 半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)免疫相關(guān)基因CsG3BP的克隆、表達及功能研究[D]. 青島:中國科學院研究生院海洋研究所, 2013.

[23] 韓卓, 陳曉燕, 馬道榮, 等. 激光掃描共聚焦顯微鏡實驗技術(shù)與應用[J]. 科技信息, 2009(19):27-28.

[24] 夏宏林, 何穎, 鄒澤紅, 等. 蘋果過敏原Mal d 4蛋白抗原表位預測及交叉反應分析[J]. 中國免疫學雜志, 2012,28(1):57-61.

[25] 王有基, 林江興, 李瓊珍, 等. 翡翠貽貝血淋巴細胞亞群鑒定及相關(guān)免疫功能的流式細胞分析[J]. 水產(chǎn)學報, 2014, 38(3):385-399.

[26] 吳曉娜, 蔣紅兵. 流式細胞術(shù)的工作原理及其臨床應用[J]. 中國醫(yī)療設(shè)備, 2011,26(3):91-93.

[27] Roulston C, Smith V J. Isolation and in vitro characterisation of prohaemocytes from the spider crab,Hyasaraneus(L.)[J]. Dev Comp Immunol, 2010,35(5):537-544.

[28] Battison A, Cawthorn R, Horney B. Classification ofHomarusamericanushemocytes and the use of differential hemocytes counts in lobsters inflected withAerococcusviridansvar. homari(Gaffkemia)[J]. J Invertebr Pathol, 2003,84(3):177-197.

[29] Williams A J, Lutz P L. Blood cell types inCarcinusmaenasand their physiological role[J]. J Mar Biol Assoc UK, 1975,55(3):671-674.

[30] Xue Q G, Renault T, Chilmonczyk S. Flow cytometric assessment of haemocyte sub-populations in the European flat oyster,Ostreaedulis, haemolymph[J]. Fish & Shellfish Immunol,2001, 11(7):557-567．

AntigenicCross-reactivityofCrustaceanHemocytesUsingPolyclonalAntibodiesofSwimmingCrabPortunustrituberculatus

CAI Xin1, DENG Deng2, WANG Ying1, WANG Wenqi1

( 1. College of Marine Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;2. College of Cooperatives Institute, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China )

In order to research the role of hemocytes in immune mechanism of crustaceans, polyclonal antibodies against hemocytes of swimming crabPortunustrituberculatuswere raised, and laser scanning confocal microscopy (LSCM), Western-blotting and Flow Cytometry (FCM) were used to detect the cross-reaction between antisera of swimming crab and 4 species crustacean (Cancermagister,Charybdisjaponic,Eriocheirsinensis,Paralithodescamtschaticus)hemocytes.Two types of hemocytes inC.japonic,E.sinensi, andP.camtschaticusand three types of hemocytes inC.magisterwere distincted by FCM. The strongest intensity of immuno-reactivity was inC.magisterby LSCM, and the maximal positive rate was that antisera reacted with hemocytes ofC.magisterdetected by FCM, with 99.45% of granulocytes and 98% of hyalinocytes. The results indicated antigenic similarities were found among the two species. Thus,C.magisterbeing more closely related species to swimming crab exhibited many immuno-reactions, while the other species with a phylogenetically longer distance to swimming crab did not. The immuno-reactive epitopes inC.magisterand swimming crab on the hemocyte membranes and in the plasma seemed to be well conserved, however, they are not necessarily the same, with similar functions. There was higher positive rate in granulocytes (81.34%) than in hyalinocytes (78.56%) detected by FCM in four species. The findings indicate that antigenic similarities exist among the four crustaceans species,C.magisterbeing more closely related species to swimming crab.

Portunustrituberculatus; polyclonal antibody; cross-reactivity

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隨著《水產(chǎn)科學》雜志影響力的不斷提升，論文來稿量亦不斷增多，為更快的傳播漁業(yè)科技信息，縮短論文出版時滯，滿足科研人員的發(fā)表科研論文需求，經(jīng)遼寧省新聞出版廣電局批準，《水產(chǎn)科學》雜志由2017年第3期始，頁碼增至144頁。特此通知。歡迎廣大讀者踴躍投稿。

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.008

S917

A

1003-1111(2017)03-0303-08

2016-06-16；

2016-08-31.

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系蝦蟹類創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-15-011-06)；山東省“兩區(qū)”建設(shè)專項.

蔡鑫(1990—)，女，碩士；研究方向：水產(chǎn)病害及免疫學.E-mail：caixin0105@163.com.通訊作者：王文琪(1969—)，女，教授，碩士生導師；研究方向：水產(chǎn)疾病防治.E-mail：wenqi31@163.com.

(本刊編輯部)