超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查牛奶中28種禁用獸藥殘留

虞成華，林 琳，楊晉青，孫穎宜，成 姍，葛 宇

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海200233）

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查牛奶中28種禁用獸藥殘留

虞成華，林 琳，楊晉青，孫穎宜，成 姍，葛 宇

（上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院，上海200233）

應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜建立了牛奶中28種獸藥殘留的快速篩查分析方法。牛奶樣品經(jīng)含體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸的乙腈溶液提取，采用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化。目標(biāo)化合物經(jīng) Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）分離，以甲醇-甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，使用電噴霧離子源，在正負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，可在20 min內(nèi)實現(xiàn)對28種獸藥的良好分離。結(jié)果表明，牛奶中28種獸藥的定量下限（LOQ，S/N=10）在1～10 μg/kg，平均回收率在68.9%～102.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.30%～11.5%。

超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜；牛奶；獸藥；快速篩查

獸藥在防治動物疾病等方面起著十分重要的作用，但是如果使用不當(dāng)或非法使用，過量的藥物就會殘留在動物體內(nèi)，這不僅對人體健康造成很大危害，而且對畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境也造成極大危害[1]。

目前針對動物源性食品獸藥殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法、分子印跡技術(shù)、液相色譜法[2-4]、氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-6]、液質(zhì)聯(lián)用法[7-8]、液相色譜-飛行時間質(zhì)譜（Q-TOF）等[9-13]等。但是單純的氣相、液相色譜法通量小，檢測限高，且存在較大的基質(zhì)干擾，適用性小。氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行獸藥殘留檢測前通常需衍生化處理，步驟較繁瑣，在獸藥分析中的應(yīng)用受到一定限制。液質(zhì)聯(lián)用法具有很好的靈敏度、選擇性以及特異性，是目前獸藥殘留檢測中最強(qiáng)有力的工具。高分辨質(zhì)譜技術(shù)是近年來發(fā)展非?？焖俚姆治黾夹g(shù)，與串聯(lián)四極桿質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜掃描速度快，能夠保存樣品的全掃描圖譜，提供歷史數(shù)據(jù)，因此已有越來越多的科研工作者將高分辨質(zhì)譜引用到獸藥殘留的檢測中來[14]。Q-TOF具有超高分辨率的精確質(zhì)量，可以在較低的濃度下作全譜掃描，提供精確質(zhì)量，將其與超高效液相聯(lián)用，可結(jié)合保留時間，對微量物質(zhì)進(jìn)行有效鑒別。由于牛奶種類較多，有些樣品基質(zhì)較復(fù)雜，飛行時間質(zhì)譜儀能夠精確測定化合物的相對分子質(zhì)量，適用于復(fù)雜樣品基質(zhì)中組分的準(zhǔn)確定性，因此作者采用Q-TOF高分辨質(zhì)譜技術(shù)，建立了牛奶中28種禁用獸藥殘留的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；離心機(jī)：德國Beckman公司產(chǎn)品。

甲醇，乙腈，甲酸，乙酸均為色譜純：美國Merck公司產(chǎn)品；乙酸銨為優(yōu)級純：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司產(chǎn)品；試驗用水為超純水：Millipore公司產(chǎn)品；OasisPRiMEHLB固相萃取柱：美國Waters公司產(chǎn)品。

標(biāo)準(zhǔn)品：地美硝唑、甲硝唑、洛硝達(dá)唑、左旋咪唑、西馬特羅、呋喃唑酮、沙丁胺醇、己烯雌酚、群勃龍、克倫特羅、磺胺乙氧噠嗪、氯丙嗪、呋喃它酮、氟甲砜霉素、脫氫可的松、甲基強(qiáng)的松龍、醋酸甲孕酮、紅霉素、依維菌素、甲苯達(dá)唑、甲基睪丸酮、青霉素G、丙酸睪酮、三氯苯咪唑、氫化潑尼松、苯丙酸諾龍、氯霉素、玉米赤霉醇（純度均≥98%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品。

配制標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：準(zhǔn)確稱取上述獸藥標(biāo)準(zhǔn)品0.0100 g于50 mL棕色容量瓶中，加適量甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為200 mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

配制混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取適量體積上述標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用空白樣品提取液稀釋成不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 儀器工作條件

液相色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）；柱溫 30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL；流量0.25 mL/min。正離子化模式下流動相：A為體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液，B為甲醇。負(fù)離子化模式下流動相：A為水溶液，B為甲醇。梯度程序均為：0～1 min，A 為 95%，1～8 min，A 由 95%線性降至5%，維持7 min，再回到初始平衡狀態(tài)保持6 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子化掃描模式，掃描范圍：m/z 100～1 000；毛細(xì)管電壓：4 000 V；鞘氣溫度：350 ℃，鞘氣流速：12 L/min；干燥氣溫度：325℃；干燥氣流速：6 L/min；霧化器壓力：45 psi；噴嘴電壓：750 V；碎裂電壓：130 V；為了保證質(zhì)量數(shù)精度，以嘌呤（m/z 121.050 873）和六（1H，1H，3H-全氟丙氧基）磷氮（m/z 922.009 798）作為基準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量校準(zhǔn)。28種藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

1.3 試驗方法

準(zhǔn)確稱取2.00 g均勻的牛奶試樣，置于15 mL塑料離心管中，加入8 mL體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸乙腈溶液，迅速搖勻，再置于超聲水浴中超聲提取10 min，然后以8 000 r/min高速離心10 min后。將上清液過Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，在50℃下用氮?dú)獯抵两?，?zhǔn)確加入1.0 mL甲醇-體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水溶液（V∶V=5∶95）溶解殘渣。用 0.2 μm 微孔濾膜過濾后，經(jīng)液相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀測定。最后按上述相同實驗操作步驟制備樣品空白提取液。

表1 28種藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 MS parameters of 28 veterinary drugs

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

流動相的恰當(dāng)選擇對改善分離效果以及質(zhì)譜的電離效率產(chǎn)生重要的作用，在正離子模式下，流動相中添加適量的酸，有助于提高化合物的離子化效率，因此試驗針對不同pH值的流動相（體積分?jǐn)?shù)1%乙酸水溶液、0.1%乙酸水溶液、1%甲酸水溶液、0.1%甲酸水溶液）進(jìn)行了考察，同時實驗比較了有機(jī)相甲醇和乙腈。實驗結(jié)果表明，當(dāng)流動相中酸度較高或不添加酸時，25種藥物的響應(yīng)反而偏小。當(dāng)在流動相中添加體積分?jǐn)?shù)0.1%甲酸后，25種藥物的離子化效率得到了提高，響應(yīng)明顯變大，分離效果較好。而選用甲醇或乙腈對25種藥物的離子化效率影響并不大，因此選擇甲醇-甲酸水溶液作為流動相效果較好。在負(fù)離子模式下，流動相中添加適量的堿，有助于提高化合物的離子化效率，但實際分析過程中，由于使用的Eclipse Plus C18色譜柱不適用于堿性流動相，因此，在負(fù)離子模式下，選擇甲醇—水溶液體系作為流動相，采用梯度洗脫方式可以更好地將3種化合物進(jìn)行分離，減少基質(zhì)干擾。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

吸取適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別在ESI正負(fù)離子模式下，在m/z 100～1 000范圍內(nèi)作一級質(zhì)譜全掃描分析，再選擇3種不同的碰撞電壓，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描分析，收集28種目標(biāo)化合物的保留時間、母離子精確相對分子質(zhì)量、質(zhì)量誤差、二級全掃描圖及質(zhì)譜碎片數(shù)據(jù)等信息，以此方法建立起完整的28種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜篩查譜庫。譜庫中應(yīng)包含28種目標(biāo)化合物的中英文名稱、CAS號、相對分子質(zhì)量以及二級碎片離子等信息，具體分析參數(shù)見表2。實驗再通過比較各化合物提取離子色譜峰的響應(yīng)值，分別優(yōu)化毛細(xì)管電壓、霧化器壓力、鞘氣溫度和流速、干燥氣溫度、碎裂電壓和流速等質(zhì)譜參數(shù)。28種藥物的提取離子色譜圖見圖1和圖2，以氟甲砜霉素為例，其一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖見圖3和圖4。

圖1 25種獸藥的提取離子色譜圖（正離子）Fig.1 Extracted ion chromatogram of 28 veterinary drugs standard solutions（ESI+）

圖2 3種獸藥的提取離子色譜圖（負(fù)離子）Fig.2 Extracted ion chromatogram of 3 veterinary drugs standard solutions（ESI-）

圖3 氟甲砜霉素一級質(zhì)譜圖Fig.3 MS spectrum of Florfeniol

圖4 氟甲砜霉素二級質(zhì)譜圖Fig.4 MS/MS spectrum of Florfeniol

2.3 樣品提取方法的選擇

在色譜分析過程中，樣品前處理的一般步驟包括提取、離心、濃縮、凈化等步驟。試驗采用不同濃度甲酸酸化的乙腈溶液作為提取溶劑，提取目標(biāo)化合物，同時沉淀蛋白。實驗選擇體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈作為3種不同提取液，同時比較了乙腈和樣品體積比為 2∶1、3∶1 和 4∶1分別提取凈化。試驗結(jié)果表明，當(dāng)采用體積分?jǐn)?shù)2%甲酸乙腈和樣品體積比為4∶1時蛋白沉淀效果最好，但是甲酸體積分?jǐn)?shù)太高對磺胺類等堿性化合物回收率影響較大，磺胺乙氧噠嗪的回收率偏高，可能是酸性條件下堿性化合物的離子化趨勢變大。因此實驗最終選用體積分?jǐn)?shù)0.2%甲酸乙腈，體積比4∶1加入樣品提取并沉淀蛋白，28種藥物的加標(biāo)回收率均在60%～120%之間。另外分別在轉(zhuǎn)速為3 000～8 000 r/min以及時間為1～15 min等情況下進(jìn)行試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)速達(dá)到8 000 r/min，時間達(dá)到10 min的條件下沉淀較完全，上清液比較澄清，轉(zhuǎn)速太小或者時間太短都會使樣品提取液沉淀不完全或者渾濁，影響到后續(xù)的檢測結(jié)果。

2.4 樣品凈化條件的選擇

由于牛奶中含有大量的蛋白以及非極性磷脂類干擾物，形成基質(zhì)干擾，因此必須對牛奶樣品進(jìn)行凈化處理，減少基質(zhì)效應(yīng)。分別選擇了Oasis PRiME HLB、C18、NH23種固相萃取小柱進(jìn)行試驗。實驗結(jié)果表明，采用Oasis PRiME HLB固相萃取小柱凈化樣品時，能有效去除磷脂等非極性干擾物，而且無需活化和平衡步驟，采用通過式凈化方式也極大地提高了樣品分析通量，達(dá)到快速篩查的目的。而C18和NH2固相萃取小柱不能滿足28種藥物的快速篩查分析。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

取空白牛奶樣品，分別加入不同濃度28種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗方法進(jìn)行樣品前處理，按儀器工作條件進(jìn)行測定，以28種藥物的質(zhì)譜峰面積為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過對空白樣品進(jìn)行添加回收試驗，用質(zhì)譜軟件進(jìn)行測定，確定了28種化合物在牛奶樣品基質(zhì)中的檢出限和定量下限，線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 28種藥物線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

序號 化合物名稱 線性回歸方程R2檢出限/（μg/kg） 定量限/（μg/kg）線性范圍/（μg/L）28依維菌素Y=124 368X-204 1450.995 25～501.55

2.6 回收試驗和精密度

回收率是反應(yīng)待測物在樣品分析過程中的損失的程度，損失越少，回收率越高。試驗通過向空白牛奶基質(zhì)樣品中添加低、中、高3個不同濃度水平的28種藥物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按相同試驗方法進(jìn)行測定，每一個添加水平重復(fù)測定10次來驗證方法的回收率。比較加入標(biāo)準(zhǔn)樣品后實際測得的含量和理論添加的含量，來計算加標(biāo)回收率，并計算測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

2.7 樣品分析

按本研究試驗方法對市售30種不同牛奶試樣進(jìn)行篩查分析，首先采集一級全掃描質(zhì)譜數(shù)據(jù)，利用本方法建立的質(zhì)譜譜庫進(jìn)行檢索分析，對一級質(zhì)譜檢測出的陽性樣品再采用二級質(zhì)譜掃描作進(jìn)一步的確證分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這些試樣中均未檢出這28種禁用藥物殘留，符合相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)的要求。

3 結(jié)語

在實際樣品分析過程中，結(jié)合超高效液相色譜的快速分析與飛行時間質(zhì)譜的高分辨率的特點(diǎn)，可非常迅速地篩查數(shù)百種不同化合物，尤其在獸藥殘留快速測定方面具有較強(qiáng)優(yōu)勢。作者建立的超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜測定牛奶中28種禁用獸藥殘留的快速檢測方法，前處理簡單、準(zhǔn)確性高、通量大，可應(yīng)用于牛奶中28種禁用獸藥殘留的快速定性篩查分析。

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Rapid Screening of 28 Banned Veterinary Drugs in Milk by Ultra Performance Liquid Chromatography Coupled with Quadrupole-Time of Flight Mass Spectrometry

YU Chenghua，LIN Lin，YANG Jinqing，SUN Yingyi，CHENG Shan，GE Yu
（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research，Shanghai 200233，China）

An analytical method was established for the simultaneous determination of 28 veterinary drugs in milk by ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry （UHPLC-Q-TOF-MS）．The analytes in milk samples were extracted with aeetonitrile containing 0.2%formic acid．The extract solution was purified by the solid phase extraction cartridge with Oasis PRiME HLB．The target compounds were separated on an Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 column by gradient elution using methanol-0.1%formic acid solution as mobile phase．And detected by MS in ESI+and ESI-mode．The 28 compounds could be separated in 20 min．As a result，the limits of quantitation （LOQ，S/N=10） of 28 compounds were 1～10 μg/kg in milk．The average recoveries of 28 compounds spiked at three concentration levels in the range of 68.9%～102.0%with relative standard deviations of 4.30%-11.5%．The accurate massdatabases of 28 compounds were established.

ultra performance Liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry（UHPLC-Q-TOF-MS），milk，veterinary drug，rapid screening

O 657.63

A

1673—1689（2017）10—1064—07

2015-12-21

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2014QK267）。

虞成華（1977—），男，江蘇通州人，高級工程師，從事食品檢測與化學(xué)分析研究。E-mail：yuchh@sqi.org.cn

虞成華，林琳，楊晉青，等.超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜法快速篩查牛奶中28種禁用獸藥殘留[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（10）：1064-1070.