液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)微生物菌群高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子

*

(1.河北科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018；2. 天津城建大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，天津 300384)

液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)微生物菌群高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子

劉云曼1李亞靜2張燕2宋圓圓2牛文鈺1廉靜1*郭建博2

(1.河北科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018；2. 天津城建大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，天津 300384)

建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)定量檢測(cè)高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子的方法。利用群體感應(yīng)規(guī)律揭示顆粒污泥反應(yīng)器快速啟動(dòng)機(jī)制。本方法首先取自反應(yīng)器的活性污泥經(jīng)離心分離，用乙酸乙酯萃取，旋轉(zhuǎn)蒸干后經(jīng)甲醇溶解定容可直接進(jìn)樣測(cè)量；然后選取C18(50mm×4.6mm,1.8μm)色譜柱進(jìn)行分離，甲醇與水(含0.1%甲酸)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧正離子模式(ESI+)電離，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行定性定量測(cè)定，分析時(shí)間為8.5min。對(duì)7種AHLs檢測(cè)的結(jié)果表明，在10～1000μg/L的范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢出限為310μg/L，在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為96.57%～122.70%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%～5.87%。

厭氧氨氧化 信號(hào)分子 酰基高絲氨酸內(nèi)酯 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜

群體感應(yīng)是細(xì)胞間進(jìn)行通信且協(xié)調(diào)生理過(guò)程的行為，發(fā)生在細(xì)胞群體水平，依賴于細(xì)胞密度的變化。微生物細(xì)胞間的交流通過(guò)檢測(cè)微生物分泌的化學(xué)信號(hào)、電信號(hào)等進(jìn)行分析[3]。信號(hào)分子是微生物用于細(xì)胞交流而分泌的一類特殊的菌體代謝產(chǎn)物，是群體感應(yīng)中的重要媒介，且在不同種類的菌體間具有通用性[4]。當(dāng)信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定的閾值時(shí)可調(diào)控基因的表達(dá)[5]，如毒性因子的表達(dá)、抗生素和胞外酶的產(chǎn)生、細(xì)胞膜的生成等[6-9]。

群體感應(yīng)中細(xì)菌分泌的信號(hào)分子主要有三類：革蘭氏陰性菌分泌的帶不同?；鶄?cè)鏈的高絲氨酸內(nèi)酯類(AHLs)；革蘭氏陽(yáng)性菌分泌的寡肽類(AIP)；革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌均可分泌的2號(hào)誘導(dǎo)物類(AI-2)，種內(nèi)和種間交流均可使用的特異性交流信號(hào)[1,6,7, 10]。厭氧氨氧化菌為革蘭氏陰性菌，分泌AHLs類信號(hào)分子。由于微生物產(chǎn)生的信號(hào)分子的濃度極低，檢測(cè)困難，探索合適的檢測(cè)信號(hào)分子的方法很有意義。

檢測(cè)信號(hào)分子的方法有多種，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法有利用生物傳感菌作為傳感器來(lái)檢測(cè)AHLs的存在；還有利用薄層層析與生物感應(yīng)器相結(jié)合的方法檢測(cè)AHLs的種類[11, 12]，但是無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。近年來(lái)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)作為新的檢測(cè)方法被用來(lái)檢測(cè)信號(hào)分子的存在[11]，有關(guān)利用此技術(shù)測(cè)定反硝化顆粒污泥快速啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)器過(guò)程中信號(hào)分子的研究尚未有報(bào)道。本研究以7種AHLs(C4、C6、C8、3-OXO-C8、C10、C12、C14)為標(biāo)樣，在低濃度條件下，建立了HPLC-MS對(duì)復(fù)雜菌群信號(hào)分子的快速檢測(cè)和定量分析方法，對(duì)厭氧氨氧化菌和反硝化菌分泌的信號(hào)分子進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)顆粒污泥群體感應(yīng)規(guī)律，揭示反硝化顆粒污泥快速啟動(dòng)厭氧氨氧化反應(yīng)器的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 6410B液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司； RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

N-丁基高絲氨酸內(nèi)酯(C4-HSL),N-己基高絲氨酸內(nèi)酯(C6-HSL),N-辛基高絲氨酸內(nèi)酯(C8-HSL)，N-OXO-辛基高絲氨酸內(nèi)酯(3-OXO-HSL),N-癸?；呓z氨酸內(nèi)酯(C10-HSL), N-十二烷基高絲氨酸內(nèi)酯(C12-HSL),N-十四基高絲氨酸內(nèi)酯(C14-HSL)(7種信號(hào)分子結(jié)構(gòu)式見圖1)的標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲醇、甲酸(色譜純)，乙酸乙酯(分析純)，購(gòu)自天津市化學(xué)試劑供銷公司。用甲醇溶解標(biāo)準(zhǔn)品，配制成250mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20℃存儲(chǔ)備用。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

圖1 7種AHLs結(jié)構(gòu)式

1.2 樣品前處理

實(shí)驗(yàn)樣品取自本實(shí)驗(yàn)室利用UASB反應(yīng)器培養(yǎng)馴化的厭氧氨氧化污泥[13]，此污泥利用反硝化顆粒污泥摻雜少量的厭氧氨氧化污泥的馴化方法培養(yǎng)。取30mL顆粒污泥與出水的混合樣品用研缽搗碎后超聲破碎2min，在17000g/min離心10min，取上清液過(guò)0.45μm的濾膜后，用等量的乙酸乙酯萃取3次，取上層有機(jī)相旋轉(zhuǎn)蒸干[14, 15]，用甲醇定容至2mL，HPLC-MS/MS分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1色譜條件

C18色譜柱(安捷倫公司，50mm×4.6mm,1.8μm)，柱溫35℃，流速300μL/min，進(jìn)樣體積10μL，分析時(shí)間8.5min；流動(dòng)相：A為甲醇，B為含有0.1%甲酸的超純水。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫參數(shù)

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子掃描模式(ESI+)，多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)；電噴霧電壓：4000V；離子源溫度：350℃；霧化氣壓力：40psi,載氣為N2，流量9L/min。粉碎電壓：60～105V；碰撞能：10eV；倍增電壓：200 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

分別選用甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以甲醇-水為流動(dòng)相得到的色譜圖分離效果較好。同時(shí)，在流動(dòng)相中加入0.1%的甲酸提高了檢測(cè)的靈敏度，降低了檢出限和定量限。在上述選定的條件下對(duì)AHLs分析檢測(cè)，得到7種AHLs的色譜圖(圖2)，樣品在8.5min可完全分離。

圖2 7種AHLs色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用MRM模式對(duì)粉碎電壓、碰撞能、母離子和兩對(duì)子離子等條件進(jìn)行優(yōu)化，7種信號(hào)分子優(yōu)化后的條件見表2。

表2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下7種AHLs優(yōu)化后的質(zhì)譜條件

2.3 線性關(guān)系和檢出限

用甲醇配制7種信號(hào)分子的混合標(biāo)準(zhǔn)液，設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度梯度，標(biāo)準(zhǔn)系列分別為10、20、50、 100、500和1000μg/L。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子m/z102的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果表明，在10～1000μg/L的范圍內(nèi)，7種信號(hào)分子濃度與對(duì)應(yīng)的峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.997。以S/N=3計(jì)算出的檢出限為2～3μg/L，以S/N=10計(jì)算出的定量限為6.7～20μg/L(見表3)。

表3 7種AHLs的線性關(guān)系和檢出限及定量限

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

向待測(cè)樣中分別加入20μg/L、100μg/L和500μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)液，對(duì)低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)量6次，根據(jù)峰面積計(jì)算回收率，結(jié)果如表4。7種信號(hào)分子的平均回收率為96.6%～122.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.21%～5.87%。

表4 7種AHLs的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 實(shí)際樣品的分析

從實(shí)際運(yùn)行的厭氧氨氧化反應(yīng)器和反硝化反應(yīng)器中取20g濕污泥，按1.2所述的方法對(duì)泥樣進(jìn)行前處理后，檢測(cè)兩種微生物分泌的信號(hào)分子，檢測(cè)結(jié)果表明Anammox確實(shí)存在群體感應(yīng)系統(tǒng)。如圖3所示，利用反硝化污泥摻雜少量的厭氧氨氧化污泥培養(yǎng)馴化的厭氧氨氧化顆粒污泥與反硝化顆粒污泥分泌相同種類的信號(hào)分子，通過(guò)圖3可以看出兩種微生物分泌的C8-HSL與3-OXO-C8-HSL的量基本相同。但是對(duì)于C10-HSL和C12-HSL，反硝化菌的分泌量明顯高于厭氧氨氧化菌，由此推測(cè)可能是C10-HSL和C12-HSL兩種信號(hào)分子共同起作用，觸發(fā)某種群體感應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了反硝化菌與厭氧氨氧化菌之間的“語(yǔ)言交流”，促進(jìn)了厭氧氨氧化反應(yīng)器的快速啟動(dòng)，此推論需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

圖3 Anammox與反硝化菌釋放的AHLs的含量

3 結(jié)論

本研究建立高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)高絲氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子。通過(guò)對(duì)檢測(cè)條件的優(yōu)化，能夠?qū)π盘?hào)分子進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的定量分析。同時(shí)，應(yīng)用此檢測(cè)方法對(duì)反應(yīng)器中實(shí)際的厭氧氨氧化和反硝化顆粒污泥樣品進(jìn)行分析測(cè)定，證明anammox確實(shí)存在群體感應(yīng)系統(tǒng)，而且兩種微生物能夠分泌相同種類的信號(hào)分子，為進(jìn)一步揭示二者協(xié)同作用關(guān)系提供了理論依據(jù)，也為其它種類信號(hào)分子的檢測(cè)提供了技術(shù)支撐。

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SimultaneousdeterminationofsevenN-acyl-homoserinelactone(AHLs)secretedusingbacteriabyHPLC-MS/MS.

LiuYunman1,LiYajing2,ZhangYan2,SongYuanyuan2,NiuWenyu1,LianJing1*,GuoJianbo2

(1.HebeiUniversityofScienceamp;Technology,Shijiazhuang050018,China；2.TianjinChengjianUniversity,Tianjin300384,China)

The activated sludge from the reactor was separated by centrifugation and extracted with ethyl acetate, and the sample was directly measured by dissolution of methanol after the rotary drying. C18- (50mm × 4.6mm, 1.8μm) column was selected as a HPLC column while methanol and water (containing 0.1% formic acid) were used as the mobile phase for gradient elution. Electrospray ionization mode (ESI _+) ionization and multiple reaction monitoring (MRM ) model were used for qualitative and quantitative determination.The analysis time was 8.5min. The results of the seven AHLs showed that the detection limit was 3-10μg/L, and the recoveries were 96.57%-122.70% at the three levels of low, medium and high. The relative standard deviations (RSDs) were 0.21%-5.87%. The linearship was good in the range of 10-1000μg/L.

anammox; signal mocelule; acyl-homoserine lactones;HPLC-MS/MS

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 51678387)；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目，

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.05.005

2017-05-08

劉云曼，女，1993年出生，研究生，E-mail:ydmb1993@163.com。