重組人促紅細(xì)胞生成素對高氧腦損傷大鼠腦組織Caspase-3、Bcl-2表達(dá)的影響

許春花，王永雙，楊磊，胡婉婷，趙寒陽

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院)

重組人促紅細(xì)胞生成素對高氧腦損傷大鼠腦組織Caspase-3、Bcl-2表達(dá)的影響

許春花1，王永雙1，楊磊2，胡婉婷1，趙寒陽1

(1延邊大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林延吉133000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院)

目的探討重組人促紅細(xì)胞生成素(rEPO)對新生大鼠高氧腦損傷的影響及其機(jī)制。方法將新生Wistar大鼠90只分成空氣組、高氧組、治療組各30只，高氧組和治療組置于高氧模型箱中，空氣組置于氧氣室外呼吸空氣。于實(shí)驗(yàn)第3、7、14天每組處死10只，取大鼠海馬組織行HE染色進(jìn)行病理檢查，采用TUNEL染色法檢測海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)，采用Western blotting法檢測腦組織中Caspase-3和Bcl-2的相對表達(dá)量。結(jié)果病理檢查顯示,高氧組腦組織有不同程度的水腫、壞死和炎癥反應(yīng)，隨著暴露于高濃度氧中時(shí)間的延長病理改變明顯加重，而治療組明顯抑制了高氧誘導(dǎo)的腦組織炎癥反應(yīng)。TUNEL 染色結(jié)果表明，高氧組第3、7、14天海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)均較對照組增高，而治療組凋亡指數(shù)較高氧組降低(P均<0.05)。高氧組第3、7、14天腦組織Caspase-3相對表達(dá)量均較空氣組升高(P均<0.05)，治療組第7、14天較高氧組降低(P均<0.05)，治療組與空氣組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。高氧組第7、14天腦組織Bcl-2相對表達(dá)量較空氣組降低(P均<0.05)，治療組第7、14天較高氧組升高(P均<0.05)，治療組與空氣組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論rEPO能減輕高氧所致的腦損傷，可能與其下調(diào)腦組織中Caspase-3及上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

高氧腦損傷；重組人促紅細(xì)胞生成素；Caspase-3；Bcl-2；大鼠

高濃度氧療是呼吸窘迫早產(chǎn)兒最常用的治療方法之一。但高氧可增加腦細(xì)胞內(nèi)致炎細(xì)胞因子、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死、炎癥反應(yīng)，通過誘導(dǎo)促炎因子和抑制生長因子信號級聯(lián)反應(yīng)來誘發(fā)廣泛的神經(jīng)退行性病變[1]，從而引起腦損傷。促紅細(xì)胞生成素(EPO)是一類肽類激素，是由166個氨基酸殘基構(gòu)成的唾液酸糖蛋白。EPO通過抑制細(xì)胞凋亡、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管再生等途徑減輕高氧腦損傷。重組人促紅細(xì)胞生成素(rEPO)可通過抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡、抗氧化、抗炎性反應(yīng)來維持腦血管正常結(jié)構(gòu)和功能，保護(hù)腦組織。2016年7～12月，我們通過制備新生大鼠高氧腦損傷模型，觀察大鼠海馬組織病理學(xué)變化和海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，并檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bcl-2的表達(dá)，探討rEPO治療高氧腦損傷的作用機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 普通級Wistar新生大鼠90只，體質(zhì)量10～15 g，雌雄不限。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由飲水、進(jìn)食。rEPO購自哈藥集團(tuán)生物工程有限公司，Caspase-3抗體和Bcl-2抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 動物分組與處理 將大鼠隨機(jī)分為空氣組、高氧組、治療組各30只?？諝饨M置于空氣中飼養(yǎng)，高氧組和治療組置于氧濃度80%±2%的高氧模型箱中，三組均保持溫度20～25 ℃、濕度70%左右。在新生鼠出生后第2天開始，對治療組腹腔內(nèi)注射rEPO，3 000 U/kg，連續(xù)13 d，空氣組注射相同劑量的生理鹽水。于實(shí)驗(yàn)第3、7、14天每組各處死10只新生鼠，取出大腦。

1.3 海馬組織病理學(xué)檢查 將新生鼠大腦放入4%中性甲醛中固定，經(jīng)過脫水、石蠟包埋、5 μm厚切片。行HE染色，光鏡下觀察海馬組織病理學(xué)變化。

1.4 海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況觀察 將腦組織包埋切片，運(yùn)用核染色結(jié)合TUNEL染色技術(shù)，在熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況。 每張切片記錄 500 個腦細(xì)胞，計(jì)算每 100 個細(xì)胞內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)，以百分?jǐn)?shù)表示神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.5 腦組織Caspase-3、Bcl-2蛋白檢測 采用Western blotting法。將腦組織充分剪碎、勻漿，加入細(xì)胞裂解液提取組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度。凝膠電泳分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，300 mA恒流40 min。封閉液封閉后PVDF膜過夜，TBS-T緩沖液中充分振蕩清洗，分別滴加一、二抗，一、二抗終濃度稀釋比例為1∶2 000，ECM顯色。X線曝光后顯影、定影、晾干。使用凝膠成像系統(tǒng)掃描，圖像分析軟件對吸光度進(jìn)行分析，以目標(biāo)蛋白與β-actin吸光度的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 三組海馬組織病理變化比較 空氣組海馬組織細(xì)胞形態(tài)正常，排列緊密整齊，形態(tài)完整，細(xì)胞核圓而大，核仁清晰，神經(jīng)纖維密集，排列整齊。高氧組第3天海馬組織部分細(xì)胞出現(xiàn)水腫及破裂，部分細(xì)胞核溶解、固縮，炎癥細(xì)胞略增多，海馬組織結(jié)構(gòu)破壞；第7天海馬組織水腫及破裂的細(xì)胞較第3天明顯增加，核溶解、固縮的細(xì)胞增加，炎癥細(xì)胞明顯增加；第14天以上變化較前加重，海馬結(jié)構(gòu)紊亂。治療組第3、7、14天海馬組織的病理變化均較高氧組有所減輕。

2.2 三組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較 高氧組第 3 、7 、14 天與空氣組比較海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)增高(P均<0.05)；治療組第3、7、14天與高氧組比較細(xì)胞凋亡指數(shù)降低(P均<0.05)。治療組與空氣組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 三組各時(shí)間點(diǎn)海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

注：與高氧組比較，*P<0.05。

2.3 三組腦組織Caspase-3相對表達(dá)量比較 高氧組第3、7、14天腦組織Caspase-3相對表達(dá)量均較空氣組升高(P均<0.05)；治療組第7、14天較高氧組降低(P均<0.05)，治療組與空氣組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

2.4 三組腦組織Bcl-2相對表達(dá)量比較 高氧組第7、14天腦組織Bcl-2相對表達(dá)量較空氣組降低(P均<0.05)；治療組第7、14天較高氧組升高(P均<0.05)，治療組與空氣組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表3。

表2 三組各時(shí)間點(diǎn)腦組織Caspase-3相對表達(dá)量比較

注：與高氧組比較，*P<0.05。

表3 三組各時(shí)間點(diǎn)腦組織Bcl-2相對表達(dá)量比較

注：與高氧組比較，*P<0.05。

3 討論

氧療是重癥監(jiān)護(hù)室最常用的治療方法之一，對呼吸窘迫的治療效果尤為突出。高壓氧治療能有效改善微循環(huán)及缺氧，減輕腦水腫，但易引起氧療并發(fā)癥，其中最易受損的器官為腦、肺和視器。隨著極低出生體重兒存活率的提高，高氧所致的腦損傷也隨之上升。細(xì)胞凋亡是神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要形式，其病理改變是選擇性神經(jīng)細(xì)胞損傷，啟動細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡。有研究[2]顯示，在高氧引起海馬氧化應(yīng)激時(shí)，不論氧化途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還是炎癥途徑，均可誘發(fā)廣泛的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引起高氧腦損傷后發(fā)生細(xì)胞凋亡及其凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。本研究顯示，腦組織暴露于高濃度氧時(shí)海馬神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，隨著高氧時(shí)間延長，凋亡指數(shù)增高。

Bcl-2和Caspase是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因，在細(xì)胞凋亡不同階段起不同的調(diào)控作用[3]。Caspase-3是Caspase家族中最重要的細(xì)胞凋亡效應(yīng)蛋白，是凋亡的執(zhí)行者[4]。細(xì)胞外的環(huán)境中尚存在其作用底物，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，故認(rèn)為抑制Caspase-3信號通路可能是治療腦損傷的途徑之一[5]。細(xì)胞凋亡胞內(nèi)信號途徑是使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞質(zhì)引起凋亡，這一過程受Bcl-2蛋白調(diào)控。Bcl-2是抗凋亡基因，Bcl-2家族可控制激活或抑制凋亡[6，7]，從而決定一個細(xì)胞生存或啟動細(xì)胞凋亡途徑來回應(yīng)細(xì)胞內(nèi)的破壞。缺氧缺血腦損傷后大鼠腦組織中Caspase-3的表達(dá)量與神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量均明顯增加[8]，腦創(chuàng)傷后神經(jīng)細(xì)胞會發(fā)生凋亡，而凋亡的發(fā)生與Caspase-3、Bcl-2等蛋白的調(diào)節(jié)有關(guān)[9]。本研究顯示，高氧組比空氣組Caspase-3表達(dá)量增加，Bcl-2表達(dá)量減少，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

對嚙齒類動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷难芯匡@示，EPO顯著影響缺氧缺血、中毒的多個信號通路，EPO可通過抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡及活化、阻斷興奮性氨基酸神經(jīng)毒性、阻止一氧化氮生成及減輕炎癥反應(yīng)等，發(fā)揮對腦組織的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)[10，11]。EPO是神經(jīng)生存的有效促進(jìn)劑，它通過降低神經(jīng)系統(tǒng)的新陳代謝、神經(jīng)毒性以及興奮性毒性應(yīng)激來抵抗神經(jīng)細(xì)胞損傷[12]。保護(hù)神經(jīng)免受谷氨酸毒性和自由基損傷，可能是EPO在高氧腦損傷治療中的兩種可能的治療機(jī)制[13]。EPO的深入研究發(fā)現(xiàn)，在高氧腦損傷中，通過外源性地增加EPO的濃度，也可以增加大腦中EPO的濃度，從而攜帶走氧氣，使大腦中的氧濃度降低到生理范圍之內(nèi)，抑制氧化酶的激活，切斷ROS的原料供給，致使其濃度下降，從而抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的持續(xù)發(fā)生，減輕大腦損傷。rEPO是一種通過基因重組技術(shù)合成的糖蛋白，與天然EPO有著相同氨基酸序列，生物學(xué)活性也相似，rEPO已經(jīng)被證實(shí)是預(yù)防早產(chǎn)兒貧血的一種有效藥物。楊曉等[14]報(bào)道，EPO能減少新生鼠壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)發(fā)生率，使NEC新生大鼠Bcl-2表達(dá)增加、Caspase-3表達(dá)減少，抑制細(xì)胞凋亡，對腸道起保護(hù)作用。rEPO在高氧誘導(dǎo)的腦損傷的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)與伴隨而來的各種急性蛋白質(zhì)的改變這一過程有明顯關(guān)系[15]。本研究通過檢測Caspase-3以及抑制凋亡的主要抗凋亡因子Bcl-2蛋白表達(dá)水平來明確高氧腦損傷是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)。結(jié)果顯示，rEPO治療能降低新生大鼠高氧腦組織Caspase-3表達(dá)，抑制Bcl-2降低。

綜上所述，rEPO具有保護(hù)腦組織免受高氧損傷的作用，其機(jī)制與下調(diào)Caspase-3、上調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

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