雞肉和豬肉蛋白質(zhì)酶解動力學(xué)及產(chǎn)物性質(zhì)分析

張汆，陳志宏，陳靜，袁懷波

（1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州239000；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽合肥230009）

雞肉和豬肉蛋白質(zhì)酶解動力學(xué)及產(chǎn)物性質(zhì)分析

張汆1，陳志宏1，陳靜1，袁懷波2

（1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽滁州239000；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，安徽合肥230009）

采用體外模擬方法，對兩種蛋白的消化動力學(xué)及其產(chǎn)物抗氧化活性進行了分析。結(jié)果顯示，雞肉蛋白更容易被蛋白酶所水解，生成更多的游離氨基酸和非蛋白氮（NPN），具有較低的Km值和較高的Vmax。體外抗氧化活性結(jié)果顯示，經(jīng)胃液、腸液消化后，兩種蛋白消化產(chǎn)物的抗氧化活性顯著增強（p≤0.01），且差異顯著（p≤0.01），除脂質(zhì)過氧化抑制活性外，雞肉蛋白消化產(chǎn)物顯示出更強的體外抗氧化活性。研究表明，不同膳食蛋白具有不同的消化動力學(xué)性質(zhì)，其產(chǎn)物具有不同抗氧化活性。

雞肉蛋白；豬肉蛋白；消化動力學(xué)；消化產(chǎn)物；抗氧化活性

不同來源的蛋白質(zhì)，顯示不同的營養(yǎng)性質(zhì)?，F(xiàn)代動物營養(yǎng)學(xué)研究表明，不同來源的膳食蛋白對機體的影響是多方面的，如，降低血清膽固醇含量[1-2]、影響骨礦物質(zhì)密度和吸收[3]、影響動物蛋白酶的分泌并因此影響蛋白質(zhì)的消化[4]、影響動物脂類的代謝[5-6]等。JukkaMontonen等[7]研究發(fā)現(xiàn)，動物蛋白和植物蛋白對動物血清中與糖代謝、氧化壓力、炎癥和肥胖相關(guān)的生理指標也會產(chǎn)生不同的影響。

傳統(tǒng)蛋白質(zhì)營養(yǎng)學(xué)認為，膳食蛋白營養(yǎng)價值的高低一般取決于其氨基酸組成和生物可利用率[8]。但當采用具有相似氨基酸組成的蛋白質(zhì)和氨基酸配方飼喂動物時，并不能獲得相似的生長結(jié)果，后者的生長狀況往往更差些[9]。直到1902年在動物胃腸中發(fā)現(xiàn)了活性肽[10]，隨后展開的大量研究表明，蛋白質(zhì)經(jīng)消化道水解后，主要以2個～3個氨基酸組成的寡肽形式被吸收，并能直接參與蛋白質(zhì)的合成[11]。這些寡肽是一類具有特殊生理功能的肽類物質(zhì)——活性肽?，F(xiàn)已證明，活性肽在人的生長發(fā)育、新陳代謝、疾病以及衰老、死亡的過程中起著關(guān)鍵作用，與人體的生長、發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)和新陳代謝密切相關(guān)[12-13]。當?shù)鞍踪|(zhì)在消化道中以肽的形式水解時，更有利于氨基酸吸收[14]。從寡肽釋放量看，不同來源蛋白質(zhì)間存在差異。動物采食雞蛋蛋白和α-乳清蛋白后空腸濾液中肽含量比采食小麥谷蛋白和玉米蛋白粉高。體外酶解實驗也表明，動物蛋白質(zhì)的寡肽釋放量比豆科植物蛋白質(zhì)高，谷物飼料最少[15]。

越來越多的研究顯示，不同來源蛋白質(zhì)營養(yǎng)學(xué)差異的主要原因可能在于其分子酶解期間產(chǎn)生的多肽不同、或釋放多肽的速度不同。為了解不同來源動物蛋白在體內(nèi)的消化過程及產(chǎn)物差異性，本文采用體外模擬方法對雞肉和豬肉蛋白酶解動力學(xué)及產(chǎn)物的體外抗氧化活性進行了初步分析。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮雞胸肉、豬背最長肌：滁州市三里亭菜市場。手工剔除脂肪、結(jié)締組織后，絞碎，備用。

1.2 儀器設(shè)備與試劑

HH-4數(shù)式恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；L550低速自動平衡離心機：長沙湘儀離心機有限公司；玻璃儀器氣流烘干器、SXJQ-1型數(shù)顯直流無極調(diào)速攪拌器：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；CP224s型電子分析天平：Sartorius，德國賽多利斯集團；PHSJ-3F實驗室PH計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KDN-102F自動定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；721型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司。

DPPH·（1，1-二苯基-2-苦肼基自由基，1，1-Dipheny 1-2-Picrylhydrazyl Free Radical），純度＞97.0%：梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；胃蛋白酶（酶活3 000 U/g）：上海源聚生物；胰蛋白酶（酶活 250 U/g）、亞油酸（CP級）、吐溫-20（CP級）、其他試劑（分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物雞肉中蛋白質(zhì)樣品制備

將雞肉和豬肉分別絞碎，冷凍干燥后，研磨成粉末，用乙醚脫脂6 h～8 h，即為雞肉和豬肉蛋白粉，分別裝入聚乙烯自封袋內(nèi)，冷藏備用。

1.3.2 組分含量測

蛋白質(zhì)含量采用凱氏定氮法分析測定。

非蛋白氮（Nonprotein nitrogen，NPN）是指包括游離氨基酸、多肽在內(nèi)的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物，本試驗中采用凱氏定氮法測定消化液中非蛋白氮含量[14]。

1.3.3 蛋白質(zhì)的體外模擬消化

稱取2.0 g肌肉蛋白粉懸浮于200 mL pH 1.5的HCl溶液中（底物濃度1%），于37℃～40℃水浴中預(yù)熱攪拌（轉(zhuǎn)速180 r/min）處理5 min。然后加入胃蛋白酶（酶/底物=1∶20，質(zhì)量比），開始體外消化。分別在不同消化時間（0、1、5、10、20、30 、60、120 min）從中吸取10 mL消化液，經(jīng)沸水滅酶（15 min），加入適量20%三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)后，離心（4 000 r/min，5 min），取上清液定容至50 mL，測定消化液中蛋白質(zhì)水解度和非蛋白氮含量[10-11]。

胃液消化2 h后，將消化液用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH8.0～8.5以終止胃蛋白酶活性。加入胰蛋白酶（酶/底物=1∶20，質(zhì)量比），開始進行胰蛋白酶消化。采用相同的方法測定其中的蛋白質(zhì)水解度和非蛋白氮含量。

1.3.4 酶解動力學(xué)分析

分別稱取一定量雞肉、豬肉蛋白粉，加入200 mL pH1.5HCl溶液，配制底物濃度分別為1%、2%、5%、7%、8%的蛋白液，于37℃～40℃水浴預(yù)熱（轉(zhuǎn)速180 r/min）處理5 min。然后按照上述體外消化試驗，分別完成不同底物濃度下的胃液和腸液消化，消化時間均為2 h。消化結(jié)束后，分別吸取消化液20 mL于離心管中在沸水浴中滅酶15 min，用茚三酮比色法測定消化液中游離氨基酸含量[11]。

以單位時間內(nèi)消化液中游離氨基酸含量增加質(zhì)量表示蛋白質(zhì)水解速度（mg/min），計算不同底物濃度（[S]）下對應(yīng)的水解速度（V），求導(dǎo)后計算米氏常數(shù)：

式中：Vmax為該酶促反應(yīng)的最大速度，mg/min；[S]為底物濃度，mg/mL；Km為米氏常數(shù)；V為在某一底物濃度時相應(yīng)的反應(yīng)速度，mg/min。

利用Lineweaver-Burk方法作圖，即以1/V-1/[S]作圖，得到回歸方程[16]。所得回歸方程縱軸截距為該條件下的 1/Vmax，斜率為 Km/Vmax。

1.3.5 蛋白消化產(chǎn)物制備

將模擬消化2 h后的雞肉和豬肉蛋白消化液的pH值調(diào)至中性，于沸水浴中滅酶15 min，冷凍干燥后即得雞肉和豬肉在胃液和腸液中的消化產(chǎn)物。冷藏，備用。

1.3.6 產(chǎn)物體外抗氧化性質(zhì)分析

總還原力采用鐵氰化鉀比色法，DPPH自由基（二苯代苦味肼基自由基）清除活性采用比色法，參照Liang等[17]的方法測定；脂質(zhì)過氧化抑制活性用不同濃度的提取物溶液對亞油酸乳狀液體系過氧化抑制率表示，按照文獻[18]方法分析；亞硝酸鹽清除活性采用鹽酸萘乙二胺比色法進行測定[19]。

酶解產(chǎn)物體外抗氧化能力LC50值：是指產(chǎn)物抗氧化能力達到50%時所需的濃度（mg/mL）。LC50值越小，其抗氧化活性越強，可由產(chǎn)物抗氧化活性與其濃度間的回歸方程計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析整理并作圖，所有樣品重復(fù)測定3次，以平均值表示最終結(jié)果。采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)差異顯著性進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞肉和豬肉蛋白消化過程的體外模擬

雞肉和豬肉蛋白體外消化過程中水解度（Degree of Hydrolysis，DH）的變化見圖 1。

圖1 雞肉和豬肉蛋白體外消化過程中DH的變化Fig.1 The DH changes of the chicken and pork proteins during digestion in vitro

圖1的結(jié)果顯示，胃液中，兩種蛋白質(zhì)的水解程度隨時間延長均呈明顯的增加趨勢，尤其是在前60分鐘內(nèi)，水解度增加很快，此后，隨著時間延長，增速減緩。雞肉蛋白的水解速度和最終水解度都顯著高于豬肉蛋白（p≤0.05），說明雞肉蛋白比豬肉蛋白更易于消化。在腸液中，前120分鐘內(nèi)，水解度變化趨勢與胃液中的相似，雞肉蛋白水解度顯著高于豬肉蛋白（p≤0.05），在隨后的60 min內(nèi)，雞肉蛋白水解度幾乎不再增加，而豬肉蛋白的水解度卻繼續(xù)增加，并逐漸接近雞肉蛋白在180 min時的水解度。

兩種蛋白質(zhì)在胃液中消化180 min后的水解度在2%左右，在腸液中的水解度增加迅速，180 min后可達13%左右。說明蛋白質(zhì)消化主要在腸液中，而非胃液中，尤其是小分子量肽類在腸液中的大量生成，也有利于其被小腸內(nèi)壁的粘膜細胞快速吸收。

消化期間非蛋白氮（NPN）的生成量如圖2所示。

圖2 雞肉和豬肉蛋白體外消化過程中NPN的變化Fig.2 The NPN changes of the chicken and pork proteins during digestion in vitro

結(jié)果顯示，消化液中NPN含量變化趨勢與DH變化相似，隨消化時間的延長，NPN含量逐漸增加，且無論在胃液中還是在腸液中，雞肉蛋白的NPN含量始終高于豬肉蛋白。但是與DH變化不同的是，兩種蛋白消化液中，NPN在胃液消化前期的增加速度很快，大約消化90 min后，增加速度趨于平緩，似乎接近其最大值。而在腸液中，NPN的變化趨勢與胃液中的似乎相反：消化前期速度增加平緩，大約消化后60 min后開始快速增加。在胃液中消化前期，雞肉和豬肉蛋白消化液中NPN含量差異不顯著（p≤0.05），但隨消化時間的延長，兩者NPN含量存在極顯著差異（p≤0.01）。在胰液消化中，兩者至始至終在消化液中NPN含量差異性不顯著（p≤0.05）。

2.2 雞肉和豬肉蛋白酶解動力學(xué)分析

雞肉和豬肉蛋白酶解動力學(xué)分析見圖3、表1。

雞肉蛋白和豬肉蛋白的酶解動力學(xué)曲線（見圖3）符合一般酶解反應(yīng)動力學(xué)曲線（米氏方程）特征，即：在底物濃度較低時，呈一級反應(yīng)；繼續(xù)增加底物濃度時，反應(yīng)速度呈曲線增加（混合級反應(yīng)）；在高底物濃度時，反應(yīng)速度增加緩慢，甚至不再增加（零級反應(yīng)）。此外，雞肉和豬肉蛋白酶解過程中，無論是在胃液中，還是在腸液中，雞肉蛋白酶解速度均略高于豬肉。在消化前期，兩者間的反應(yīng)速度差異顯著（p≤0.05），但隨消化時間的延長，反應(yīng)速度間的差異逐漸減小。

圖3 雞肉和豬肉蛋白的消化動力學(xué)曲線Fig.3 The digestive kinetic curves in vitro of chicken and pork skeletal muscle proteins

表1 雞肉和豬肉蛋白消化動力學(xué)參數(shù)Table 1 The digestive kinetic curves in vitro of chicken and pork skeletal muscle proteins

采用Lineweaver-Burk作圖法，計算得到其米氏方程動力學(xué)參數(shù)Vmax和Km（表1）。結(jié)果顯示，在胃液和腸液中，雞肉蛋白的Vmax均略高于豬肉蛋白，且兩者間差異不顯著（p≤0.05），說明雞肉蛋白相比較容易消化。消化期間，豬肉蛋白在胃液、腸液中的Km值（1.315 6、0.075 7）均顯著高于雞肉蛋白（1.003 7、0.057 4）（p≤0.01）。說明在模擬的胃液和腸液消化體系中，雞肉蛋白與消化酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶）分子間的親和力顯著高于豬肉蛋白。該結(jié)果與Vmax的結(jié)果基本一致。

2.3 蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物抗氧化性

雞肉和豬肉蛋白消化產(chǎn)物體外抗氧化活性見表2。

表2 雞肉和豬肉蛋白消化產(chǎn)物體外抗氧化活性Table 2 The antioxidant activities in vitro of chicken and pork skeletal muscle proteins digestive products

結(jié)果顯示，雞肉和豬肉蛋白在胃液和腸液中分別經(jīng)過2 h消化，所得產(chǎn)物的總還原力均隨其濃度的增加而增加，存在明顯的劑量效應(yīng)。然而，同一蛋白在胃液和腸液中的消化產(chǎn)物、不同來源膳食蛋白在相同條件下所得消化產(chǎn)物的總還原力間均存在顯著差異（p≤0.01）。首先，腸液消化產(chǎn)物的還原力均顯著高于其胃液消化產(chǎn)物，其LC50較低；其次，相同條件下，雞肉蛋白消化產(chǎn)物具有較低的LC50，說明其還原力高于豬肉蛋白消化產(chǎn)物。雖然與相同濃度下VC的還原力相比，雞肉和豬肉蛋白消化產(chǎn)物的還原力很低，但從營養(yǎng)學(xué)角度分析，兩種膳食蛋白經(jīng)胃液和腸液消化后，其總還原力均得到2倍～4倍的增加。

就NO2-清除活性而言，5 mg/mL～10 mg/mL的雞肉和豬肉腸消化產(chǎn)物具有中等程度的NO2-清除活性，接近與0.067 mg/mL VC溶液的NO2-清除活性。同樣，雞肉和豬肉蛋白消化產(chǎn)物對DPPH·的清除活性差異顯著（p≤0.01），這一差異在相同蛋白不同消化階段產(chǎn)物間也同樣存在。與前述實驗結(jié)果相似，不同蛋白腸液消化產(chǎn)物的DPPH·、NO2-清除活性均顯著高于其胃液消化產(chǎn)物。

表2結(jié)果顯示，兩種蛋白腸消化產(chǎn)物抗氧化性顯著高于其胃消化產(chǎn)物，且蛋白質(zhì)間存在顯著差異（p≤0.01）。雞肉蛋白在不同階段（胃液、腸液）消化產(chǎn)物的體外抗氧化性均顯著高于豬肉蛋白（p≤0.01）。說明蛋白質(zhì)分子經(jīng)酶解消化后，所得產(chǎn)物具有更強的抗氧化性，可能緣于產(chǎn)物中更多還原性側(cè)鏈基團的外露，也可能與具有更強抗氧化活性的產(chǎn)物，如抗氧化肽的產(chǎn)生有關(guān)。其次，雞肉消化產(chǎn)物具有更強的抗氧化活性。

雞肉和豬肉蛋白消化產(chǎn)物脂質(zhì)過氧化抑制率結(jié)果見表3。

在亞油酸過氧化抑制試驗中，兩種蛋白的4種消化產(chǎn)物均顯示出較強的亞油酸過氧化抑制活性。在1mg/mL濃度下即顯示出50%～60%以上的抑制率。與前述試驗結(jié)果相似，腸液消化產(chǎn)物仍顯示出較高的過氧化抑制率，但不同蛋白質(zhì)消化產(chǎn)物間無顯著差異（p＞0.05）。

表3 雞肉和豬肉蛋白消化產(chǎn)物脂質(zhì)過氧化抑制率Table 3 The peioxidation inhibitory activities in vitro of chicken and pork skeletal muscle proteins digestive products %

3 結(jié)論

體內(nèi)消化動力學(xué)性質(zhì)的模擬研究結(jié)果顯示，雞肉蛋白比豬肉蛋白在胃液和腸液中更容易被蛋白酶所水解，生成更多的游離氨基酸和非蛋白氮（NPN），雞肉蛋白具有更低的Km值，表明雞肉蛋白比豬肉蛋白與蛋白酶具有更高的親和力。體外抗氧化活性分析結(jié)果顯示，經(jīng)胃液、腸液消化后，兩種肌肉蛋白消化產(chǎn)物的抗氧化活性顯著增強（p≤0.01），且差異顯著（p≤0.01），除體外油脂過氧化抑制活性外，雞肉蛋白消化產(chǎn)物顯示出比豬肉蛋白消化產(chǎn)物更強的體外抗氧化活性。兩種蛋白消化產(chǎn)物均顯示出較強的脂質(zhì)過氧化抑制活性，且無顯著差異（p＞0.05）。

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The Enzymatic Hydrolysis Kinetics and Products Properties of Chicken and Pork Protein

ZHANG Cuan1，CHEN Zhi-hong1，CHEN Jing1，YUAN Huai-bo2
（1.School of Biological Science and Food Engineering，Chuzhou University，Chuzhou 239000，Anhui，China；2.School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，Anhui，China）

Using in vitro modeling methods，the enzymatic hydrolysis kinetics of chicken and pork proteins and the antioxidant activities of their enzymatic hydrolysis products in gastric and intestinal were investigated.The results showed that chicken protein could be easier hydrolyzed than pork protein，and more amino acids and non-protein nitrogen（NPN）could be found in hydrolysis products.The analysis results of hydrolysis kinetics showed chicken protein had lower Kmand higher Vmaxvalues than pork protein.The in vitro analysis result showed the antioxidant activities were significantly enhanced after digestion in gastric and intestinal juices（p≤0.01），besides their lipid inhibitive capacities.And there were remarkable differences between two proteins（p≤0.01）.Above results indicated there were different hydrolysis kinetics characteristics and their products showed different antioxidant activities between chicken and pork proteins.

chicken protein；pork protein；enzymatic hydrolysis kinetics；hydrolysis products；antioxidant activities

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.004

安徽省教育廳高校自然科學(xué)研究重大項目（2013ZD006）；滁州學(xué)院食品酶法加工科技創(chuàng)新團隊項目（00001702）

張汆（1970—），女（漢），教授，博士，主要從事食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)、膳食蛋白方向的研究。

2017-05-14