新生隱球菌性腦膜炎患者外周血Th1/Th2及相關(guān)T淋巴細(xì)胞水平變化及意義

黃煌 冼瑩 潘越峻 張扣興

(1.廣州市第八人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣州 510060；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣州 510630)

·論著·

新生隱球菌性腦膜炎患者外周血Th1/Th2及相關(guān)T淋巴細(xì)胞水平變化及意義

黃煌1冼瑩2潘越峻1張扣興2

(1.廣州市第八人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣州 510060；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣州 510630)

目的通過(guò)檢測(cè)新生隱球菌性腦膜炎患者外周血中Th1及Th2 類細(xì)胞及NKT細(xì)胞、T細(xì)胞的分布比例，從患者水平進(jìn)一步了解機(jī)體T輔助淋巴細(xì)胞及相關(guān)T淋巴細(xì)胞在新生隱球菌感染過(guò)程中的作用機(jī)制。方法收集新生隱球菌性腦膜炎/腦膜腦炎的16例患者 (HIV檢測(cè)陰性)及作為對(duì)照組的10例正常健康人外周血標(biāo)本，采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)標(biāo)本中Th1及Th2類細(xì)胞及NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞的在外周血T淋巴細(xì)胞中的分布比例，并采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析比較。結(jié)果隱腦患者 (接受誘導(dǎo)治療前)Th1細(xì)胞在CD4+T淋巴細(xì)胞中所占比例為 (13.093±4.618)%，低于正常對(duì)照組的比例 (19.582±4.949)%，而Th2細(xì)胞所占比例為 (1.769±0.865)%，高于正常對(duì)照組的比例 (0.584±0.202)%，差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；隱腦患者經(jīng)誘導(dǎo)治療好轉(zhuǎn)后Th1細(xì)胞在CD4+T淋巴細(xì)胞中所占比例為 (16.069±1.516)%，較好轉(zhuǎn)前的比例 (13.589±2.101)%增加，Th2細(xì)胞所占比例為 (1.499±0.274)%，較好轉(zhuǎn)前的比例 (1.673±0.290)%下降，但差異皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)；隱腦患者 (接受誘導(dǎo)治療前)NKT細(xì)胞在整體T淋巴細(xì)胞中所占比例為 (11.848±2.936)%，低于正常對(duì)照組的比例 (17.918±8.088)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，而隱腦患者的γδT細(xì)胞在整體T淋巴細(xì)胞中所占比例為 (9.166±3.989)%，與正常對(duì)照組的比例 (9.873±3.509)%對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)；隱腦患者經(jīng)治療好轉(zhuǎn)后NKT細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中所占比例為 (14.806±1.513)%，較好轉(zhuǎn)前比例 (11.830±1.350)%增加，γδT細(xì)胞所占比例為 (6.984±0.843)%，則較好轉(zhuǎn)前比例 (8.094±2.037)%下降，但差異皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。結(jié)論新生隱球菌性腦膜炎患者存在Th1細(xì)胞減少，Th2細(xì)胞增加，及NKT細(xì)胞在T淋巴細(xì)胞中所占比例下降，其說(shuō)明新生隱球菌性腦膜炎患者的細(xì)胞免疫功能明顯低下；經(jīng)治療好轉(zhuǎn)后的病例，Th1/Th2失衡狀態(tài)改善，可能提示患者的細(xì)胞免疫功能恢復(fù)對(duì)疾病預(yù)后起重要作用。

新生隱球菌；感染；Th1/Th2；NKT；γδT

新生隱球菌性腦膜炎 (以下簡(jiǎn)稱隱腦)是由新生隱球菌引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的真菌感染。近年來(lái)，由于廣譜抗生素，腎上腺皮質(zhì)激素，腫瘤化療、放療和器官移植后免疫抑制劑的長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用，以及艾滋病的流行，隱腦的患病率明顯上升。在我國(guó)，隱腦大多散發(fā)，主要集中在非艾滋病的其他免疫功能缺陷人群中[1-2]。

國(guó)外研究表明T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抵御新生隱球菌的過(guò)程中具有重要的意義，其中，CD4+T細(xì)胞在此過(guò)程中起著核心作用，Th1及Th2細(xì)胞間的平衡狀態(tài)能顯著影響感染的結(jié)局[3-4]。Th1細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子主要引起細(xì)胞免疫，可上調(diào)機(jī)體抗新生隱球菌的各種免疫反應(yīng)，而Th2細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子主要引起體液免疫，可下調(diào)與Th1細(xì)胞相關(guān)的各種免疫反應(yīng)，因此，當(dāng)Th1/Th2平衡失調(diào)，Th2細(xì)胞增加時(shí)，機(jī)體抵御新生隱球菌感染能力下降，導(dǎo)致易感性增加及感染后病情進(jìn)一步發(fā)展。T細(xì)胞還存在其他亞群，其中包括自然殺傷T (NKT)細(xì)胞和γδT細(xì)胞，在各種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)下，NKT和γδT細(xì)胞能共同調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的抗隱球菌免疫反應(yīng)[5]，NKT細(xì)胞能調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡向Th1方向傾斜，在新生隱球菌感染中發(fā)揮保護(hù)作用，而γδT細(xì)胞則可抑制NKT細(xì)胞所介導(dǎo)的各種Th1細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)，從而下調(diào)了機(jī)體抗新生隱球菌感染的能力。目前關(guān)于Th1/Th2平衡、NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞與新生隱球菌感染間的關(guān)系的研究多只限于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平，而對(duì)新生隱球菌感染患者組織或血液中NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞水平變化的研究國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)新生隱球菌性腦膜炎患者外周血中Th1及Th2類細(xì)胞及NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞的分布比例，探討是否與正常對(duì)照人群存在差異性，其變化是否與病情的轉(zhuǎn)歸呈相關(guān)性，從患者水平進(jìn)一步了解機(jī)體T淋巴細(xì)胞免疫在新生隱球菌感染過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 資料

實(shí)驗(yàn)對(duì)象 收集2009年1月～2015年12月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院及廣州市第八人民醫(yī)院住院并確診為新生隱球菌性腦膜炎/腦膜腦炎患者的外周血標(biāo)本16例。其中男性11例,女性5例；年齡28～71歲；所有患者入院前均無(wú)在外院行抗真菌治療，無(wú)接受手術(shù)、化療、放療史，HIV抗體檢測(cè)均陰性，無(wú)明確接觸史。健康志愿者10例，來(lái)源于患者家屬、門診體檢者及工作人員。所有患者及志愿者均知情同意。

診斷 ①有發(fā)熱、頭痛、嘔吐和腦膜刺激征等中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染臨床表現(xiàn)。②腦脊液 (CSF)墨汁染色涂片找到新生隱球菌和 (或)腦脊液新生隱球菌培養(yǎng)陽(yáng)性?；颊咄瑫r(shí)具備以上兩點(diǎn)條件為確診病例。

治療 所有患者治療方案首先聯(lián)合使用兩性霉素B (或兩性霉素B脂質(zhì)體)和氟胞嘧啶進(jìn)行2周的誘導(dǎo)治療，再使用氟康唑進(jìn)行8～10周的清除治療，而后可繼續(xù)使用氟康唑進(jìn)行6～12個(gè)月的維持治療。

療效評(píng)價(jià) 治愈標(biāo)準(zhǔn)為臨床癥狀消失,每周1次連續(xù)3次腦脊液墨汁涂片及培養(yǎng)陰性；好轉(zhuǎn)為臨床癥狀明顯改善，菌體計(jì)數(shù)減少，但涂片或培養(yǎng)未轉(zhuǎn)陰；無(wú)效為臨床癥狀、體征無(wú)明顯改善，菌體無(wú)明顯變化或患者死亡。

分組 本研究共入選隱腦患者16例，其中7例經(jīng)抗真菌治療后臨床癥狀明顯改善，腦脊液檢查隱球菌體計(jì)數(shù)＜10/mL，腦脊液常規(guī)及生化檢查基本正常，達(dá)到病情好轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)。①按抗真菌治療前的隱腦患者與健康志愿者將實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果分為A0組及A1組。②按隱腦患者自身好轉(zhuǎn)前后將檢測(cè)結(jié)果分為分為B0組及B1組。

酶抗體及試劑 見(jiàn)表1。

表1 酶抗體及試劑

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

標(biāo)本采集 受試者清晨空腹抽取靜脈血4 mL，各取2 mL注入EDTA抗凝管及肝素鈉抗凝管中，輕輕混勻后靜置。

標(biāo)本處理 Th1及Th2細(xì)胞因子 (IFN-γ、IL-4)樣本制備：①?gòu)母嗡剽c抗凝管中取200 μL血液標(biāo)本于試管中，用RPMI 1640等體積稀釋，加入適量PMA工作液及Ionomycin、Monensin工作液，于培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，加入各20 μL CD3單抗及CD8單抗，室溫避光孵育，分成4管后標(biāo)記，每管加入固定液，孵育后加PBS，離心，棄上清液，加入破膜及溶血液，同時(shí)各加入IFN-γ單抗、IL-4單抗及同型對(duì)照抗體，再次離心，棄上清液，重懸樣本后予流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)樣本每次檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞。②NKT、γδT細(xì)胞樣本制備：從EDTA抗凝管中各取100 μL血液樣本加入到不同標(biāo)記的流式管中，取20 μL CD3/16+56抗體及CD3+γδTCR抗體、同型對(duì)照試劑分別加入相應(yīng)的流式管內(nèi)，加入溶血素后避光反應(yīng)，再離心及棄上清液后重懸樣本，予流式細(xì)胞儀檢測(cè)，每個(gè)樣本每次檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞。

流式細(xì)胞儀檢測(cè) 調(diào)節(jié)儀器補(bǔ)償，采用Cellques軟件獲取分析細(xì)胞，以前向角 (FSC)和側(cè)向角 (SSC)散射光散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以CD3和CD8散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞 (近似等于CD3+CD8-)，以同型對(duì)照為陰性群，最終再以IFN-γ、IL-4的散點(diǎn)圖表示Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞。以CD3散點(diǎn)圖設(shè)門區(qū)分T淋巴細(xì)胞，以同型對(duì)照為陰性群，再以CD16+CD56、γδTCR散點(diǎn)圖分別表示NKT、γδT細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)散點(diǎn)圖結(jié)果 (見(jiàn)圖1～10)

2.2 患者、正常對(duì)照組結(jié)果分析

隱腦患者組 (治療前)、正常對(duì)照組之間Th1/Th2細(xì)胞平衡狀態(tài)比較 A0、A1兩組IFN-γ、IL-4單抗陽(yáng)性細(xì)胞各占CD3+CD8-細(xì)胞群 (近似等于CD4+T細(xì)胞)比例比較。如表2結(jié)果示A0組IFN-γ單抗陽(yáng)性細(xì)胞所占比例較A1組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)；A0組IL-4單抗陽(yáng)性細(xì)胞所占比例較A1組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)。由以上結(jié)果可知經(jīng)治療前患者組Th1/Th2平衡狀態(tài)失調(diào)Th1細(xì)胞在CD4+T淋巴細(xì)胞中所占比例減少，Th2細(xì)胞所占比例增加 (見(jiàn)表2)。

隱腦患者組好轉(zhuǎn)前后Th1/Th2細(xì)胞分布比例比較 B0、B1兩組IFN-γ、IL-4單抗陽(yáng)性細(xì)胞各占CD3+CD8-細(xì)胞群比例比較。如表3結(jié)果示經(jīng)治療好轉(zhuǎn)后隱腦患者IFN-γ單抗陽(yáng)性細(xì)胞所占比例較治療前有所增加，IL-4單抗陽(yáng)性細(xì)胞所占比例較治療前有所下降，但差異皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

圖1Th1/Th2 (IFN-γ/IL-4)檢測(cè)圖2隱腦患者IFN-γ檢測(cè)圖3正常健康人IFN-γ檢測(cè)圖4隱腦患者IL-4檢測(cè)圖5正常健康人IL-4檢測(cè)圖6NKT、γδT細(xì)胞檢測(cè)圖7隱腦患者NKT細(xì)胞檢測(cè)圖8正常健康人NKT檢測(cè)圖9隱腦患者γδT細(xì)胞檢測(cè)圖10正常健康人γδT檢測(cè)

Fig.1Detection of Th1/Th2 (IFN-γ/IL-4) lymphocytesFig.2IFN-γ of patients with cryptococcal meningitisFig.3IFN-γ of healthy peopleFig.4IL-4 of patients with cryptococcal meningitisFig.5IL-4 of healthy peopleFig.6Detection of NKT,γδT lymphocytesFig.7NKT of patients with cryptococcal meningitisFig.8NKT of healthy peopleFig.9γδT of patients with cryptococcal meningitisFig.10γδT of healthy people

表2A組IFN-γ、IL-4單抗陽(yáng)性細(xì)胞各占CD3+CD8-細(xì)胞群比例比較

Tab.2The proportions of Anti-IFN-γ and Anti-IL-4 cells in CD3+CD8-cells of group A

分組抗IFN?γ陽(yáng)性細(xì)胞占CD3+CD8?細(xì)胞群比例(%)抗IL?4陽(yáng)性細(xì)胞占CD3+CD8?細(xì)胞群比例(%)A013．093±4．6181．769±0．865A119．582±4．9490．584±0．202t?3．3934．229P值0．0020．000

表3B組IFN-γ、IL-4單抗陽(yáng)性細(xì)胞各占CD3+CD8-細(xì)胞群比例比較

Tab.3The proportions of Anti-IFN-γ and Anti-IL-4 cells in CD3+CD8-cells of group B

分組抗IFN?γ陽(yáng)性細(xì)胞占CD3+CD8?細(xì)胞群比例(%)抗IL?4陽(yáng)性細(xì)胞占CD3+CD8?細(xì)胞群比例(%)B013．589±2．1011．673±0．290B116．069±1．5161．499±0．274t?0．9560．440P值0．3580．668

隱腦患者組 (治療前)、正常對(duì)照組之間NKT、γδT細(xì)胞分布比例比較 A0、A1兩組NKT、γδT細(xì)胞各占外周血T淋巴細(xì)胞比例比較。如表4結(jié)果示隱腦患者NKT細(xì)胞所占比例較正常對(duì)照人低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；而兩組γδT細(xì)胞分布比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

隱腦患者組好轉(zhuǎn)前后NKT、γδT細(xì)胞分布比例比較 B0、B1兩組NKT、γδT細(xì)胞各占外周血T淋巴細(xì)胞比例比較。如表5結(jié)果示經(jīng)治療好轉(zhuǎn)后隱腦患者NKT細(xì)胞所占比例較治療前有所增加，γδT細(xì)胞所占比例較治療前有所下降，但差異皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

3 討 論

隱腦治療困難，病死率高。在我國(guó)目前感染病例報(bào)道主要以HIV陰性人群為主，但其中相當(dāng)部分患者發(fā)病前已經(jīng)存在各種基礎(chǔ)疾病，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能缺陷，T輔助細(xì)胞 (CD4+T)、殺傷性T淋巴細(xì)胞 (CTL)等重要免疫功能細(xì)胞進(jìn)行性減少。但近年也有研究表明無(wú)基礎(chǔ)疾病而新生隱球菌病的發(fā)病人群中可能存在著未察覺(jué)的細(xì)胞免疫低下情況，如CD4+或CD8+淋巴細(xì)胞倒置[6]、淋巴細(xì)胞亞型分配不合理等[7]。目前認(rèn)為T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)在抵御新生隱球菌感染過(guò)程中具有重要的意義，其作用機(jī)制一般認(rèn)為與體內(nèi)CD4+T的功能密切相關(guān)，其中Th1/Th2細(xì)胞間的平衡狀態(tài)被認(rèn)為是機(jī)體抵御隱球菌感染的核心機(jī)制[3-4]。

表4A組NKT、γδT細(xì)胞占外周血T淋巴細(xì)胞比例比較

Tab.4The proportions of NKT and γδT cells in T lymphocyte of peripheral blood of group A

分組NKT占T淋巴細(xì)胞比例(%)γδT占T淋巴細(xì)胞比例(%)A011．848±2．9369．166±3．989A117．918±8．0889．873±3．509t?2．677?0．302P值0．0130．768

表5B組NKT、γδT細(xì)胞占外周血T淋巴細(xì)胞比例比較

Tab.5The proportions of NKT and γδT cells in T lymphocyte of peripheral blood of group B

分組NKT占T淋巴細(xì)胞比例(%)γδT占T淋巴細(xì)胞比例(%)B011．830±1．3508．094±2．037B114．806±1．5136．984±0．843t?1．4680．504P值0．1680．624

Th1/Th2類細(xì)胞因子與新生隱球菌感染的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸都有密切的關(guān)系。在生理?xiàng)l件下，機(jī)體Th1/ Th2 細(xì)胞的免疫功能處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，如果該狀態(tài)失衡，Th1類細(xì)胞因子減少，Th2類細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì)，則可導(dǎo)致機(jī)體抵御新生隱球菌的免疫功能減弱或者喪失，導(dǎo)致易感性增加[3]。本研究將未經(jīng)抗真菌治療隱腦患者及健康對(duì)照人群進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在對(duì)CD4+T細(xì)胞進(jìn)行刺激后，患者組IFN-γ表達(dá)較健康人低，而IL-4表達(dá)水平則較健康人高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.01)，其結(jié)果表明隱腦患者Th1/Th2平衡狀態(tài)失調(diào)，Th1細(xì)胞在CD4+T淋巴細(xì)胞中所占比例減少，Th2細(xì)胞所占比例增加。而在對(duì)經(jīng)治療好轉(zhuǎn)前后的隱腦患者自身進(jìn)行對(duì)比，可發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后好轉(zhuǎn)組Th1細(xì)胞所占比例較治療前增加，而Th2細(xì)胞所占比例則有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)，考慮可能與入選好轉(zhuǎn)組病例數(shù)偏少有關(guān)。

最近發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞還存在著其他亞群，其中NKT細(xì)胞及γδT細(xì)胞被認(rèn)為能共同調(diào)節(jié)T輔助細(xì)胞介導(dǎo)的抗新生隱球菌免疫反應(yīng)[5]。在對(duì)動(dòng)物感染模型的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NKT和γδT細(xì)胞在新生隱球菌初始感染后可各自通過(guò)不同模式迅速在肺組織中聚集，而在使Vα14 NKT細(xì)胞合成障礙的基因敲除小鼠中，Th1細(xì)胞相關(guān)炎癥反應(yīng)及病原微生物的清除較對(duì)照小鼠明顯減弱；在缺乏γδT細(xì)胞的小鼠中，機(jī)體對(duì)新生隱球菌感染的保護(hù)性炎癥反應(yīng)反而得到了增強(qiáng)。在對(duì)已經(jīng)感染新生隱球菌小鼠注射NKT活化劑α-GalCer進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)NKT細(xì)胞水平明顯上調(diào)的同時(shí)，機(jī)體對(duì)組織中感染病原體的清除能力也同時(shí)得到了增強(qiáng)。

在上述的研究中，NKT、γδT細(xì)胞都被認(rèn)為在機(jī)體抵抗新生隱球菌感染進(jìn)程中起著重要的作用，但其結(jié)論都基于各種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)隱球菌感染患者組織或血液中NKT、γδT細(xì)胞水平變化研究的報(bào)道。本研究將未經(jīng)抗真菌治療隱腦患者及健康對(duì)照人群進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)在未經(jīng)治療的患者組NKT在T淋巴細(xì)胞中的比例較健康人明顯為低，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)，而γδT所占比例則與健康人無(wú)明顯差別，經(jīng)治療好轉(zhuǎn)后患者組NKT比例則較治療前有所增加，γδT比例則有所下降，但其差異性皆無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。

通過(guò)本研究結(jié)果可知，新生隱球菌性腦膜炎/腦膜腦炎患者的Th1/Th2平衡狀態(tài)失調(diào)，Th1細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子減少，Th2細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子增加，這不僅使機(jī)體對(duì)新生隱球菌易感性增加，并弱化了之后免疫系統(tǒng)針對(duì)隱球菌感染后的各項(xiàng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，導(dǎo)致病情進(jìn)一步發(fā)展。而在經(jīng)過(guò)抗真菌治療，病情好轉(zhuǎn)，Th1/Th2失衡狀態(tài)同時(shí)亦有所改善，Th1細(xì)胞較治療前回升，而Th2細(xì)胞水平則較前下降，平衡向Th1方向傾斜，這可能提示患者的細(xì)胞免疫功能恢復(fù)對(duì)疾病預(yù)后起重要作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)可知，患者組的NKT細(xì)胞較正常人明顯為低，因此無(wú)法產(chǎn)生足夠的IFN-γ及IL-12作用于Th0細(xì)胞，使其向Th1方向分化，NKT細(xì)胞的減少亦無(wú)法激活正常數(shù)量的NK細(xì)胞，最終導(dǎo)致機(jī)體抗隱球菌感染的能力低下。由于固有免疫T細(xì)胞間可能存在著一種相互制約的關(guān)系使Th1及Th2類因子處于一種適當(dāng)?shù)钠胶鉅顟B(tài)，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示患者組的γδT細(xì)胞與正常人并無(wú)明顯差異，導(dǎo)致平衡向Th2方向傾斜，從而下調(diào)了機(jī)體抵御新生隱球菌感染能力。

雖然在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中證實(shí)Th1類細(xì)胞因子減少可導(dǎo)致其對(duì)新生隱球菌易感，但由于無(wú)法預(yù)先檢測(cè)隱腦患者患病前Th1及Th2類細(xì)胞因子及NKT、γδT細(xì)胞的分布比例，因此無(wú)法確定患病后其比例失調(diào)與患者本身存在免疫功能缺陷有關(guān)，還是由于隱球菌感染自身也可導(dǎo)致。目前也尚無(wú)分析感染前后Th1/Th2平衡狀態(tài)變化的文獻(xiàn)報(bào)道，因此，關(guān)于Th1/Th2平衡狀態(tài)及NKT、γδT細(xì)胞如何影響新生隱球菌感染進(jìn)程的相關(guān)研究仍有待進(jìn)一步深入。

而如何人為介入，并安全有效地在Th1/Th2平衡失調(diào)的患者身上重新建立起有效的抵御隱球菌的保護(hù)屏障，或通過(guò)改變NKT細(xì)胞、γδT細(xì)胞的活化水平來(lái)增強(qiáng)隱球菌感染機(jī)體的免疫細(xì)胞 (如NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)對(duì)隱球菌的殺傷仍有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的明確。目前關(guān)于通過(guò)改變Th1/Th2狀態(tài)輔助治療新生隱球菌感染的報(bào)道十分稀少，國(guó)外研究[8-10]通過(guò)增強(qiáng)嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷 (SCID)小鼠Th1類細(xì)胞的活性可增強(qiáng)抗真菌藥物對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)隱球菌病的治療作用。部分臨床醫(yī)師認(rèn)為在隱球菌病抗真菌治療中使用免疫活性肽 (如胸腺肽，可促使Th1類細(xì)胞因子分泌增加，Th2類因子分泌減少)作為輔助治療可取得更好的療效，但目前尚無(wú)大樣本的臨床報(bào)道。而對(duì)感染小鼠注射NKT細(xì)胞活化劑α-Galcer，發(fā)現(xiàn)能增加Th1細(xì)胞及NK細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-γ，使Th1/Th2平衡向Th1方向傾斜，增強(qiáng)其免疫系統(tǒng)抵抗新生隱球菌感染的能力，顯著減少感染組織中隱球菌的存活數(shù)[11]。以上研究皆提示在免疫缺陷患者感染性疾病 (包括新生隱球菌性腦膜炎)中，通過(guò)改變Th1/Th2平衡狀態(tài)，適當(dāng)引發(fā)Th1型炎癥反應(yīng)將是一種可能有效的治療方法。

通過(guò)進(jìn)一步加深對(duì)T輔助細(xì)胞及相關(guān)T淋巴細(xì)胞與新生隱球菌感染作用機(jī)制的了解，可為進(jìn)一步弄清隱球菌病的發(fā)病機(jī)制及臨床探討預(yù)防和治療隱球菌病途徑，開(kāi)發(fā)新的治療方法或治療藥物提供理論依據(jù)，從而提高新生隱球菌病的防治水平。

[1] 顧菊林,溫海,廖萬(wàn)清,等.隱球菌性腦膜炎患者臨床免疫指標(biāo)分析[J].臨床皮膚科雜志,2003,32(2):72-73.

[2] 翁心華.隱球菌病[M].秦啟賢編.臨床真菌學(xué).第1版.上海:復(fù)旦大學(xué)出版社，2001:346-363.

[3] Koguchi Y,Kawakami K.Cryptococcal infection and Th1-Th2 cytokine balance[J].Int Rev Immunol,2002,21(45):423-438.

[4] Snelgrove RJ,Edwards L,Williams AE,et al.In the absence of reactive oxygen species,T cells default to a Th1 phenotype and mediate protection against pulmonaryCryptococcusneoformansinfection[J].J Immunol,2006,177(8):5509-5516.

[5] Kawakami K.Regulation by innate immune T lymphocytes in the host defense against pulmonary infection withCryptococcusneoformans[J].Jpn J Infect Dis,2004,57 (4):137-145.

[6] Stockstill MT,Kaufman CA.Comparison of cryptococcal and tuberculous meningitis[J].Arch Neurol,1983,40(2):81-85.

[7] Sato Y,Osabe S,Kuno H,et al.Rapid diagnosis of cryptococcal meningitis by microscopic examination of centrifuged cerebrospinal fluid sediment[J].J Neurol Sci,1999,164(1):72-75.

[8] Clemons KV,Lutz JE,Stevens DA.Efficacy of recombinant gamma interferon for treatment of systemic cryptococcosis in SCID mice[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45(3):686-689.

[9] Retini C,Kozel TR,Pietrella D,et al.Interdependency of interleukin-10 and interleukin-12 in regulation of T2 cell differentiation and effector function of monocytes in response to stimulation withCryptococcusneoformans[J].Infect Immun,2011,69 (10):6064-6073.

[10] Clemons KV,Brummer E,Stevens DA.Cytokine treatment of central nervous system infection:efficacy of interleukin-12 alone and synergy with conventional antifungal therapy in experimental cryptococcosis[J].Antimicrob Agents Chemother，1994,38(3):460-464.

[11] Kawakami K,Kinjo Y,Yara,S,et al.Activation of Valpha14(+) natural killer T cells by alpha-galactosylceramide results in development of Th1 response and local host resistance in mice infected withCryptococcusneoformans[J].Infect Immun,2001,69(1):213-220.

TheproportionsofTh1/Th2andRelevantTlymphocytesinpatientswithcryptococcalmeningitisanditsclinicalsignificance

HUANG Huang1，XIAN Ying2，PAN Yue-jun1，ZHANG Kou-xing2

(1.GuangzhouEighthPeople'sHospital,Guangzhou510060,China;2.TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China)

ObjectiveThis study is to further understanding the mechanism of T helper cells in course ofC.neofermansinfection from patient's level through measuring the proportions of Th1 /Th2 cell factors and NKT cells,γδT cells in peripheral blood between normal adult and patients.Analyze whether the change presents relevance with the disease prognosis.MethodThe peripheral blood samples were collected from 16 patients with cryptococcal meningitis,and 10 healthy people.The proportions of Th1/Th2 cell factors and NKT cells,γδ T cells were analyzed by flow cytometry (FCM).Results1.The proportion of Th1 cells in CD4 +T lymphocyte of patients with cryptococcal meningitis before treatment was (13.093±4.618)%,less than that of healthy people (19.582±4.949)%,P＜0.01.And the proportion of Th2 cells was (1.769±0.865)%,higher than that of healthy people (0.584±0.202)%,P＜0.01.2.Patients who

treatment showed the increased levels of Th1 cells in CD4 +T lymphocyte (16.069±1.516)% which was higher than those in patients before treatment (13.589±2.101)%,P>0.05.The proportion of Th2 cells in the patients had received treatment was (1.499±0.274)%,less than those of patients before treatment (1.673±0.290)%,P>0.05.3.The proportion of NKT cells in T lymphocyte of patients with cryptococcal meningitis before treatment was (11.848±2.936)%,less than those of healthy people (17.918±8.088)%,P＜0.05.No significant differences of proportions of γδT in T lymphocyte among patients before treatment and healthy people[(9.166±3.989)% vs (9.873±3.509)%],P>0.05.4.Patients who received treatment showed the increased levels of NKT cells in T lymphocyte (14.806±1.513)% which was higher than those in patients before treatment (11.830±1.350)%,P>0.05.The proportion of γδT cells in the patients who had received treatment was (6.984±0.843)%,less than those of patients before treatment (8.094±2.037)%,P>0.05.Conclutions1.The balance of Th1/Th2 falls towards Th2 and the decrease of the proportion of NKT cells among T lymphocytes in patients with cryptococcal meningitis.It suggests that the cell-mediated immunity of patients with cryptococcal meningitis is weakened.2.Once the patients get better after treatment,Th1/Th2 imbalance would be corrected in that the balance turned to Th1 direction.It suggests that the recovery of cell-mediated immunity may improve the prognosis of these disease.

Cryptococusneofermans;infections;Th1/Th2;NKT;γδT

[Chin J Mycol，2017，12(5):268-273]

R 519.4

A

1673-3827(2017)12-0268-06

黃煌，男 (漢族)，碩士，主治醫(yī)師.E-mail:gz8hhh@126.com

張扣興,E-mail:kxz6210@tom.com

2016-09-09

[本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮