不同濃度牛乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)的影響

劉猛，樊鳳嬌，石璞潔，涂茂林，于翠平，杜明，，*

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

不同濃度牛乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)的影響

劉猛1，樊鳳嬌1，石璞潔1，涂茂林1，于翠平2，杜明1，2，*

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150090；2.大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

研究證實(shí)牛乳鐵蛋白具有成骨活性功能，既能刺激成骨細(xì)胞增殖，也能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡。骨骼的生長發(fā)育是一動態(tài)平衡的生物過程，是通過成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨生成和破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收所調(diào)節(jié)的。采用成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞與破骨前體細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞1∶1的比例直接接觸的共培養(yǎng)方式，研究不同濃度（20、100、500μg/mL）的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性以及破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響。首先，通過堿性磷酸酶（ALP）活性檢測試劑盒檢測共培養(yǎng)上清中的ALP活性，發(fā)現(xiàn)低濃度的牛乳鐵蛋白能夠抑制成骨細(xì)胞的ALP活性，而中高濃度的牛乳鐵蛋白能夠顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞的ALP活性。利用TRAP活性檢測試劑盒及ELISA檢測試劑盒，則發(fā)現(xiàn)低中濃度的牛乳鐵蛋白能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的TRAP活性，而高濃度的牛乳鐵蛋白能夠顯著地抑制破骨細(xì)胞的TRAP活性和共培養(yǎng)體系RANKL/OPG的比值。最后，通過骨吸收陷窩實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了中高濃度組的牛乳鐵蛋白能夠顯著地抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能。結(jié)果表明了高濃度的牛乳鐵蛋白在共培養(yǎng)體系中不僅能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，并且對破骨細(xì)胞具有抑制活性及功能的作用。

牛乳鐵蛋白；成骨細(xì)胞；破骨細(xì)胞；共培養(yǎng)

乳鐵蛋白的分子量大小約為78 kDa[1-2]，其一級結(jié)構(gòu)組成是由約700個(gè)氨基酸組成[3]的單一的多肽鏈結(jié)構(gòu)，并且不同種類的乳鐵蛋白其組成氨基酸序列卻具有極高的同源性。乳鐵蛋白作為一種功能性糖蛋白[4]，具有多種生物學(xué)活性，乳鐵蛋白可以促進(jìn)鐵吸收，具有抗炎[5]和鎮(zhèn)痛的作用[6]，并且在抑菌和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力等方面也具有生物功能活性。目前已經(jīng)報(bào)道了，牛乳鐵蛋白既能刺激成骨細(xì)胞增殖，也能誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡[7-8]。目前的研究證實(shí)了，骨骼的生長發(fā)育是一個(gè)動態(tài)平衡的生物過程，主要是通過成骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨生成和破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收所共同調(diào)節(jié)的[9]。骨組織經(jīng)歷不斷重塑以確保其結(jié)構(gòu)完整性得到保持，如果這種機(jī)制遭到破壞，很有可能產(chǎn)生骨丟失導(dǎo)致如骨質(zhì)疏松癥和溶骨性疾病等問題[10]。

破骨細(xì)胞的分化和骨吸收功能主要是由激素、細(xì)胞因子和生長因子直接作用于破骨細(xì)胞或間接通過周圍細(xì)胞所調(diào)控的[11]。其中由成骨細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，包括核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of the NF-κB ligand，RANKL）對于誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，融合，激活和存活至關(guān)重要。另一種細(xì)胞因子骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）通過抑制RANKL與其受體核因子κB受體活化因子（receptor activator of the NF-κB，RANK）的結(jié)合而作為誘餌受體[12]。所以，RANKL/OPG的比例是起到?jīng)Q定破骨細(xì)胞形成和破骨細(xì)胞活性的關(guān)鍵因素[13-14]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，并且可以逐漸用于實(shí)際應(yīng)用[15-16]，共培養(yǎng)中使用成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞傳統(tǒng)上用于確定兩種細(xì)胞類型之間的關(guān)系[17-18]。鑒于牛乳鐵蛋白的成骨活性功能，我們有興趣知道它在骨重塑中發(fā)揮的作用，特別是在破骨細(xì)胞吸收活動中，在這項(xiàng)研究中，我們調(diào)查牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)中成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞活性以及破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響。目前已經(jīng)報(bào)道了可以采用直接將成骨細(xì)胞與破骨前體細(xì)胞共培養(yǎng)的方式，通過成骨細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子來促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化形成，從而獲得成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系[19-20]。因此，本研究采用了將種屬來源一致的成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞與破骨前體細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞以1∶1的比例進(jìn)行共培養(yǎng)，同時(shí)添加能夠支持成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共同生長的培養(yǎng)基[21-22]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

牛乳鐵蛋白（＞94%）、TRAP染色試劑盒、Corning Osteo Assay surface 24孔人工骨板：美國Sigma公司；α-MEM、胰蛋白酶（0.25%）/EDTA（0.02%）消化液、青霉素鏈霉素混合抗生素溶液：美國Hyclone公司；胎牛血清、D-MEM培養(yǎng)基：美國Gibco公司。

倒置式生物顯微鏡：日本Nikon公司；Zeiss Axiovert 200顯微鏡：德國Zeiss公司；Eon型酶標(biāo)儀：美國BioTek公司；HEPA class 100型細(xì)胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

對于成骨細(xì)胞，在含有1%抗生素（10 mg/mL鏈霉素B和10 000 U/mL青霉素G）和10%胎牛血清的α-MEM中培養(yǎng)來源于新生小鼠顱骨的MC3T3-E1細(xì)胞。對于破骨前體細(xì)胞，將RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中（含有10%胎牛血清，10 mg/mL鏈霉素和10 000 U/mL青霉素）。在37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)液在匯合前每隔一天更換一次，使用胰蛋白酶（0.25%）/EDTA（0.02%）消化液傳代細(xì)胞。成骨細(xì)胞：破骨前體細(xì)胞以1∶1細(xì)胞（MC3T3-E1細(xì)胞：RAW264.7細(xì)胞）的比例共培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組

樣品分組：樣品分3組，分別為牛乳鐵蛋白低質(zhì)量濃度組（20 μg/mL）、牛乳鐵蛋白中質(zhì)量濃度組（100 μg/mL）和牛乳鐵蛋白高質(zhì)量濃度組（500 μg/mL）。

1.2.3 抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色觀察破骨細(xì)胞

調(diào)整MC3T3-E1細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞濃度以1×104個(gè)/孔接種到預(yù)先放置有無菌細(xì)胞爬片的六孔板中，每孔各加入1 mL細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，并添加新鮮培養(yǎng)基，每2天更換新鮮培養(yǎng)基1次。共培養(yǎng) 5、7、9、11、13、15 天后，取出細(xì)胞爬片后，按照試劑盒說明書固定細(xì)胞后進(jìn)行TRAP染色，并將TRAP陽性多核細(xì)胞（3個(gè)或3個(gè)以上）計(jì)數(shù)為破骨細(xì)胞，使用Zeiss Axiovert 200顯微鏡觀察并拍攝顯微照片[23]。

1.2.4 TRAP活性檢測

按照1.2.3中方法共培養(yǎng)，每2天更換新鮮培養(yǎng)基一次并添加不同濃度的牛乳鐵蛋白，選擇共培養(yǎng)11天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，1 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞沉淀后，進(jìn)行TRAP活性檢測。按照TRAP活性試劑盒說明書操作，依次加入檢測緩沖液、顯色底物和培養(yǎng)基上清，充分混勻后37℃下孵育30 min，取出加入終止液終止其反應(yīng)，置于405 nm處測定其吸光度[24]。

1.2.5 堿性性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性檢測

按照1.2.4中方法獲得培養(yǎng)基上清，進(jìn)行ALP活性檢測。按照ALP活性試劑盒說明書操作，依次加入檢測緩沖液、顯色底物和培養(yǎng)基上清，充分混勻后37℃下孵育30 min，取出加入終止液終止其反應(yīng)，置于405 nm處測定其吸光度[24]。

1.2.6 骨吸收實(shí)驗(yàn)

調(diào)整MC3T3-E1細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞濃度各以500個(gè)/孔接種到Corning Osteo Assay surface 24孔人工骨板上，兩種細(xì)胞每孔各加入0.5 mL細(xì)胞懸液，置于37℃，5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，并添加新鮮培養(yǎng)基及不同濃度的牛乳鐵蛋白，每3天更換新鮮培養(yǎng)基一次同時(shí)補(bǔ)加不同濃度的牛乳鐵蛋白樣品。選擇培養(yǎng)11天后，用5%的次氯酸鹽溶液將細(xì)胞從人工骨板的底部洗掉，蒸餾水清洗2次，待骨板干燥后，使用Zeiss Axiovert 200顯微鏡拍攝，利用Image J軟件計(jì)算吸收面積的百分比[25]。

1.2.7 ELISA法檢測RANKL/OPG

按照1.2.4中方法獲得培養(yǎng)基上清，采用ELISA法分別測定RANKL與OPG的含量，按照試劑盒說明書操作進(jìn)行，然后計(jì)算RANKL/OPG的比值[26]。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)及繪圖

數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件進(jìn)行計(jì)算繪圖。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，one-way ANOVA進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)以±s表示，p＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 共培養(yǎng)體系在倒置顯微鏡下的觀察結(jié)果

本試驗(yàn)采用成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞與破骨前體細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞1∶1的比例直接接觸的共培養(yǎng)方式，如圖1所示。

圖1 共培養(yǎng)體系在倒置顯微鏡下的觀察結(jié)果Fig.1 Observation of phase contrast microscope for co-cultured system

顯微鏡下觀察貼壁生長的細(xì)胞，共培養(yǎng)1天后，MC3T3-E1細(xì)胞形成單層覆蓋，形狀多為長梭形和三角形，并且有2～3個(gè)突起，細(xì)胞質(zhì)飽滿，清晰透亮；RAW264.7細(xì)胞則多為單個(gè)核細(xì)胞，形狀多為圓形和橢圓形。共培養(yǎng)5天后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞已經(jīng)在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中鋪滿了整個(gè)底面，兩種細(xì)胞分層明顯，破骨細(xì)胞數(shù)量少于成骨細(xì)胞，并且位于成骨細(xì)胞之上，體積跟剛貼壁時(shí)相比明顯增大；部分的成骨細(xì)胞有3～4個(gè)突起，并且相互連接匯合，結(jié)構(gòu)似星形，顯示出較好的貼壁性；可以觀察到單核細(xì)胞開始融合的現(xiàn)象，并且可見臘腸型等形態(tài)不規(guī)則破骨細(xì)胞形成，并且有偽足伸出，出現(xiàn)了多個(gè)體積較大的多核細(xì)胞。而且隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加，破骨細(xì)胞的數(shù)量逐漸增多，并且細(xì)胞直徑也逐漸增大。但是，在共培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到15天后，出現(xiàn)了衰退的跡象。

2.2 TRAP染色觀察與破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)

共培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行TRAP染色后，于顯微鏡下觀察分析破骨細(xì)胞并且計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖2與圖3所示。

共培養(yǎng)5天可見TRAP陽性細(xì)胞形成，顯微鏡下可以觀察到見大量染為淺色的成骨細(xì)胞，而破骨細(xì)胞數(shù)量極少且細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)深色。共培養(yǎng)9天后，RAW264.7細(xì)胞的體積逐漸變大，并且有偽足伸出，出現(xiàn)了多個(gè)體積較大的多核細(xì)胞（3個(gè)或3個(gè)以上），TRAP活性部位表現(xiàn)出深色顆粒（TRAP陽性的特征）變得明顯。隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加，TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞核數(shù)目逐漸增加，并且細(xì)胞直徑也有所增加。共培養(yǎng)15天后，破骨細(xì)胞數(shù)量有減少趨勢，細(xì)胞邊緣變得模糊不清，部分細(xì)胞更是表現(xiàn)出了崩解的現(xiàn)象。

圖2 共培養(yǎng)體系的TRAP染色Fig.2 TRAP staining for co-cultured system

圖3 共培養(yǎng)體系的TRAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)Fig.3 TRAP-positive large multinucleated cells counting for cocultured system

2.3 不同濃度的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞活性的影響

當(dāng)在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）時(shí)，選擇共培養(yǎng) 11 天后，發(fā)現(xiàn)了共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的TRAP活性與空白組相比，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。20 μg/mL和100 μg/mL組分別升高至對照組的約187.8%和168.9%，而500 μg/mL組則降低至至對照組的約25.6%，如圖4所示。

圖4 牛乳鐵蛋白對破骨細(xì)胞活性的影響Fig.4 Effects of bovine lactoferrin on TRAP activity of osteoclast for co-cultured system

在共培養(yǎng)體系里，破骨細(xì)胞形成的過程中，主要是由成骨細(xì)胞提供RANKL給破骨細(xì)胞前體，這些結(jié)果說明了在低濃度的牛乳鐵蛋白存在時(shí)，來自成骨細(xì)胞的RANKL對TRAP活性的貢獻(xiàn)是相當(dāng)大的，表現(xiàn)在破骨細(xì)胞的TRAP與空白組相比顯著升高，另外又由于牛乳鐵蛋白能夠抑制破骨細(xì)胞的形成，所以造成了隨著牛乳鐵蛋白的濃度的升高，共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的TRAP活性逐漸降低，而在500 μg/mL時(shí)，牛乳鐵蛋白的作用超過了RANKL，導(dǎo)致破骨細(xì)胞的TRAP與空白組相比顯著降低。

2.4 不同濃度的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞活性的影響

當(dāng)在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）時(shí)，選擇共培養(yǎng) 11 天后，發(fā)現(xiàn)了成骨細(xì)胞的TRAP活性與空白組相比，表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，其中100 μg/mL牛乳鐵蛋白組表現(xiàn)出最強(qiáng)的促進(jìn)作用。100 μg/mL和500 μg/mL組分別升高至對照組的約145.3%和101.1%，而20 μg/mL組則降低至至對照組的約69.4%，如圖5所示。

圖5 牛乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞活性的影響Fig.5 Effects of bovine lactoferrin on ALP activity of osteoblasts for co-cultured system

這些結(jié)果說明了在低濃度的牛乳鐵蛋白存在時(shí)，由于成骨細(xì)胞分泌的RANKL能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，而牛乳鐵蛋白又能夠抑制破骨細(xì)胞的形成，為了平衡這種作用，表現(xiàn)出了與空白組抑制了成骨細(xì)胞的活性。而隨著牛乳鐵蛋白的濃度的升高，破骨細(xì)胞的TRAP活性逐漸降低，牛乳鐵蛋白促對成骨細(xì)胞的促進(jìn)作用又占了主導(dǎo)作用，表現(xiàn)在提高了ALP的活性，并且100 μg/mL的牛乳鐵蛋白組對于成骨細(xì)胞的活性具有最高的促進(jìn)作用。

2.5 牛乳鐵蛋白對成骨細(xì)胞：破骨細(xì)胞共培養(yǎng)骨吸收的影響

采用將MC3T3-E1細(xì)胞與胞RAW264.7細(xì)胞以1∶1的比例直接接觸的方式直接接種到人工骨板上進(jìn)行共培養(yǎng)，并在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）時(shí)，選擇共培養(yǎng) 11 天后，測定不同濃度的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的骨吸收功能。人工骨板被破骨細(xì)胞吸收后會形成骨吸收陷窩，而顏色深的區(qū)域則表示未被破骨細(xì)胞吸收，如圖6所示。

圖6 乳鐵蛋白對破骨細(xì)胞骨吸收的影響Fig.6 Effects of bovine lactoferrin on bone resorption of osteoclasts for co-cultured system

經(jīng)過不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）處理后，與空白組相比，骨吸收凹陷部位面積表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，而且500 μg/mL組存在較多顏色較淺的骨吸收區(qū)域，是由于少量功能不佳的破骨細(xì)胞產(chǎn)生的。通過定量分析結(jié)果表明，濃度為20、100、500 μg/mL的牛乳鐵蛋白與對照組相比的百分比，分別約為111.2%、66.9%、45.1%，這些數(shù)據(jù)表明了中高濃度的牛乳鐵蛋白均對共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的功能也有一定的抑制作用。

2.6 牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系RANKL/OPG的影響

當(dāng)在共培養(yǎng)體系中加入不同濃度的牛乳鐵蛋白（20、100、500 μg/mL）時(shí)，共培養(yǎng) 11 天后，發(fā)現(xiàn)了共培養(yǎng)體系中RANKL/OPG與空白組相比，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。20 μg/mL和100 μg/mL組分別升高至對照組的約105.5%和102.6%，而500 μg/mL組則降低至至對照組的約87.0%，如圖7所示。

圖7 乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系RANKL/OPG的影響Fig.7 Effects of bovine lactoferrin on RANKL/OPG for cocultured system

由于已經(jīng)證實(shí)了牛乳鐵蛋白能夠抑制成骨細(xì)胞的RANKL mRNA的表達(dá)，并促進(jìn)OPG mRNA的表達(dá)，從而降低RANKL/OPG的比值。這些結(jié)果說明了在共培養(yǎng)體系中，低中濃度組的牛乳鐵蛋白沒有降低RANKL/OPG的比值，而高濃度組的牛乳鐵蛋白則能夠顯著降低RANKL/OPG的比值，從而降低共培養(yǎng)體系中破骨細(xì)胞的形成和活性，影響了骨的吸收。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過采用種屬來源一致的成骨細(xì)胞MC3T3-E1細(xì)胞與破骨前體細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞以1∶1的比例直接接觸的共培養(yǎng)方式，研究了濃度為20、100、500 μg/mL的牛乳鐵蛋白對共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞活性以及破骨細(xì)胞骨吸收功能的影響。對于成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了低濃度的牛乳鐵蛋白能夠抑制成骨細(xì)胞的ALP活性，而中高濃度的牛乳鐵蛋白能夠顯著地促進(jìn)成骨細(xì)胞的ALP活性。對于破骨細(xì)胞，則發(fā)現(xiàn)了低中濃度的牛乳鐵蛋白能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的TRAP活性，而高濃度的牛乳鐵蛋白能夠顯著地抑制破骨細(xì)胞的TRAP活性和RANKL/OPG的比值。另外中高濃度組的牛乳鐵蛋白能夠顯著地抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能。綜上所述，我們證明了高濃度的牛乳鐵蛋白在共培養(yǎng)體系中不僅能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，并且對破骨細(xì)胞具有抑制活性及功能的作用，這對于牛乳鐵蛋白應(yīng)用到骨代謝疾病及骨組織工程領(lǐng)域奠定了理論基礎(chǔ)。

[1]Baker E,Baker H.Molecular Structure,Binding Properties and Dynamics of Lactoferrin[J].Cellular and Molecular Life Sciences:CMLS,2005,62(22):2531-2539

[2]Moore S A,Anderson B F,Groom C R,et al.Three-Dimensional Structure of Diferric Bovine Lactoferrin at 2.8 ? Resolution[J].Journal of Molecular Biology,1997,274(2):222-236

[3]Kawakami A,Hirayama K,Kawakami F,et al.Purification and Biochemical Characterization of a Fibroblast Growth Factor-Binding Protein (FGF-BP)from the Lactoferrin Fraction of Bovine Milk[J].Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects,2006,1760(3):421-431

[4]桑亞新,王向紅,孫紀(jì)錄,等.乳鐵蛋白及其生理功能研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003(z1):154-156

[5]Legrand D,Elass E,Pierce A,et al.Lactoferrin and Host Defence:An Overview of Its Immuno-Modulating and Anti-Inflammatory Properties[J].Biometals,2004,17(3):225-229

[6]Hayashida K-i,Takeuchi T,Shimizu H,et al.Novel Function of Bovine Milk-Derived Lactoferrin on Antinociception Mediated by Μ-Opioid Receptor in the Rat Spinal Cord[J].Brain Research,2003,965(1):239-245

[7]Toba Y,Takada Y,Yamamura J,et al.Milk Basic Protein:A Novel Protective Function of Milk against Osteoporosis[J].Bone,2000,27(3):403-408

[8]Kruger M,Poulsen R,Schollum L,et al.A Comparison between Acidic and Basic Protein Fractions from Whey or Milk for Reduction of Bone Loss in the Ovariectomised Rat[J].International Dairy Journal,2006,16(10):1149-1156

[9]Nijweide P J,Burger E H,Feyen J.Cells of Bone:Proliferation,Differentiation,and Hormonal Regulation[J].Physiological reviews,1986,66(4):855-886

[10]Raisz L G.Physiology and Pathophysiology of Bone Remodeling[J].Clinical Chemistry,1999,45(8):1353-1358

[11]Gay C V,Weber J A.Regulation of Differentiated Osteoclasts[J].Critical ReviewsTMin Eukaryotic Gene Expression,2000,10,213-230

[12]Hofbauer L C,Heufelder A E.Role of Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand and Osteoprotegerin in Bone Cell Biology[J].Journal of Molecular Medicine,2001,79(5):243-253

[13]Hofbauer L C,Khosla S,Dunstan C R,et al.The Roles of Osteoprotegerin and Osteoprotegerin Ligand in the Paracrine Regulation of Bone Resorption[J].Journal of Bone and Mineral Research,2000,15(1):2-12

[14]Lorget F,Clough J,Oliveira M,et al.Lactoferrin Reduces in vitro Osteoclast Differentiation and Resorbing Activity[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2002,296(2):261-266

[15]Burmeister B,Domaschke H,Gelinsky M,et al.Co-Culture of Osteoblasts and Osteoclasts on Resorb-Able Mineralised Collagen Scaffolds:Establishment of an in vitro Model of Bone Remodeling[J].European Cells and Materials,2003,5:18-19

[16]Han D,Zhang Q.An Essential Requirement for Osteoclasts in RefinedBone-Like Tissue Reconstruction in vitro[J].Medical Hypotheses,2006,67(1):75-78

[17]Jimi E,Nakamura I,Amano H,et al.Osteoclast Function Is Activated by Osteoblastic Cells through a Mechanism Involving Cell-to-Cell Contact[J].Endocrinology,1996,137(8):2187-2190

[18]Nicolin V,Baldini G,Bareggi R,et al.Morphological Features of OsteoclastsDerivedfromaCo-CultureSystem[J].Journal of Molecular Histology,2006,37(3/4):171-177

[19]廖乃順,陳文列,黃云梅,等.成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞共培養(yǎng)及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國骨傷,2013(4):349-353

[20]魯秀敏,陳林,蘇楠,等.小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立[J].中國骨質(zhì)疏松雜志,2008,14(3):159-163

[21]Jones G,Marshall M,El Haj A,et al.The Use of Osteoblast/Osteoclast Co-Cultures on PLLA,Silk and Dentin Scaffolds[B].Tissue Eng 2007,13(7):1765-1766

[22]Jones G L,Motta A,Marshall M J,et al.Osteoblast:Osteoclast Co-Cultures on Silk Fibroin,Chitosan and Plla Films[J].Biomaterials,2009,30(29):5376-5384

[23]Gan K,Yang L,Xu L,et al.Iguratimod(T-614)Suppresses Rankl-Induced Osteoclast Differentiation and Migration in Raw264.7 Cells Via NF-κB and Mapk Pathways[J].International Immunopharmacology,2016,35:294-300

[24]Honma M,Ikebuchi Y,Kariya Y,et al.Rankl Subcellular Trafficking and Regulatory Mechanisms in Osteocytes[J].Journal of Bone and Mineral Research,2013,28(9):1936-1949

[25]Boeyens J C,Deepak V,Chua W-H,et al.Effects of Ω3-and Ω6-Polyunsaturated Fatty Acids on Rankl-Induced Osteoclast Differentiation of Raw264.7 Cells:A Comparative in vitro Study[J].Nutrients,2014,6(7):2584-2601

[26]Bostanci N,I˙lgenli T,Emingil G,et al.Gingival Crevicular Fluid Levels of RANKL and OPG in Periodontal Diseases:Implications of Their Relative Ratio[J].Journal of Clinical Periodontology,2007,34(5):370-376

Effects of Different Concentrations of Bovine Lactoferrin on Osteoblast/Osteoclast Co-cultures

LIU Meng1，F(xiàn)AN Feng-jiao1，SHI Pu-jie1，TU Mao-lin1，YU Cui-ping2，DU Ming1，2，*
（1.School of Chemistry and Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China；2.School of Food Science and Technology，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

The osteogenic activity of bovine lactoferrin has been proved that bovine lactoferrin could promote proliferation and differentiation of osteoblasts and inhibit apoptosis of osteoclast.The growth and development of bones depended on the balance between bone resorption and bone formation.Osteoblasts and osteoclasts were associated with bone formation and bone resorption，respectively.The effects of different concentrations of bovine lactoferrin （20，100，500 μg/mL）on the osteoblast and osteoclast activity and bone resorptive activity of osteoclast were studied by co-cultures of MC3T3-E1 cells and RAW264.7 cells （used at a ratio of 1：1）in this paper.Alkaline Phosphatase（ALP）activity was detected by ALP activity Assay Kit.The result showed that low concentrations of bovine lactoferrin inhibited ALP activity of osteoblasts，whereas middle and high concentrations of bovine lactoferrin could significantly promote ALP activity.By tartrate resistant acid phosphatase（TRAP）activity Assay Kit and the ELISA kits，it was found that low and middle concentration of bovine lactoferrin could promote the TRAP activity of osteoclasts，while high concentrations of bovine lactoferrin could sig nificantly inhibit the TRAP activity and the ratio of receptor activator of the NF-κB ligand （RANKL）and os－teoprotegerin（OPG）.Bone resorptive activity of osteoclast as evaluated on bone-mimetic plates was significantly inhibited by middle and high concentration of bovine lactoferrin.In general，these results indicated that high concentrations of bovine lactoferrin could not only promote osteoblasts activity，but also inhibit steoclasts activity and function in co-culture system.

bovine lactoferrin；osteoblast；osteoclasts；co-culture

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.001

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31371805、31101316）

劉猛（1988—），男（漢），博士研究生，研究方向：食品科學(xué)。

*通信作者：杜明（1977—），男（漢），教授，博士，研究方向：食品科學(xué)。

2017-10-23