8種抗真菌藥物對(duì)淺表真菌病致病菌株體外敏感性檢測(cè)

吳偉偉 王千 龔杰 萬(wàn)喆 王愛平 李若瑜

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京 100034；2.海南省皮膚病醫(yī)院，?？?570206)

·論著·

8種抗真菌藥物對(duì)淺表真菌病致病菌株體外敏感性檢測(cè)

吳偉偉1,2王千1龔杰1萬(wàn)喆1王愛平1李若瑜1

(1.北京大學(xué)第一醫(yī)院皮膚性病科 北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心，北京 100034；2.海南省皮膚病醫(yī)院，?？?570206)

目的確定8種抗真菌藥物對(duì)100株淺表致病真菌的體外藥物敏感性。方法參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 (Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)微量液基稀釋法M27-A3和M38-A2方案，采用8種抗真菌藥物對(duì)100株常見淺表致病真菌進(jìn)行體外藥物敏感性測(cè)定。結(jié)果體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，8種藥物對(duì)皮膚癬菌表現(xiàn)出良好的體外藥物敏感性，其中特比萘芬 (GM MIC，0.011 μg/mL，MIC范圍,0.004～0.06 μg/mL)具有最強(qiáng)的抗真菌活性。咪康唑 (GM MIC，0.147 μg/mL，MIC范圍0.015～1 μg/mL)具有最強(qiáng)的抗念珠菌活性。酮康唑 (GM MIC，0.097 μg/mL，MIC范圍0.03～1 μg/mL)則對(duì)馬拉色菌具有最佳體外抗真菌效果。結(jié)論體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明常見淺表致病真菌對(duì)8種常用抗真菌藥物表現(xiàn)出不同的敏感性。酮康唑具有廣譜高效的特點(diǎn)，對(duì)臨床常見皮膚癬菌、念珠菌、馬拉色菌均具有良好的體外抗真菌活性。特比萘芬和萘替芬對(duì)皮膚癬菌具有最佳的抗真菌活性。

抗真菌劑；藥敏實(shí)驗(yàn)；微量液基稀釋法；淺表真菌病

皮膚癬菌、念珠菌及馬拉色菌感染性疾病目前仍然是淺部真菌病的主要致病菌。外用抗真菌藥物已被臨床廣泛使用多年，因此有必要采用最新方法進(jìn)行再評(píng)價(jià)。目前為止，美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所 (Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)于2008年更新的針對(duì)絲狀真菌和酵母菌的微量液基稀釋法 (M38-A2[1]和M27-A3[2]方案)，因具有良好的準(zhǔn)確性和重復(fù)性而獲得廣泛認(rèn)可和應(yīng)用。本研究采用酮康唑等8種常用抗真菌藥物對(duì)100株分離自淺部真菌病患者的致病菌株 (皮膚癬菌、念珠菌及馬拉色菌)進(jìn)行體外抗真菌藥物敏感性測(cè)定，以確定8種藥物的抗真菌活性及臨床應(yīng)用多年后抗菌活性變遷情況。

1 材料和方法

1.1 受試菌株

100株受試真菌系北京大學(xué)真菌和真菌病研究中心保藏菌株，分離自臨床淺部真菌病患者，其中包括皮膚癬菌屬45株 (紅色毛癬菌20株，趾間毛癬菌10株，絮狀表皮癬菌、犬小孢子菌和石膏樣小孢子菌各5株)，念珠菌屬40株 (白念珠菌25株，光滑念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌各5株)，馬拉色菌屬15株 (糠秕馬拉色菌12株，厚皮馬拉色菌3株)，均經(jīng)形態(tài)學(xué)和核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (ribosomalinternal transcribed spacer (ITS) region)序列分析鑒定。質(zhì)控菌株為美國(guó)菌種保藏中心提供的近平滑念珠菌ATCC-22019和須癬毛癬菌ATCC-MYA-4439。

1.2 試驗(yàn)方法

抗真菌藥物 酮康唑、咪康唑、聯(lián)苯芐唑、盧立康唑、環(huán)吡酮胺、阿莫羅芬、特比萘芬和萘替芬，均為標(biāo)準(zhǔn)試劑級(jí)粉劑。酮康唑、環(huán)吡酮胺和鹽酸阿莫羅芬購(gòu)自Sigma-Aldrich公司 (St.Louis,USA，批號(hào)分別為SLBK7327V，SLBF8062V，032M4704V)，硝酸咪康唑、聯(lián)苯芐唑、鹽酸特比萘芬和鹽酸萘替芬購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院 (北京，中國(guó)，批號(hào)分別為100213-201406，100326-200201，100563-201402，100823-20501)，盧立康唑購(gòu)自海格生物科技 (上海)有限公司 (上海，中國(guó)，批號(hào)為1407202)。采用100%二甲基亞砜 (DMSO)溶解稀釋8種抗真菌藥物至儲(chǔ)存液濃度為1.6 mg/mL，置于無(wú)菌聚乙烯小瓶-70℃存儲(chǔ)備用。

藥物稀釋 根據(jù)CLSI M38-A2或CLSI M27-A3方案進(jìn)行。對(duì)皮膚癬菌和念珠菌使用RPMI-1640液體培養(yǎng)基將8種藥物儲(chǔ)存液進(jìn)行2倍比稀釋，對(duì)馬拉色菌使用改良LAN液體培養(yǎng)基[3-4]將8種藥物儲(chǔ)存液進(jìn)行2倍比稀釋。體外藥敏測(cè)定中，最終濃度范圍在皮膚癬菌時(shí)為酮康唑、咪康唑、聯(lián)苯芐唑、環(huán)吡酮胺、阿莫羅芬0.015～8 μg/mL，盧立康唑0.001～0.5 μg/mL、特比萘芬和萘替芬0.000 25～0.125 μg/mL；在念珠菌時(shí)8種藥物均為0.015～8 μg/mL；在馬拉色菌時(shí)8種藥物均為0.03～16 μg/mL。

菌懸液制備 根據(jù)CLSI M38-A2或CLSI M27-A3方案，利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器制備菌懸液，并調(diào)整皮膚癬菌菌懸液終濃度為1～3×103CFU/mL，念珠菌和馬拉色菌菌懸液終濃度為0.5～2.5×103CFU/mL。

體外藥敏試驗(yàn) 體外藥敏試驗(yàn)根據(jù)CLSI M38-A2或M27-A3方案進(jìn)行。接種后的藥敏板置于濕盒內(nèi)，皮膚癬菌、念珠菌和馬拉色菌分別在35℃培養(yǎng)5～7 d、48 h和72 h。每天觀察生長(zhǎng)情況，以陽(yáng)性對(duì)照孔生長(zhǎng)良好為準(zhǔn)。

MIC判定 最小抑菌濃度 ( minimal inhibitory concentrations，MIC)值采用終點(diǎn)判讀法進(jìn)行結(jié)果判讀。針對(duì)皮膚癬菌，環(huán)吡酮胺、阿莫羅芬、特比萘芬或萘替芬MIC判讀標(biāo)準(zhǔn)為與生長(zhǎng)對(duì)照相比無(wú)任何肉眼可辨生長(zhǎng) (100%)的最低藥物濃度；唑類藥物MIC判讀標(biāo)準(zhǔn)為與生長(zhǎng)對(duì)照相比生長(zhǎng)明顯抑制 (80%)的最低藥物濃度。針對(duì)念珠菌和馬拉色菌，8種藥物MIC判讀標(biāo)準(zhǔn)為與生長(zhǎng)對(duì)照相比生長(zhǎng)明顯抑制 (80%)的最低藥物濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與處理

對(duì)所有試驗(yàn)菌株記錄藥物MIC值，計(jì)算MIC范圍，MIC50、MIC90和MIC幾何均數(shù) (geometric mean MIC，GM MIC)。

2 結(jié) 果

8種藥物對(duì)100株淺表致病真菌體外藥物敏感性模式 (見表1)。體外藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示8種抗真菌藥物對(duì)100株淺表致病真菌表現(xiàn)出不同的抗真菌活性。8種藥物針對(duì)45株皮膚癬菌的GM MIC由低至高分別為特比萘芬 (0.011 μg/mL)，萘替芬 (0.016 μg/mL)，阿莫羅芬 (0.028 μg/mL)，盧立康唑 (0.034 μg/mL)，咪康唑 (0.093 μg/mL)，聯(lián)苯芐唑 (0.111 μg/mL)，酮康唑 (0.161 μg/mL)，環(huán)吡酮胺 (1.131 μg/mL)。8種抗真菌藥物針對(duì)40株念珠菌的GM MIC由低到高分別為咪康唑 (0.147 μg/mL)，酮康唑 (0.202 μg/mL)，聯(lián)苯芐唑 (0.765 μg/mL)，環(huán)吡酮胺 (1.0 μg/mL)，阿莫羅芬 (2.834 μg/mL)，盧立康唑 (4.362 μg/mL)，特比萘芬 (9.849 μg/mL)，萘替芬(12.553 μg/mL)。8種藥物針對(duì)馬拉色菌的GM MIC由低到高分別為酮康唑 (0.097 μg/mL)，阿莫羅芬 (0.871 μg/mL)，聯(lián)苯芐唑 (1.260 μg/mL)，環(huán)吡酮胺 (4.0 μg/mL)，咪康唑 (9.190 μg/mL)，盧立康唑 (30.555 μg/mL)，特比萘芬 (42.224 μg/mL)，萘替芬 (44.221 μg/mL)。

表1 8種抗真菌藥物對(duì)100株分離自淺部真菌病患者的致病真菌體外抗真菌活性 (μg/mL)

Species(Numberofstraintested)KetoconazoleMiconazoleBifonazoleLuliconazoleCiclopiroxOlamineAmorolfineTerbinafineNaftifineMIC500．1250．251>810．12524MIC900．1250．54>810．528AllCandidaRange0．03?80．015?10．125?40．5?>810．015?>81?>82?>8isolatesGM0．2020．1470．7654．36212．8349．84912．553(n=40)MIC500．1250．251418>8>8MIC9010．52>81>8>8>8M．furfurRange0．06?12?>160．25?16>1640．25?4>32≥32(n=12)GM0．13010．6791．4143240．7076460．408MIC500．12581>1640．5>32>32MIC900．25>164>1644>32>32M．pachydermatisRange0．034?80．5?1≥16421?322?>32(n=3)GM0．035．0400．79425．39842812．699MIC500．0341>16421616MIC900．0381>164232>32AllMalasseziaRange0．03?12?>160．25?16≥1640．25?41?>322?>32isolatesGM0．0979．1901．26030．55540．87142．22444．221(n=15)MIC500．0681>1640．5>32>32MIC900．25>164>1644>32>32

注：1).GM.geometric mean,2) and 3).MIC50and MIC90,MIC required to inhibit the growth of 50% and 90% of the test strains

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示8種藥物均對(duì)45株皮膚癬菌表現(xiàn)出良好的體外藥物敏感性，同既往部分研究結(jié)果相似[5-6]。Adimi等[7]報(bào)道酮康唑、特比萘芬、萘替芬、環(huán)吡酮胺和阿莫羅芬對(duì)五種皮膚癬菌的MIC值普遍高于本研究中相應(yīng)結(jié)果，但卻表現(xiàn)出相似的藥物敏感性模式，特比萘芬和萘替芬對(duì)皮膚癬菌具有最佳的體外抗真菌活性。本研究結(jié)果顯示唑類藥物抗念珠菌活性要高于其他種類藥物。Jo Siu等[8]的研究結(jié)果表現(xiàn)出相似的藥物敏感性模式，即唑類藥物最為敏感，丙烯胺類藥物敏感性最低，環(huán)吡酮胺和阿莫羅芬居中。盡管本研究中8種藥物對(duì)馬拉色菌MIC同國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究結(jié)果不盡一致[9-11]，但本研究發(fā)現(xiàn)酮康唑?qū)︸R拉色菌具有最佳抗菌活性，同Rojas[12]和Carrillo-Muoz[13]的研究結(jié)果一致，因此酮康唑應(yīng)當(dāng)作為馬拉色菌感染性疾病治療的良好選擇。

綜上所述，本研究結(jié)果表明常見淺表致病真菌對(duì)8種常用抗真菌藥物表現(xiàn)出不同的敏感性。盡管酮康唑已經(jīng)臨床使用多年，但仍然具有廣譜高效的特點(diǎn)，對(duì)于常見皮膚癬菌、念珠菌、馬拉色菌具有良好的體外抗真菌活性。特比萘芬和萘替芬對(duì)皮膚癬菌具有最佳體外抗真菌活性。上述研究結(jié)果可為日漸增加的淺表真菌病治療提供藥物選擇參考。

致謝 本研究由西安楊森制藥有限公司科學(xué)研究基金資助。

[1] Clinical and Laboratory Standards Institute Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi;Approved standard-2nd Ed.CLSI document M38-A2[S].Wayne PA:.Clinical Laboratory Standards Institute.2008.

[2] Clinical and Laboratory Standards Institute Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts;Approved standard-3rd Ed.CLSI document M27-A3[S].Wayne PA:Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

[3] Leeming JP,Notman FH.Improved methods for isolation and enumeration ofMalasseziafurfurfrom human skin[J].J Clin Microbiol,1987,25(10):2017-2019.

[4] Miranda KC,de Araujo CR,Costa CR,et al.Antifungal activities of azole agents against the Malassezia species[J].Int J Antimicrob Agents,2007,29(3):281-284.

[5] Badali H,Mohammadi R,Mashedi O,et al.Invitrosusceptibility patterns of clinically important Trichophyton and Epidermophyton species against nine antifungal drugs[J].Mycoses,2015,58(5):303-307.

[6] Fernández-Torres B,Carrillo AJ,Martín E,et al.Invitroactivities of 10 antifungal drugs against 508 dermatophyte strains[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45(9):2524-2528.

[7] Adimi P,Hashemi SJ,Mahmoudi M,et al.InvitroActivity of 10 Antifungal Agents against 320 Dermatophyte Strains Using Microdilution Method in Tehran[J].Iran J Pharm Res,2013,12(3):537-545.

[8] Jo Siu WJ,Tatsumi Y,Senda H,et al.Comparison ofinvitroantifungal activities of efinaconazole and currently available antifungal agents against a variety of pathogenic fungi associated with onychomycosis[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(4):1610-1616.

[9] Gupta AK,Kohli Y,Li A,et al.Invitrosusceptibility of the seven Malassezia species to ketoconazole,voriconazole,itraconazole and Terbinafine[J].Br J Dermatol,2000,142(4):758-765.

[10] Nakamura Y,Kano R,Murai T,et al.Susceptibility testing of Malassezia species using the urea broth microdilution method[J].Antimicrob Agents Chemother,2000,44(8):2185-2186.

[11] Garau M,Pereiro M Jr,del Palacio A.Invitrosusceptibilities of Malassezia species to a new triazole,albaconazole (UR-9825),and other antifungal compounds[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(7):2342-2344.

[12] Rojas FD,Sosa Mde L,Fernández MS,et al.Antifungal susceptibility ofMalasseziafurfur,Malasseziasympodialis,andMalasseziaglobosato azole drugs and amphotericin B evaluated using a broth microdilution method[J].Med Mycol,2014,52(6):641-646.

[13] Carrillo-Muoz AJ,Rojas F,Tur-Tur C,et al.Invitroantifungal activity of topical and systemic antifungal drugs againstMalasseziaspecies[J].Mycoses,2013,56(6):571-575.

Invitrosusceptibilitytestingofeightantifungalagentsagainstpathogenicfungiisolatedfromsuperficialmycoses

WU Wei-wei1,2,WANG Qian1,GONG Jie1,WAN Zhe1,WANG Ai-ping1,LI Ruo-yu1

(1.DepartmentofDermatologyandVenereology,PekingUniversityFirstHospital,ResearchCenterforMedicalMycology,PekingUniversity,Beijing100034,China；2.DepartmentofDermatologyandVenereology,HainanProvinicalHospitalofSkinDisease，Haikou570206,China)

ObjectiveTo investigate theinvitroactivity of 8 antifungal agents against 100 strains of pathogenic fungi isolated from patitens with superficial mycoses.MethodsThe antifungal susceptibility testing was investigated following Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) reference broth microdilution methods.Eight antifungal agents were evaluated against 45 dermatophyte strains,35Candidastrains and 15Malasseziastrains.ResultsOur minimum inhibitory concentration (MIC) results revealed that terbinafine (GM MIC,0.011 μg/mL;MIC range,0.004-0.06 μg/mL) had the strongest antifungal activity againstDermatophyte,miconazole (GM MIC,0.147 μg/mL;MIC range,0.015-1 μg/mL) againstCandida,and ketoconazole (GM MIC,0.097 μg/mL;MIC range,0.03-1 μg/mL) againstMalassezia.ConclusionsTheinvitrosusceptibility testing indicates that common superficial pathogenic fungi exhibit variable susceptibilities to 8 antifungal agents.Ketoconazole has a potent antifungal activity for dermatophyte,CandidaandMalassezia.Terbinafine and naftifine were the most active agents forDermatophyte.

antifungal agents;susceptibility testing;broth microdilution;superficial mycoses

[Chin J Mycol，2017，12(5):279-282]

R 978.5

A

1673-3827(2017)12-0279-04

吳偉偉，男 (漢族)，博士，副主任醫(yī)師.E-mail:vigorwu@bjmu.edu.cn

李若瑜,E-mail:mycolab@126.com

2017-03-04

[本文編輯] 施 慧