仿刺參纖維膠凝蛋白基因的分子特征及表達分析

陳 仲，楊愛馥，王 擺，蔣經(jīng)偉，高 杉，董 穎，周遵春

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院,遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

仿刺參纖維膠凝蛋白基因的分子特征及表達分析

陳 仲，楊愛馥，王 擺，蔣經(jīng)偉，高 杉，董 穎，周遵春

( 遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院,遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學重點實驗室，遼寧 大連 116023 )

纖維膠凝蛋白是非特異性免疫系統(tǒng)中的重要分子。通過轉錄組測序及cDNA末端快速克隆技術得到一條仿刺參纖維膠凝蛋白基因的全長cDNA序列，并將其編碼的蛋白命名為仿刺參纖維膠凝蛋白-1。獲得的基因cDNA全長為1951 bp，其中5′-末端非翻譯區(qū)為397 bp，3′-末端非翻譯區(qū)為666 bp，開放閱讀框為888 bp，編碼295個氨基酸，N端16個氨基酸為信號肽，信號肽后面有兩個G-X-Y重復序列，C端為纖維蛋白素原結構域。采用實時熒光定量PCR方法分析了仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參幼參不同組織及細菌脂多糖刺激后的時序表達規(guī)律，結果顯示仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參的腸道、呼吸樹、體腔細胞和體壁均有表達，且腸道的表達量最高；脂多糖刺激后，4種組織的仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因表達量均有變化，且以腸道和體壁表達量的變化最為顯著；此外，仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參4種組織中的表達量變化具有不同的時序性，表明仿刺參纖維膠凝蛋白-1可能在仿刺參免疫應答中起重要作用。

仿刺參；纖維膠凝蛋白；序列分析；基因表達；脂多糖刺激

纖維膠凝蛋白(ficolin)是一組存在于多種動物體內(nèi)，組織分布廣泛的寡聚蛋白，在非特異性免疫中發(fā)揮重要作用[1]。纖維膠凝蛋白最初是作為一種轉化生長β因子結合蛋白發(fā)現(xiàn)于豬子宮內(nèi)膜細胞上[2]，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種重要的纖維膠凝蛋白家族成員，證實是機體天然免疫中的關鍵分子[3]。纖維膠凝蛋白由膠原樣結構域和纖維蛋白素原結構域組成[1]，可以通過凝集素途徑激活補體系統(tǒng)，繼而形成C3轉化酶，形成攻膜復合體使細菌溶解，或者提高吞噬細胞對細菌的吞噬作用[4-5]。目前已有報道，纖維膠凝蛋白廣泛存在于兩棲動物[6]、爬行動物[7]、哺乳動物[8-9]等脊椎動物體內(nèi)，近年來信號小龍蝦(Pacifastacusleniusculus)[10]、真海鞘(Halocynthiaroretzi)[11]、近江牡蠣(Crassostreahongkongensis)[12]、文昌魚(Branchiostomafloridae)[13]、紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)等無脊椎動物和脊索動物體內(nèi)也陸續(xù)證明了纖維膠凝蛋白的存在，仿刺參纖維膠凝蛋白基因的克隆及表達規(guī)律的研究尚未見報道。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)屬棘皮動物門、海參綱。棘皮動物處于由無脊椎動物向脊椎動物開始分支進化的階段，所以棘皮動物是研究免疫系統(tǒng)進化的寶貴材料。仿刺參是我國北方重要的海產(chǎn)經(jīng)濟物種，但其養(yǎng)殖受到細菌性病害的嚴重影響，因此，研究仿刺參免疫的分子機制具有重要的現(xiàn)實意義。筆者通過仿刺參轉錄組測序得到了一條與其他物種纖維膠凝蛋白同源性較高的cDNA序列[14]，通過cDNA末端快速克隆技術得到該基因的全長cDNA序列，將其編碼的蛋白命名為仿刺參纖維膠凝蛋白-1，對其基因及蛋白結構特征進行了分析，并分析了其在仿刺參不同組織及脂多糖刺激前后的表達規(guī)律，為深入研究仿刺參免疫分子機制提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

仿刺參幼參來源于大連廣鹿島海域，規(guī)格為(10.0±0.5) g。鮮活樣品取回后于人工育苗池常規(guī)條件下暫養(yǎng)一周，暫養(yǎng)期間保持充氣。所用海水均經(jīng)過砂濾，水溫16～18 ℃，鹽度32，pH 7.8～8.2。

1.2 試驗方法

1.2.1 仿刺參纖維膠凝蛋白-1全長基因序列的擴增

通過轉錄組測序得到了一條與其他物種纖維膠凝蛋白同源性較高的cDNA序列[14]，使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit與Advantage 2 PCR Enzyme System 試劑盒(Clontech)進行5′和3′ 末端擴增，利用Primer Premier 6.0設計特異引物 5r-1和3r-1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見表1，通用引物UPM和巢式引物NUP為試劑盒中自帶引物。使用特異引物和UPM進行第1輪PCR，反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。以第1輪PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，用特異引物和NUP進行巢式PCR，條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測，利用 Agarose GEL DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0(TaKaRa)回收目的片段，連入克隆載體 pMD19-T，轉化到感受態(tài)細胞大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109，所獲得的陽性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定。測序結果與原序列進行拼接，獲得仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的cDNA 全長。

1.2.2 蛋白序列特征分析及分子進化分析

將仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的cDNA和蛋白序列與 GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫及蛋白數(shù)據(jù)庫做BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對分析。應用 ORF Finder 程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)確定正確的開放閱讀框并推導其編碼的氨基酸序列。用Simple Modular Architecture Reach Tool(SMART，http://smart.embl-heidelberg.de/)進行信號肽和蛋白結構域預測。使用Clustal X 2.0軟件進行多重序列比對[15]，采用MEGA 4.0的鄰接法構建系統(tǒng)進化樹，重復抽樣次數(shù)設為1000來計算各分支的置信程度。

1.2.3 脂多糖刺激

健康仿刺參幼參(約10 g)飼養(yǎng)于水族箱內(nèi)，2 d內(nèi)不投喂任何餌料，排空消化道內(nèi)食物，注射脂多糖500 μL(1 μg/μL)，對照組注射500 μL無菌海水，空白組(0 h)無任何注射。幼參注射脂多糖4、12、24、48、72 h后用飽和MgSO4麻醉，無菌海水沖洗后取腸道、呼吸樹、體腔細胞和體壁，各種組織分別取10個個體的混合樣，重復3次，投入液氮中迅速冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 總RNA提取

用RNAprep pure 動物組織總RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取仿刺參不同組織的總RNA，電泳檢測RNA的完整性，用Implen Nanophotometer核酸蛋白分析儀(德國) 檢測RNA的純度和濃度。

1.2.5 實時熒光定量PCR

取每個樣品的總RNA 900 ng用Prime-ScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa)進行反轉錄，反應體積及反應條件按照說明書進行。

實時熒光定量PCR采用SYBR Green Ⅰ染料法(SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit，TaKaRa)，在Mx 3000pTM熒光定量PCR儀(Stratagene，La Jolla，CA，USA)上進行。以Cytb基因作為內(nèi)參[16]，仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因和內(nèi)參基因的引物序列見表1。反應終體積20 μL：2×SYBR Green Master mix緩沖液10 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA樣品1 μL，引物各0.4 μmol/L。反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，40個循環(huán)，每個樣品設3個重復。

表1 PCR所用引物序列

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

相對表達水平通過 Relative Expression Software Tool 384 v.2軟件計算[17]。運用單因素方差分析和多次對比檢驗分析比較試驗組和對照組表達水平的差異性，P<0.05視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 仿刺參纖維膠凝蛋白-1序列分析

仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因cDNA序列全長為1951 bp，其中5′-末端非翻譯區(qū)為397 bp，3′-末端非翻譯區(qū)為666 bp，開放閱讀框為888 bp，編碼295個氨基酸，分子量為33.4 ku，理論等電點為4.62。利用SMART對仿刺參纖維膠凝蛋白-1結構進行分析，該蛋白N端16個氨基酸為信號肽，信號肽后面有2個G-X-Y重復序列，其中G為甘氨酸，X、Y為任意氨基酸。C端的纖維蛋白素原結構域位于79～290氨基酸之間(圖1)。

圖1 仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因cDNA及氨基酸序列分析仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因cDNA及其氨基酸序列，大寫字母和小寫字母分別表示開放閱讀框和非翻譯區(qū)；下劃線標注為信號肽；G-X-Y重復序列用雙下劃線標注；陰影標注為纖維蛋白素原結構域；方框標注為Ca2+結合位點；多聚腺苷酸信號(AATAAA)用黑體加斜體標注；poly A尾用黑體標注.

2.2 仿刺參纖維膠凝蛋白-1氨基酸序列的同源性分析

將仿刺參纖維膠凝蛋白-1的氨基酸序列輸入到NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中進行BLASTP比對，發(fā)現(xiàn)仿刺參纖維膠凝蛋白-1的氨基酸序列與鴨嘴海豆芽(Lingulaanatina)的ficolin-1序列相似度最高，為50%，其次是同為棘皮動物的紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)ficolin-1，序列相似度為48%。在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索纖維膠凝蛋白，選取不同進化地位的代表生物用于序列比對和進化分析，所選物種及NCBI登記號見表2。對不同物種纖維膠凝蛋白的纖維蛋白素原結構域進行序列比對，結果顯示包括仿刺參纖維膠凝蛋白-1在內(nèi)的各物種纖維膠凝蛋白的纖維蛋白素原結構域中均包含4個保守的半胱氨酸殘基和一個Ca2+結合位點，除毛首鞭蟲(Trichuristrichiura)以外，其他物種的Ca2+結合位點序列均為D-N-D(圖2)。

以表2中不同物種纖維膠凝蛋白氨基酸序列構建鄰接系統(tǒng)進化樹，基本符合物種的傳統(tǒng)分類進化關系，仿刺參處于低等無脊椎動物和脊索動物之間，與海膽親緣關系最近，這與諸多研究結果一致[18-20](圖3)。

表2 不同物種纖維膠凝蛋白的NCBI登記號

圖2 仿刺參纖維膠凝蛋白-1纖維蛋白素原結構域氨基酸序列與其他物種的同源性比對黑色背景代表保守區(qū)，灰色背景代表高度保守區(qū)；▼表示保守的半胱氨酸殘基；＊表示Ca2+結合位點.

圖3 纖維膠凝蛋白的鄰接系統(tǒng)進化樹

2.3 仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的組織表達

利用實時熒光定量PCR方法檢測仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在不同組織中的表達情況。仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在的腸道、呼吸樹、體腔細胞和體壁4種組織中均有表達，體腔細胞中的表達量最低，其他3種組織中的表達量均明顯高于體腔細胞。腸中的表達量最高，為體腔細胞中的7.5倍，其次為體壁，表達量為體腔細胞中的5.5倍(圖4)。

圖4 仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的組織表達分析＊表示該組織仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因表達量與體腔細胞存在顯著差異.

2.4 脂多糖刺激后仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參不同組織中的時序表達

利用實時熒光定量PCR方法研究了脂多糖刺激后仿刺參腸道、呼吸樹、體腔細胞和體壁4種組織中仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的時序表達情況，結果顯示仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在脂多糖刺激后4種組織中的表達規(guī)律存在差別(圖5)。首先在腸道中，仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因的表達顯著正調控，刺激組表達量在12 h即達到對照組的10倍，24 h達到了頂峰，為對照組的27倍，48 h開始下降，但仍顯著高于對照組，整體顯現(xiàn)出先升后降的趨勢。而在體壁中，仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因表達顯著負調控，刺激組表達量在48 h達到最低點，僅為對照組的0.1倍。在體腔細胞中，脂多糖刺激后4 h，刺激組的表達量相對于對照組即有一個顯著的升高，隨后開始下降，24 h和48 h刺激組的表達量明顯低于對照組，72 h刺激組的表達量再一次升高，達到對照組的2.5倍。在呼吸樹中，刺激組的表達量相對于對照組呈現(xiàn)出先升后降的趨勢，但與腸道不同的是，呼吸樹中刺激組的表達量僅在24 h顯著高于對照組(2.2倍)，其他時間點均顯著低于對照組。

圖5 脂多糖刺激后仿刺參纖維膠凝蛋白-1基因在仿刺參不同組織中的時序表達a. 體腔細胞；b. 體壁；c. 呼吸樹；d. 腸道.＊表示某時間點刺激組與對照組存在顯著差異.

3 討 論

纖維膠凝蛋白是在非特異性免疫中起到重要作用的蛋白因子[1]，纖維蛋白素原結構域是纖維膠凝蛋白識別并結合細菌表面糖基的結構域，與纖維膠凝蛋白結合的糖類配體都是病原微生物表面常見的結構成分，人L-ficolin可以識別傷寒桿菌(Salmonellatyphimurium)表面的糖結構，并能識別和結合革蘭氏陽性細菌如金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鏈球菌(Streptococcusagalactiae)的細胞壁成份磷壁酸[21-22]；H-ficolin能結合傷寒桿菌和明尼蘇達沙門氏菌(Salmonellaminnesota)的脂多糖[23]；仿刺參纖維膠凝蛋白-1的C端有一個纖維蛋白素原結構域，與其他物種該結構域比對結果顯示，仿刺參纖維膠凝蛋白-1具有保守的半胱氨酸殘基和Ca2+結合位點，推測仿刺參纖維膠凝蛋白-1可以像脊椎動物一樣行使識別并結合病原菌糖基的功能。在其他無脊椎動物中，信號小龍蝦纖維膠凝蛋白可凝集大腸桿菌、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)和金黃色葡萄球菌，并可以幫助機體清除注入血淋巴中的革蘭氏陰性菌[10]；近江牡蠣的重組纖維膠凝蛋白可在體外凝集大腸桿菌并增強對其吞噬作用[12]。在脊索動物海鞘體內(nèi)，纖維膠凝蛋白可識別并結合含N-乙酰氨基的多種糖類[11]。

脊椎動物纖維膠凝蛋白由膠原樣結構域和纖維蛋白素原結構域兩部分結構域組成，例如非洲爪蟾[6]、玉米錦蛇[7]、人[9]等，纖維膠凝蛋白與病原菌表面糖基結合后，通過膠原樣結構域結合甘露聚糖結合凝集素相關的絲氨酸蛋白酶，進一步通過凝集素途徑激活補體系統(tǒng)[4-5]。而牡蠣[12]、文昌魚[13]等無脊椎動物和脊索動物的纖維膠凝蛋白只有纖維蛋白素原結構域而不具有膠原樣結構域。仿刺參纖維膠凝蛋白-1 N端有2個G-X-Y重復序列，而脊椎動物纖維膠凝蛋白的膠原樣結構域是由多個G-X-Y重復序列組成，仿刺參纖維膠凝蛋白-1 N端的2個G-X-Y重復序列能否同膠原樣結構域行使相同的功能有待于進一步研究。

棘皮動物的先天免疫功能主要是由體腔液中的體腔細胞和免疫分子來完成，本試驗結果表明，在正常生長狀態(tài)下的仿刺參，其各種組織中均存在纖維膠凝蛋白-1基因的表達，腸道和體壁的表達量高于呼吸樹和體腔細胞。而在脂多糖刺激后，腸道和體壁中纖維膠凝蛋白-1的免疫應答較其他組織表現(xiàn)得更為活躍，原因可能是由于仿刺參攝食的食物內(nèi)含有大量的病原菌，而腸道組織直接與這些病原菌接觸；而體壁與海洋環(huán)境中的病原菌直接接觸，腸道組織和體壁是海參抵御外來病原的第一道防線，因而有免疫相關基因的高水平表達。經(jīng)脂多糖刺激后，仿刺參4種組織的纖維膠凝蛋白-1基因表達量均發(fā)生顯著變化，且存在不同的時序性，說明在4種組織中，仿刺參纖維膠凝蛋白-1均參與了仿刺參對病原菌的免疫應答過程。在其他海洋無脊椎動物中，牡蠣的血淋巴內(nèi)纖維膠凝蛋白基因表達量在鰻弧菌(Vibrioanguillarum)和溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)感染后均有顯著的升高，并呈現(xiàn)出先升后降的趨勢[12]，這說明其他海洋無脊椎動物與仿刺參相似，纖維膠凝蛋白均在機體對病原菌的免疫應答過程中起到重要作用。

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MolecularCharacterizationsandExpressionofFicolininSeaCucumberApostichopusjaponicus

CHEN Zhong, YANG Aifu, WANG Bai, JIANG Jingwei, GAO Shan, DONG Ying, ZHOU Zunchun

( Liaoning Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

We identified the cDNA sequence of ficolin gene from sea cucumber (Apostichopusjaponicus) through RNA-seq sequencing and RACE (rapid amplification of cDNA ends) technology, and the protein known as AjFCN had length of 1951 bp including a 397 bp 5′ untranslated region (UTR), a 666 bp 3′-UTR and an ORF of 888 bp encoding 295 amino acids. The AjFCN protein contained a typical signal peptide, two G-X-Y repetitive sequences and abrinogen-like domain (FBG). The relative expression of AjFCN gene was detected by the qRT-PCR in the intestine, respiratory tree, coelomocyte and body wall, with the maximal expression level in the intestine. After lipopolysaccharide (LPS) challenge, the expressions in intestine and body wall tissues were changed most dramatically. Furthermore, the relative expression levels of AjFCN gene in the four tissues showed different time-sequence patterns. The findings indicated that the AjFCN played an important role in the immune response of sea cucumber.

sea cucumber (Apostichopusjaponicus); ficolin; sequence analysis; gene expression; LPS challenge

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.007

Q786

A

1003-1111(2017)03-0296-07

2016-07-01；

2016-08-21.

遼寧省科技計劃項目(2014203006)；遼寧省海洋與漁業(yè)廳項目(201605)；大連市科技計劃項目(2013J21DW025).

陳仲(1980—)，男，工程師，碩士；研究方向：海洋生物技術.E-mail：ch_zhong@163.com. 通訊作者：周遵春(1967—)，男，研究員，博士；研究方向：海洋生物技術.E-mail：zunchunz@hotmail.com.