百合助眠活性組分的篩選和分析

胡超群，徐德平

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

百合助眠活性組分的篩選和分析

胡超群，徐德平*

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

對(duì)百合助眠的活性組分進(jìn)行篩選并對(duì)有效成分進(jìn)行分析。用直接睡眠實(shí)驗(yàn)和延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)對(duì)百合助眠作用的有效成分進(jìn)行研究；用大孔樹(shù)脂、MCI等方法分離具有助眠作用的有效成分；用核磁共振對(duì)有效成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。百合的正丁醇提取物能顯著增加小鼠睡眠率、睡眠時(shí)間，促進(jìn)小鼠更快進(jìn)入睡眠。經(jīng)分離，得到的主要物質(zhì)結(jié)構(gòu)為（25R）-3β，17α-二羥基-5α-螺甾烷-6-酮-3-O-α-L-鼠李糖基-（1→2）-β-D-葡萄糖苷和（25R）-3β-羥基-5α-螺甾烷-6-酮-3-O-α-L-鼠李糖基-（1→2）-β-D-葡萄糖苷。百合的正丁醇提取物具有顯著助眠作用，其中具有助眠作用的主要物質(zhì)為甾體皂苷。

百合；助眠；有效成分

百合作為常用中草藥，最早收錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》。在我國(guó)，百合的食用和藥用歷史非常悠久，早在唐朝就開(kāi)始了百合的食用、藥用和種植。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有不少關(guān)于百合助眠作用的報(bào)道，特別是李衛(wèi)民等[1]、胡煥萍等[2]通過(guò)百合對(duì)戊巴比妥鈉小鼠睡眠時(shí)間影響的實(shí)驗(yàn)，證明了百合具有較好的鎮(zhèn)靜、催眠作用，但這些報(bào)道普遍缺乏對(duì)百合有效成分具體結(jié)構(gòu)的研究。因此，作者擬對(duì)百合不同提取物的助眠作用進(jìn)行研究，進(jìn)一步明確百合助眠作用的有效成分，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，研究百合助眠作用的構(gòu)效關(guān)系，為百合進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 供試品

百合：宜興市售產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

戊巴比妥鈉：上海將來(lái)實(shí)業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

核磁共振儀 （Brucker Avance 500）：德國(guó)Brucker公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠：18～22 g[3]，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備提取物

2.1.1 百合提取物的制備 將8 kg新鮮百合搗碎，放入提取罐，按料液質(zhì)量體積比1 g∶5 mL加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，于45℃下提取5～6 h，過(guò)濾取清液，殘?jiān)瓷鲜龇椒ㄖ貜?fù)提取兩次。合并3次提取的清液濃縮至無(wú)乙醇，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取并濃縮，得到百合的石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃取剩余相。用水提取剩余殘?jiān)?0℃提取5～6 h，過(guò)濾取清液濃縮，得到百合的水提物，將上述不同提取物冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 酸棗仁提取物的制備 按照文獻(xiàn)[4]中所述方法制備酸棗仁提取物。

2.2 百合活性成分的粗分離

將實(shí)驗(yàn)確定的百合具有助眠作用的活性成分提取物用AB-8型大孔樹(shù)脂柱進(jìn)行分離，用體積分?jǐn)?shù)為50%、70%和95%的乙醇洗脫，分別得到50%乙醇洗脫物（1）、70%乙醇洗脫物（2）和95%乙醇洗脫物（3）3個(gè)部分，濃縮并冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 百合活性成分的進(jìn)一步分離

大孔樹(shù)脂粗分離后經(jīng)實(shí)驗(yàn)確定具有活性成分的主要部分用 MCI柱（D 5 cm×100 cm）、ODS 柱（D 4 cm×100 cm）分離其中的單體物質(zhì)。

2.4 百合助眠作用實(shí)驗(yàn)

2.4.1 直接睡眠實(shí)驗(yàn) 取小鼠200只，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分成10組，每組20只，♀♂各半，分別灌胃給藥。灌胃劑量分別為：百合石油醚萃取物（A組）1 g/kg；百合乙酸乙酯萃取物（B組）1 g/kg；百合正丁醇萃取物（C組）1 g/kg；百合萃取剩余相（D組）1 g/kg；百合水提物（E組）1 g/kg；百合大孔樹(shù)脂體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗脫物（C1組）1 g/kg；百合大孔樹(shù)脂體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗脫物（C2組）1 g/kg；百合大孔樹(shù)脂體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗脫物（C3組）1 g/kg；陽(yáng)性對(duì)照組給酸棗仁提取物1 g/kg；空白對(duì)照組給等量生理鹽水。每天1次，連續(xù)給藥1周。1周后用監(jiān)控?cái)z像觀察并記錄：灌胃30 min后各組小鼠的睡眠率[4]；灌胃結(jié)束后12 h內(nèi)各組小鼠的睡眠時(shí)間。

2.4.2 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn) 取小鼠200只，體質(zhì)量18～22 g，隨機(jī)分成10組，每組20只，♀♂各半，分別灌胃給藥，灌胃劑量、頻率和時(shí)間同直接睡眠實(shí)驗(yàn)。最后一次灌胃結(jié)束30 min后，腹腔注射戊巴比妥鈉70 mg/kg，準(zhǔn)確觀察并記錄給藥時(shí)間和小鼠翻正反射消失時(shí)間[2，9]。

2.4.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)用SPSS23.0軟件進(jìn)行方差分析，測(cè)定其顯著差異性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 百合不同提取物助眠作用

百合不同提取物對(duì)小鼠睡眠率影響見(jiàn)表1，對(duì)小鼠睡眠時(shí)間和延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間影響見(jiàn)表2。

由表1可得出：在百合不同提取物中，C組的小鼠睡眠率最高，達(dá)到了80%，最接近陽(yáng)性對(duì)照組90%的睡眠率。表2結(jié)果表明：直接睡眠實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組比較，B、C、D和陽(yáng)性對(duì)照組均具有極顯著性差異；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，C組無(wú)極顯著性差異；延長(zhǎng)戊巴比妥鈉小鼠睡眠實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組比較，B、C、D和陽(yáng)性對(duì)照組均具有極顯著性差異；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，只有C組無(wú)極顯著性差異。

綜合表1表2的結(jié)果可以得出：B、C和D組均具有一定助眠作用，但C組助眠效果遠(yuǎn)好于B、D組，分析認(rèn)為B、D組與C組的成分有交叉，因此百合具有助眠作用的有效成分主要在C組，即正丁醇提取物中。

表1 百合不同提取物對(duì)小鼠睡眠率的影響Table 1 Effect of different Lily extracts on the sleep rate of mice

表2 百合不同提取物對(duì)小鼠睡眠時(shí)間及延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響Table 2 Effect of different Lily extracts on sleep time and prolonged pentobarbital sleep time of mice

3.2 大孔樹(shù)脂不同分離部分的助眠作用

大孔樹(shù)脂的不同分離部分對(duì)小鼠睡眠率的影響見(jiàn)表3，對(duì)小鼠睡眠時(shí)間和延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響見(jiàn)表4。

表3 大孔樹(shù)脂不同分離部分對(duì)小鼠睡眠率的影響Table 3 Effect of different macroporous resin separation section on the sleep rate of mice

表4 大孔樹(shù)脂不同分離部分對(duì)小鼠睡眠時(shí)間及延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響Table 4 Effect of different macroporous resin separation section on sleep time and prolonged pentobarbital sleep time of mice

由表3可得出：百合的不同分離部分中，C2組的小鼠睡眠率最高，為95%。表4結(jié)果表明：直接睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組比較，C1、C2和陽(yáng)性對(duì)照組有顯著差異；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，C2組無(wú)顯著差異。延長(zhǎng)戊巴比妥鈉小鼠睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)中，與空白對(duì)照組比較，C1、C2、C3和陽(yáng)性對(duì)照組均有顯著性差異；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，只有C2組無(wú)顯著性差異。

綜合表3表4結(jié)果可知：C2組助眠效果最好。因此百合具有助眠作用的主要活性成分在C2組即正丁醇提取物經(jīng)大孔樹(shù)脂用70%乙醇洗脫分離部分。

3.3 C2組功效成分的分析

從C2組分中分離得到A、B、C 3個(gè)單體成分。

3.3.1 A物質(zhì)分析 化合物A為白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇、乙醇等溶劑，體積分?jǐn)?shù)10%濃硫酸乙醇溶液顯紫紅色，Liebermann-Burchard反應(yīng)則顯墨綠色，Molish反應(yīng)成陽(yáng)性。表明該化合物為甾體皂苷類化合物，其13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）見(jiàn)表 5。

表5 化合物A、B的13C-NMR數(shù)據(jù)Table 5 13C-NMR date of compound A and B

結(jié)合其理化性質(zhì)和13C-NMR解析，并參照文獻(xiàn)[5，11]中的報(bào)道， 化合物 A 為：（25R）-3β，17α-二羥基-5α-螺甾烷-6-酮-3-O-α-L-鼠李糖基-（1→2）-β-D-葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 化合物A、B的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of compound A and B

3.3.2 B物質(zhì)分析 化合物B為白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇、乙醇等溶劑，體積分?jǐn)?shù)10%濃硫酸乙醇溶液顯紫紅色，Liebermann-Burchard反應(yīng)則顯墨綠色，Molish反應(yīng)成陽(yáng)性，表明該化合物為甾體皂苷類化合物，其13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）見(jiàn)表 5。

結(jié)合其理化性質(zhì)和13C-NMR解析，參照文獻(xiàn)[5，11]中的報(bào)道，化合物 B 為：（25R）-3β-羥基-5α-螺甾烷-6-酮-3-O-α-L-鼠李糖基-（1→2）-β-D-葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

3.3.3 C物質(zhì)分析 化合物C為油狀液體，易溶于甲醇、乙醇等溶劑，不溶于水，通過(guò)分析其理化性質(zhì)和核磁共振碳譜，化合物C為：亞麻酸甘油二酯。

4 結(jié)語(yǔ)

百合既有食用價(jià)值又有藥用價(jià)值，在清心安神、改善睡眠方面有其獨(dú)到作用。我國(guó)作為百合屬植物的原產(chǎn)大國(guó)，擁有極其豐富的種質(zhì)資源，但對(duì)于百合的開(kāi)發(fā)尚不完全，因此百合具有巨大的開(kāi)發(fā)潛力。

研究結(jié)果表明，百合的正丁醇提取物具有較好的助眠作用，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步分離得到3個(gè)化合物，其中兩個(gè)為甾體皂苷，一個(gè)為甘油二酯，其中甘油二酯不具有活性。通過(guò)王旭峰等[6]、陳百泉等[7]、馬進(jìn)杰等[8]的研究，表明酸棗仁中具有助眠作用的物質(zhì)為四環(huán)三萜類皂苷，通過(guò)Wang T等[10]的研究，表明百合中具有助眠作用的物質(zhì)也為皂苷，因此可以確定：百合中具有助眠作用的物質(zhì)為皂苷類化合物且這類皂苷為甾體皂苷。

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Screening and Analyzing of the Hypnotic Active Ingredients of Lilium lancifolium Thunb

HU Chaoqun，XU Deping*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To screen and analyze the hypnotic active ingredients of Lilium lancifolium Thunb.Methods：Direct sleep experiment and prolonged pentobarbital sleeping time experiment are used to study the hypnotic active ingredients of Lilium lancifolium Thunb.The hypnotic active ingredients are separated by separation column like macroporous resin column and MCI column.Magnetic resonance imaging（MRI） is used to identify the structure of active ingredients.The n-butanol extract of Lilium lancifolium Thunb can increase the rate and time of sleep，accelerate the sleep of mice.By separating，the main structure ofthe active ingredients are （25R）-3β，17α-dihydroxy-5αspirostan-6-one-3-O-α-L-Rhamnopyranosyl- （1→2）-β-D-glucopyranoside and（25R）-3β-hydroxy-5α-spirostan-6-one-3-O-zα-L-Rhamnopyranosyl- （1 →2）-β-D-glucopyranoside.The n-butanol extract of Lilium lancifolium Thunb has significant hypnotic effect and the structure of its main ingredients are saponins.

Lilium lancifolium Thunb，hypnotize，active ingredients

R 284.2

A

1673—1689（2017）10—1096—05

2015-09-30

*通信作者：徐德平（1965—），男，安徽宣城人，工學(xué)博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)研究。E-mail：xdp1219@sina.com

胡超群，徐德平.百合助眠活性組分的篩選和分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（10）：1096-1100.