白腐真菌發(fā)酵罐產(chǎn)漆酶條件的優(yōu)化

劉海霞　張力　喬梁

摘要：選取黃孢原毛平革菌作為漆酶的生產(chǎn)菌株，分別研究攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、培養(yǎng)溫度、接種量和培養(yǎng)基初始pH值對(duì)發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)漆酶的影響；并在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)研究黃孢原毛平革菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶的最佳條件。結(jié)果表明，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)漆酶產(chǎn)量影響最大，產(chǎn)漆酶的最優(yōu)條件如下：溫度28 ℃、轉(zhuǎn)速300 rmin、通氣量 5 Lmin（通氣比10 vvm）、培養(yǎng)基初始pH值5、接種量15%，得到最高產(chǎn)漆酶水平1486 UmL。

關(guān)鍵詞：白腐真菌；黃孢原毛平革菌；發(fā)酵罐；漆酶；工業(yè)化生產(chǎn)；優(yōu)化條件

中圖分類號(hào)： S188+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0305-03

收稿日期：2017-04-03

基金項(xiàng)目：江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院項(xiàng)目（編號(hào)：NSFPT201601）。

作者簡(jiǎn)介：劉海霞（1974—），女，山東泰安人，博士，副教授，主要從事草食動(dòng)物生產(chǎn)研究。E-mail：153558193@qqcom。

農(nóng)作物秸稈是一種來源廣泛、成本低廉的飼料原料，但其中難以降解的木質(zhì)素降低了其作為飼料的飼喂價(jià)值。因此在處理秸稈使其飼料化過程中，降解木質(zhì)素成為了極為關(guān)鍵的一點(diǎn)。白腐真菌是一種能夠釋放木質(zhì)素和其他木質(zhì)組分的降解酶1]。目前，關(guān)于白腐真菌所產(chǎn)生的木質(zhì)素降解酶研究最多的主要有錳過氧化物酶（manganede peroxidase，MnP）、木質(zhì)素過氧化物酶（lignin peroxidse，LiP）和漆酶（laccase）2-3] 3種。漆酶是一類多酚氧化酶，產(chǎn)生于白腐菌的次生代謝階段，是木質(zhì)素降解過程中的關(guān)鍵酶，難以獲得較高的產(chǎn)量，這也是限制漆酶廣泛應(yīng)用的主要原因。本研究選取對(duì)秸稈降解效果較好的黃孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium），在5 L的機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中進(jìn)行白腐真菌產(chǎn)漆酶試驗(yàn)，探究攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、溫度、pH值等主要因素對(duì)2種黃孢原毛平革菌的產(chǎn)漆酶影響，為工業(yè)化生產(chǎn)以及農(nóng)作物秸稈的有效利用提供依據(jù)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

111試驗(yàn)菌株

黃孢原毛平革菌株由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

112試驗(yàn)培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，自然pH值。液體發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：去皮馬鈴薯200 g，煮沸30 min，紗布過濾，加入20 g蔗糖，融化后補(bǔ)水至1 000 mL，自然pH值，加入10 g葡萄糖，100 mL分裝250 mL三角瓶，121 ℃間歇滅菌。

113試驗(yàn)主要儀器和設(shè)備

高壓滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司，YXQ-LS-50SⅡ）；生化培養(yǎng)箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司，SHP-160）；數(shù)顯恒溫振蕩器（上海梅香儀器有限公司，THZ-82A）；發(fā)酵罐（江蘇省鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司，GBJT-7C）；無油空氣壓縮機(jī)（ZW-0057-X）；儲(chǔ)氣罐（浙江省臺(tái)州市富芳?jí)嚎s機(jī)有限公司）。

12試驗(yàn)方法

121菌種活化

取4株斜面種子管分別接種于PDA培養(yǎng)基上，28 ℃倒置培養(yǎng)5 d。

122種子液制備

選取菌絲長(zhǎng)勢(shì)旺盛的平板，取菌苔前端接種于液體種子培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫?fù)u床（160 rmin）培養(yǎng) 3～5 d，至長(zhǎng)出可見的白色菌絲球，即可作為種子液使用。

123接種及發(fā)酵罐產(chǎn)酶培養(yǎng)

待液體培養(yǎng)基冷卻后，在火焰保護(hù)下打開接種口，將培養(yǎng)好的種子液按比例投放入發(fā)酵罐內(nèi)。按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件，在發(fā)酵罐控制器觸控板上設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、溫度、pH值等參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

124漆酶活性的測(cè)定

每隔24 h取培養(yǎng)液，紗布過濾，4 000 rmin 條件下離心得粗酶液4]，用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定酶活性5]，觀察各因素對(duì)漆酶分泌的影響。

125多因素正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取其中對(duì)黃孢原毛平革菌發(fā)酵罐中產(chǎn)漆酶活性影響較大的因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，分別測(cè)定不同因素水平組合條件下的酶活性，進(jìn)行多因素共同作用下的優(yōu)化組合。

2結(jié)果與分析

21單因素試驗(yàn)結(jié)果

211發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速對(duì)漆酶分泌的影響結(jié)果

其他條件不變，測(cè)定發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速分別為200、250、300、350、400 rmin條件下的漆酶活性，結(jié)果見表1。由表1可知，發(fā)酵罐中液體發(fā)酵過程中，攪拌速度以300 rmin較適合黃孢原毛平革菌進(jìn)行漆酶的分泌，從發(fā)酵第1天起各因素間逐漸出現(xiàn)差異，第4 天起其產(chǎn)酶活性相對(duì)其他水平有顯著升高，最高在發(fā)酵的第7天出現(xiàn)，平均為9783 UmL，并且較其他轉(zhuǎn)速酶活性水平差異顯著。試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵罐在轉(zhuǎn)速過低時(shí)，發(fā)酵過程中攪拌的剪切力較弱，導(dǎo)致菌絲體生長(zhǎng)過度，菌液黏稠，影響發(fā)酵液內(nèi)小環(huán)境，氧分和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分布不均，從而影響菌體細(xì)胞正常的代謝分泌產(chǎn)酶；發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速過高時(shí)，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的剪切力過強(qiáng)，會(huì)影響菌絲體的生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致菌絲體細(xì)胞的破裂，不能正常進(jìn)行酶的分泌，產(chǎn)酶水平下降，同時(shí)過高的攪拌轉(zhuǎn)速，對(duì)于設(shè)備的要求高， 且對(duì)于能源有過多的消耗，生產(chǎn)過程中成本過高，不利于規(guī)?；l(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。

212通氣量對(duì)發(fā)酵罐中漆酶分泌的影響結(jié)果

其他條件不變，分別在通氣量為3、4、5、6、7 Lmin條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，觀察通氣量對(duì)漆酶分泌的影響，結(jié)果見表2。從表2可以看出，通氣量相對(duì)轉(zhuǎn)速對(duì)于產(chǎn)酶水平的影響略低，在發(fā)酵后第4 天開始不同通氣量間大部分表現(xiàn)出顯著差異，其中發(fā)酵后第5、第6天在通氣量為6 、7 Lmin時(shí)產(chǎn)酶水平差異不顯著。在通氣量為5 Lmin時(shí)，漆酶活性最高，第7天出現(xiàn)最高活性9180 UmL，遠(yuǎn)高于在其他條件下的漆酶活性。不同通氣量的產(chǎn)酶水平在前4 d差異均不明顯，證明通氣量對(duì)產(chǎn)酶水平的影響小于轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)酶水平的影響，其產(chǎn)酶的前低后高的特點(diǎn)也符合白腐真菌生產(chǎn)漆酶的時(shí)間順序。黃孢原毛平革菌發(fā)酵過程是一個(gè)好氧發(fā)酵過程，因此當(dāng)通氣量過低時(shí)，會(huì)影響菌絲體在前期的生長(zhǎng)，從而影響后期的產(chǎn)酶水平；當(dāng)通氣量過高時(shí)，會(huì)有大量泡沫產(chǎn)生，影響菌絲體后期安靜產(chǎn)酶，同時(shí)通氣裝置的連續(xù)高強(qiáng)度運(yùn)轉(zhuǎn)，增加了整個(gè)發(fā)酵過程的能耗，對(duì)設(shè)備也提出了更高的要求，因此最適通氣量為5 Lmin，轉(zhuǎn)換為通氣比為10 vvm。endprint

213溫度對(duì)發(fā)酵罐中漆酶分泌的影響結(jié)果

其他條件不變，分別在溫度為26、28、30、32、34 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，觀察溫度對(duì)漆酶分泌的影響，結(jié)果見表3。從表3可以看出，與轉(zhuǎn)速和通氣量相比，溫度對(duì)于產(chǎn)酶的影響相對(duì)較小，不同溫度下的產(chǎn)酶水平始終有不顯著差異存在。當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)，發(fā)酵的第7天漆酶活性達(dá)到最高，為8880 UmL；其次為 30 ℃，達(dá)到8770 UmL；34 ℃條件下產(chǎn)酶水平最低，為 7640 UmL，說明28 ℃為黃孢原毛平革菌的最適發(fā)酵溫度。但有研究報(bào)道，在南方地區(qū)夏季比較炎熱，當(dāng)設(shè)定發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，發(fā)酵設(shè)備須要供應(yīng)冷水進(jìn)行發(fā)酵液的降溫處理，增加生產(chǎn)成本，同時(shí)對(duì)設(shè)備也提出了更高的要求，因此在實(shí)際生產(chǎn)過程中應(yīng)從適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)水平的效率上綜合考慮。

214pH值對(duì)發(fā)酵罐中漆酶分泌的影響結(jié)果

其他條件不變，分別在培養(yǎng)基初始pH值為40、45、50、55、60條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，觀察培養(yǎng)基pH值對(duì)漆酶分泌的影響，結(jié)果見表4。表4表明，培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)于漆酶的分泌影響并不大，不同水平間產(chǎn)生的差距不明顯。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為50時(shí)，黃孢原毛平革菌活性在發(fā)酵后第7天達(dá)到最高水平，為9253 UmL，較其他產(chǎn)酶水平差異顯著，pH值過高或過低均會(huì)使產(chǎn)酶水平降低。培養(yǎng)基pH值過小時(shí)，酸度過大，菌體生長(zhǎng)困難，影響產(chǎn)酶水平；當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值為弱酸性時(shí)，菌體生長(zhǎng)不受影響。

215接種量對(duì)發(fā)酵罐中漆酶分泌的影響

其他條件不變，分別在接種量為5%、10%、15%、20%、25%條件下進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，觀察黃孢原毛平革菌接種量對(duì)漆酶分泌的影響，結(jié)果見表5。由表5得知，當(dāng)接種量為15%時(shí)，發(fā)酵后第7天產(chǎn)酶水平達(dá)到了最高，為9657 UmL，較其他產(chǎn)酶水平差異顯著。在發(fā)酵的第5天，各水平間開始出現(xiàn)相互的顯著性差異。試驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，菌種接種量過低，不能充分利用培養(yǎng)基中的養(yǎng)分， 無法達(dá)到最高產(chǎn)酶水平；接種量過高，空間和營(yíng)養(yǎng)的匱乏反而影響了菌絲體的生長(zhǎng)，從而使產(chǎn)酶水平降低。

22多因素正交試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)合單因素影響的試驗(yàn)結(jié)果，選取攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量、pH值、接種量作為影響白腐真菌發(fā)酵罐中產(chǎn)漆酶活性的主要因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，因素水平見表6，試驗(yàn)結(jié)果見表7。

從表7可以看出，多因素正交優(yōu)化試驗(yàn)最優(yōu)組合為A2B2C2D2，即轉(zhuǎn)速為300 rmin、通氣量為5 Lmin（通氣比 10 vvm）、pH值為5、接種量為15%，此結(jié)果與單因素結(jié)果相符合。從極差分析來看，影響最大的因素為轉(zhuǎn)速，其次為通氣量，pH值對(duì)產(chǎn)酶水平的影響相對(duì)最小，該結(jié)果符合單因素試驗(yàn)結(jié)果。

3討論與結(jié)論

本研究通過單因素和多因素正交試驗(yàn)對(duì)黃孢原毛平革菌在發(fā)酵罐中液體發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，綜合考慮產(chǎn)酶水平與大規(guī)模生產(chǎn)的實(shí)際條件和成本，得出黃孢原毛平革菌最佳發(fā)酵生產(chǎn)漆酶條件：溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速320 rmin、通氣量5 Lmin（通氣比10 vvm）、pH值5、接種量15%。由試驗(yàn)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵罐的旋轉(zhuǎn)攪拌和通氣改善了搖瓶發(fā)酵氧氣量少和菌液不均勻的缺點(diǎn)，使培養(yǎng)基得到充分的養(yǎng)分，白腐真菌液體發(fā)酵前期主要是菌絲體生長(zhǎng)，產(chǎn)酶水平較低，后期為產(chǎn)酶時(shí)期，產(chǎn)酶水平上升且不同條件下差異顯著。這與近年來研究報(bào)道相符合，通過最優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，最終得到黃孢原毛平革菌最高產(chǎn)漆酶水平，為1486 UmL，與前期韋麗敏等搖瓶?jī)?yōu)化試驗(yàn)結(jié)果6]相比提高320%。

目前漆酶的產(chǎn)量及生產(chǎn)成本在實(shí)際生產(chǎn)中還不容樂觀，絕大多數(shù)都是在搖瓶中或規(guī)模很小的反應(yīng)器中利用微生物生產(chǎn)漆酶，難以大規(guī)模地生產(chǎn)，因此發(fā)酵罐試驗(yàn)條件的好壞決定了規(guī)模生產(chǎn)的成敗。

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