離子色譜-質譜聯(lián)用法檢測咖啡豆中的典型單糖和小分子寡糖

(1.青島理工大學，青島 266033；2.山東出入境檢驗檢疫局，青島266002；3.青島舜宇恒平儀器有限公司，青島266109；4.中國海洋大學，青島266100；5.青島出入境檢驗檢疫局，青島266000；)

儀器應用

離子色譜-質譜聯(lián)用法檢測咖啡豆中的典型單糖和小分子寡糖

張濤1，2蔡峰2，3崔鶴2*馬繼平1朱倩林4胡東青5

(1.青島理工大學，青島 266033；2.山東出入境檢驗檢疫局，青島266002；3.青島舜宇恒平儀器有限公司，青島266109；4.中國海洋大學，青島266100；5.青島出入境檢驗檢疫局，青島266000；)

建立了離子色譜-質譜聯(lián)用技術測定咖啡豆中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖的分析方法。將樣品粉碎后加入去離子水超聲提取，經(jīng)CarbopacTMPA20(3*150mm)色譜柱分離，以EGC(自動淋洗液發(fā)生器)在線產(chǎn)生KOH為淋洗液，梯度淋洗，流速0.38mL/min，抑制器采用外加水模式，采用柱后補液法(Na+源)，串聯(lián)質譜進行檢測。結果表明，在一定的質量濃度范圍內，上述單糖和小分子寡糖的色譜峰面積與質量濃度呈線性相關，線性相關系數(shù)(r)均大于0.999，樣品的加標回收率均落在88.0～97.7%范圍內，相對標準偏差均在2.36～3.70%之間(n=6)。該方法充分解決了含碳量不同的糖之間的假陽性問題，方法簡便、快速、準確,可推廣應用于咖啡豆中典型單糖和小分子寡糖的同時測定。

離子色譜-質譜(IC-MS) 咖啡豆 單糖 寡糖

中國人促使咖啡從神飲藥飲轉變?yōu)榇蟊娦蓍e飲料[1]，咖啡以其獨特的風味口感以及醒腦提神、抗憂郁等獨特的生理活性成為世界上最常飲用的飲料之一[2]。鑒于咖啡豆中糖的成分和含量的不同會對咖啡的香氣和口感產(chǎn)生一定的影響[3]，因此，咖啡豆中糖的含量需要進行嚴格的檢測。

咖啡豆中主要含有的糖為單糖和小分子寡糖兩大類。單糖就是不能再水解的糖類，是構成各種二糖和多糖分子的基本單位，常見的單糖如葡萄糖、果糖、木糖等[4]。寡糖又稱低聚糖，為兩個或兩個以上(一般指2～10個)單糖單位以糖苷鍵相連形成的糖分子，常見的寡糖有蔗糖、麥芽糖、乳糖等[5]。目前，單糖和小分子寡糖的測定方法主要有液相色譜-蒸發(fā)光檢測或示差熒光檢測法[6-8]、離子色譜-安培檢測器法[9，10]等，但上述方法存在靈敏度差、部分糖分離度差等缺點[11]。美國官方分析化學師協(xié)會(Association of Analytical Communities，AOAC)頒布的《AOAC 995. 13-速溶咖啡中的糖》標準中，對咖啡制品中糖的分析就存在木糖與甘露糖之間相互干擾的問題。近年來，質譜技術的發(fā)展為單糖和小分子寡糖的準確分析提供了強有力的技術支撐。本研究方法采用離子色譜對咖啡豆樣品進行初步分離，然后進質譜檢測(檢測原理流程圖見圖1)，充分解決了含碳量不同的糖之間的假陽性問題，方法準確性高，分離度好，可推廣應用于咖啡豆中典型單糖和小分子寡糖的同時測定。

圖1 檢測原理流程圖

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ICS5000+型離子色譜儀(Thermo)，配有EGC淋洗液自動發(fā)生器、電導檢測器和Chromeleon6.80色譜工作站；4000 Q Trap三重四級桿質譜系統(tǒng)(AB SCIEX)，配有ESI(電噴霧離子源)和Analyst1.6.2工作站；Milli-Q A10型超純水純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)；粉碎機(浙江大德機械)；渦旋混合器(德國IKA)；高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；Pump 11 Elite 注射泵(HARVARD)。

阿拉伯糖(arabinose)、半乳糖(galactose)、葡萄糖(glucose)、蔗糖(sucrose)、木糖(xylose)、甘露糖(mannose)、果糖(fructose)、核糖(ribose)8種糖標準品(純度均大于98%，購自Aladdin分析標準品)；三水合乙酸鈉(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，乙腈(色譜純，Merck)。

1.2 標準溶液配置

準確稱取糖標準品0.1g(精確到0.01g)，置于100mL容量瓶中，用去離子水定容至刻度線，得到濃度為1000mg/L的標準儲備液，然后去離子水逐級稀釋配置0.05～5.00mg/L的標準工作溶液。溶液均由電阻率為18.2MΩ.cm超純水配制。所有標準溶液均在4℃下保存，當天使用。

1.3 實際樣品制備

取咖啡豆樣品適量，在粉碎機上粉碎，取粉碎后的樣品 0.1g(精確到0.01g)，加入49.90g 去離子水，30攝氏度條件下震蕩搖勻 20 min，5000r/min 離心 5min，取上層清夜過0.22μm 的微孔濾器后再過SPE柱(Agilent SAMPLIQ C18)，過濾后的待測溶液再分別稀釋2倍*和100倍*后，直接進樣分析。

*說明：實驗發(fā)現(xiàn)，咖啡豆樣品中蔗糖和其它7種待測糖相比，含量特別高，為保證檢測數(shù)據(jù)的準確性，選擇將咖啡豆樣品待測液再稀釋100倍后單獨檢測蔗糖；其它7種糖樣品待測液再稀釋2倍后直接進樣分析。

1.4 色譜和質譜條件

(1)色譜條件

色譜柱：DionexCarbopacTMPA20分析柱(3*150mm)，DionexCarbopacTMPA20保護柱(3*30mm)，柱溫30℃，KOH淋洗液梯度洗脫程序見表1，流速0.38mL/min，進樣量25μL， AERS 500 2mm抑制器(Thermo)，抑制器采用外加水方式，再生流速為0.4mL/min，抑制電流120mA。

NE向斷裂組：這組斷裂在區(qū)內最為發(fā)育，帶內主要發(fā)育角礫巖或糜棱巖，該組斷裂被后期斷裂帶切穿，構成網(wǎng)格狀，帶內具有硅化、碳酸鹽化及弱鉀化，平面上呈舒緩波狀，產(chǎn)狀傾向60°～90°，傾角30°～60°。

表1 淋洗液梯度洗脫程序

(2)質譜條件

電噴霧正離子模式(ESI+)，源溫度550℃，離子源GS1：30psi，離子源GS2：50psi，離子化電壓4500eV；采集模式：選擇離子檢測(selected ion monitor，SIM)；氣簾氣(CUR)10psi；掃描時間200ms；其他條件見表2。

表2質譜檢測條件

物質定量離子([M+Na+])DP電壓(V)阿拉伯糖173270半乳糖203245葡萄糖203260蔗糖3652110木糖173270甘露糖203260果糖203260核糖173245

2 結果與分析

2.1 色譜質譜條件的優(yōu)化

色譜柱和淋洗液梯度程序選擇:DionexCarbopacTMPA20分析柱(3*150mm，Thermo)在OH-流動相體系下可以快速有效地分離糖醇、單糖、雙糖和低聚糖，無需衍生化,可滿足該次實驗要求，但PA20柱子在低濃度洗脫條件下，隨著實驗進行，出峰時間不斷前飄，為保證上述8種待測糖較好的分離度，同時避免因出峰時間前飄對實驗的干擾，經(jīng)實驗摸索，選擇了前20分鐘低淋洗液濃度洗脫，待測物全部出峰后，選用高濃度淋洗液對色譜柱進行再生的方法(詳細洗脫程序見表1)，該方法有效避免了PA20色譜柱在低濃度洗脫條件下出峰時間前飄的問題,確保了實驗數(shù)據(jù)的準確性。

抑制器可以有效降低鹽類等物質對待測物的干擾，同時防止質譜檢測器被污染。抑制器選擇AERS 500 2mm型，抑制電流選擇120mA，抑制效果較好。

質譜檢測選擇電噴霧(ESI)離子源，正離子模式，在100～400范圍內全掃描，采用峰面積外標法定量。實驗發(fā)現(xiàn)，待測糖的分子離子峰均為[M+Na+]型，因此選擇在柱后添加Na+源，待測物和Na+經(jīng)三通匯合后進入質譜檢測器(詳細檢測流程圖見圖1)。注射泵(Pump 11 Elite)Na+源流速為0.01 mL/min。Na+源配制方法如下：準確稱取三水合乙酸鈉(CH3COOHNa.3H2O)一定量置于容量瓶中，用去離子水配置成0.25mmol/L的NaAc溶液，然后以體積比NaAc溶液∶乙腈=9∶1混合后配制而成。

配置1mg/L的阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖混合標準品溶液，采用上述優(yōu)化方案進樣分析，取得良好的分離效果，且重復性良好，如圖2所示。

圖2 8種糖標準物質混合離子色譜-質譜圖(1mg/L)

2.2 線性關系、檢出限和定量限

表3 8種糖的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限

在實際樣品中分別添加0.05、0.50、2.00mg/L 低、中、高3個水平的單一標準溶液，進行加標回收率和精密度試驗。經(jīng)檢測，6種糖的平均回收率均在88.0～97.7%范圍內，相對標準偏差(n=6)均落在2.36～3.70%之間，如表4所示。

續(xù)表4

2.4 實際樣品的測定

采用上述方法對實際咖啡豆樣品進行檢測，結果如表5所示。樣品色譜圖見圖3。

表5 不同產(chǎn)地咖啡豆樣品中糖的檢出情況 mg/kg

ND: 未檢出

樣品1 蔗糖測定譜圖

樣品2 蔗糖測定譜圖

樣品1 半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖測定譜圖

樣品2 半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖測定譜圖

樣品1 阿拉伯糖、核糖測定譜圖

樣品2 阿拉伯糖、核糖測定譜圖

圖3實際樣品圖

3 結論

建立了IC-MS法測定咖啡豆中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖的分析方法，本方法和離子色譜-安培檢測器等方法相比，具有靈敏度更高，分離度更好的優(yōu)點，而且解決了測定咖啡豆中不同含碳量的糖的假陽性問題，為咖啡豆中典型單糖和小分子寡糖的研究提供了理

論依據(jù)，適用于咖啡豆中多種糖的同時檢測?？赏茝V應用于咖啡豆中典型單糖和小分子寡糖的同時測定。

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DeterminationofrepresentativemonosaccharideandsmallmoleculeoligosaccharidesincoffeebeansbyIC-MS.

ZhangTao1，2，CaiFeng2,3，CuiHe2*，MaJiping1，ZhuQianlin4，HuDongqing5

(1.QingdaoTechnologicalUniversity,Qingdao266033,China；2.ShandongEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Qingdao266002,China；3.QingdaoSunnyHengPingInstrumentCo.Ltd,Qingdao266109,China；4.OceanUniversityofChina,Qingdao266100,China；5.QingdaoEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau，Qingdao266000,China)

A method was established for determination of arabinose，galactose，glucose，sucrose，xylose，mannose，fructose and ribose in coffee beans by using ion chromatography-electrospray tandem mass spectrometry in a positive ESI mode. Samples were separated on CarbopacTMPA20(3×150mm)analysis column by gradient elution with KOH eluent generated from an eluent generator cartridge(EGC). The flow rate was 0.38mL/min and the post-column rehydration way(Na+source) was adopted.Under the optimal conditions, the linear correlation coefficient was better than 0.999. The recoveries were in the range of 88.0%-97.7% while RSD values were between 2.36%-3.70%(n=6). This method is sample，rapid and suitable for simultaneous determination of sugars in coffee beans.

ion chromatography-mass spectrometry(IC-MS)；coffee beans；monosaccharide；oligosaccharides

國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(2012YQ090229)；青島市民生計劃項目(13-1-3-138-jh)；山東省科技發(fā)展計劃(2011GFS12005)

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.05.004

2017-04-24

張濤，男，1991年出生，碩士，環(huán)境分析化學專業(yè)，E-mail：zt75217@163.com。.