檢測(cè)真菌毒素酶聯(lián)免疫試劑盒的篩選

梁利軍，王麗娟

（1.山西省糧油科學(xué)研究所，山西太原 030024；2.山西糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，山西太原 030024）

檢測(cè)真菌毒素酶聯(lián)免疫試劑盒的篩選

梁利軍1，王麗娟2

（1.山西省糧油科學(xué)研究所，山西太原 030024；2.山西糧食質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心，山西太原 030024）

真菌毒素是糧油食品的主要污染物之一，在適宜的條件下不斷產(chǎn)生，它們廣泛存在并一直威脅著人類和動(dòng)物的健康。隨著全球經(jīng)濟(jì)一體化的進(jìn)程，對(duì)真菌毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)越來越嚴(yán)格，對(duì)檢測(cè)技術(shù)也提出了更高的要求。收集了7種ELISA試劑盒的相關(guān)資料，通過對(duì)其主要參數(shù)進(jìn)行分析，為用戶選擇試劑盒提出了相關(guān)建議。

酶聯(lián)免疫試劑盒；真菌毒素；篩選；性能

據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO） 報(bào)告，全球每年約有25%的農(nóng)作物遭受不同程度的真菌毒素污染，據(jù)估算全球每年因真菌毒素污染而造成的直接或間接損失達(dá)數(shù)百億美元[1]。目前，我國某些地區(qū)農(nóng)作物中真菌毒素污染嚴(yán)重，有的甚至超過國家限量標(biāo)準(zhǔn)的幾十倍，是糧食安全的重大隱患，真菌毒素的有效監(jiān)測(cè)已列入當(dāng)前食品安全監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)。建立在酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）技術(shù)基礎(chǔ)上的真菌毒素快速檢測(cè)試劑盒，以其快速簡(jiǎn)便、價(jià)格相對(duì)低廉的特點(diǎn)，已在糧食的真菌毒素檢驗(yàn)工作中廣泛使用。目前，諸多商品化的ELISA快速檢測(cè)試劑盒的面世為人們提供了更多選擇機(jī)會(huì)。在選擇ELISA快速檢測(cè)試劑盒過程中，收集了7種ELISA試劑盒的相關(guān)資料，通過對(duì)技術(shù)指標(biāo)、操作條件、特異性等方面的比對(duì)分析提出的一些選擇建議。

1 技術(shù)指標(biāo)

不同品牌的ELISA快速檢測(cè)試劑盒的各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)存在著一定的差異。

黃曲霉毒素B1的技術(shù)指標(biāo)見表1，嘔吐毒素的技術(shù)指標(biāo)見表2，玉米赤霉烯酮的技術(shù)指標(biāo)見表3。

表1 黃曲霉毒素B1的技術(shù)指標(biāo)

表2 嘔吐毒素的技術(shù)指標(biāo)

1.1 檢測(cè)范圍

在我國市場(chǎng)銷售的ELISA試劑盒，其檢測(cè)范圍基本都覆蓋國內(nèi)的限量標(biāo)準(zhǔn)，但各種ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)溶液表達(dá)方式和標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度有差異。

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線的表達(dá)方式

標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線采用了2種表達(dá)方式：一種是將稀釋倍數(shù)包含在標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線中，按照ELISA試劑盒的說明書操作，可直接讀出樣品中真菌毒素的含量，如國產(chǎn)2和進(jìn)口1；另外一種是在標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線中查到樣品的濃度，再通過計(jì)算得到樣品中真菌毒素的含量，如國產(chǎn)1、進(jìn)口2等5種。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的工作曲線濃度范圍

7種ELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度范圍有較大差異，濃度范圍最大的是0～8.1 ng/mL，濃度范圍最小的是0～0.8 ng/mL。

濃度范圍較寬的曲線見圖1，濃度范圍較窄的曲線見圖2。

表3 玉米赤霉烯酮的技術(shù)指標(biāo)

圖1 濃度范圍較寬的曲線

圖2 濃度范圍較窄的曲線

由于ELISA方法中吸光度比值的百分率與濃度對(duì)數(shù)成相關(guān)性，低濃度時(shí)對(duì)應(yīng)的吸光度比值百分率變化大，而高濃度時(shí)對(duì)應(yīng)的吸光度比值百分率變化小。例如，黃曲霉毒素B1質(zhì)量濃度在0.1～1.0 ng/mL時(shí)，吸光度比值的百分率變化為95%～28%；質(zhì)量濃度在1.0～10.0 ng/mL時(shí)，吸光度比值的百分率變化為28%～14%，其中質(zhì)量濃度在5.0～10.0 ng/mL時(shí)，吸光度比值的百分率變化只有約3%。質(zhì)量濃度低時(shí)工作曲線的線性較好，濃度高時(shí)工作曲線的線性較差，說明濃度高的區(qū)域重現(xiàn)。

在選擇ELISA試劑盒時(shí)，如果檢測(cè)目的是進(jìn)行初步篩查，盡量選擇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍較寬的ELISA試劑盒；如果檢測(cè)目的是對(duì)毒素進(jìn)行定量檢測(cè)，就需要選擇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度范圍較窄的ELISA試劑盒。對(duì)毒素含量較高的樣品定量檢測(cè)時(shí)，還需將樣品溶液稀釋，樣品溶液的濃度盡量落在標(biāo)準(zhǔn)溶液工作曲線的前端進(jìn)行測(cè)試。

1.2 變異系數(shù)

由于ELISA試劑盒的制作工藝和質(zhì)量控制的不同，其批內(nèi)和批間都有一定的差異。批內(nèi)、批間的差異是影響重現(xiàn)性的主要因素，是選擇試劑盒的關(guān)鍵所在。批內(nèi)、批間變異系數(shù)越低，試劑盒的重現(xiàn)性、精密度越好。進(jìn)口試劑盒批內(nèi)、批間變異系數(shù)＜10%。批間誤差可通過控制采購量，盡量做到每批檢測(cè)使用同一批次的ELISA試劑盒。

2 操作條件

不同品牌的ELISA試劑盒，其操作條件存在著較大的差異。

黃曲霉毒素B1的操作條件見表4，嘔吐毒素的操作條件見表5，玉米赤霉烯酮的操作條件見表6。

表4 黃曲霉毒素B1的操作條件

表5 嘔吐毒素的操作條件

2.1 提取時(shí)間

7種ELISA試劑盒的提取時(shí)間在2～20 min，但使用的提取劑并無大的差異，在購買ELISA試劑盒時(shí)盡量選擇提取時(shí)間較短的產(chǎn)品，這樣可縮短整個(gè)試驗(yàn)的操作時(shí)間。

2.2 孵育溫度

孵育溫度有室溫和37℃2種。37℃孵育需恒溫、恒濕設(shè)備；室溫孵育的ELISA試劑盒不需輔助設(shè)備，在操作時(shí)比較方便。

2.3 孵育次數(shù)和時(shí)間

ELISA試劑盒在檢測(cè)毒素時(shí)孵育次數(shù)和時(shí)間是決定檢測(cè)速度的重要因素，各種ELISA試劑盒的孵育次數(shù)和時(shí)間不同。例如，嘔吐毒素孵育次數(shù)多的為3次，孵育時(shí)間長(zhǎng)達(dá)105 min；孵育次數(shù)少的為2次，孵育時(shí)間僅為8 min，最少相差97 min（每次孵育后都需要洗板，孵育次數(shù)多的洗板次數(shù)增加，消耗的時(shí)間要多）。

孵育溫度無需嚴(yán)格控制、孵育次數(shù)少、孵育時(shí)間短的ELISA試劑盒的內(nèi)在質(zhì)量較優(yōu)。

在ELISA試劑盒的選擇時(shí)要注意操作條件的差異，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)備條件和檢驗(yàn)任務(wù)量的多少?zèng)Q定。選擇提取時(shí)間、孵育時(shí)間短，孵育次數(shù)少，并且在室溫即可孵育的ELISA試劑盒可減少操作誤差，提高檢測(cè)效率。

3 特異性

表6 玉米赤霉烯酮的操作條件

特異性一般用交叉反應(yīng)率來表達(dá)，交叉反應(yīng)是指試劑盒中包被的抗體與目標(biāo)測(cè)定物及相似的物質(zhì)的反應(yīng)能力。例如，測(cè)定黃曲霉毒素B1的試劑盒可能也會(huì)與黃曲霉毒素B2，黃曲霉毒素G1，黃曲霉毒素G1，黃曲霉毒素M1發(fā)生不同程度的交叉反應(yīng)，其他物質(zhì)的交叉反應(yīng)率越高，說明試劑盒的特異性越差，出現(xiàn)假陽性的幾率就越大。目前，未收集到國產(chǎn)試劑盒的交叉反應(yīng)率，大部分進(jìn)口試劑盒都提供交叉反應(yīng)率?？陀^上試劑盒都存在交叉反應(yīng)，提供交叉反應(yīng)率的試劑盒在排除假陽性時(shí)有目標(biāo)，未提供交叉反應(yīng)率的試劑盒存在假陽性的不確定性較大，如果出現(xiàn)陽性結(jié)果，要以其他方式（如液相色譜等方法）加以驗(yàn)證，以便得到比較可靠的數(shù)據(jù)。

3種毒素（AFB1、DON、ZEN） 的交叉反應(yīng)率見表7，黃曲霉毒素B1的交叉反率見表8，嘔吐毒素的交叉反率見表9，玉米赤霉烯酮的交叉反率見表10。

由表7可見，6個(gè)品牌的產(chǎn)品與3種毒素（AFB1，DON，ZEN） 的交叉反應(yīng)率都是100%，有一個(gè)品牌未提供。有3個(gè)品牌的產(chǎn)品提供了3種毒素（AFB1，DON，ZEN） 分別與相關(guān)物質(zhì)的交叉反應(yīng)，并且與相關(guān)物質(zhì)的交叉反應(yīng)差別較大，其余4個(gè)品牌的產(chǎn)品未提供。

表7 3種毒素（AFB1，DON，ZEN） 的交叉反應(yīng)率/%

表8 黃曲霉毒素B1的交叉反應(yīng)率/%

表9 嘔吐毒素的交叉反應(yīng)率/%

表10 玉米赤霉烯酮的交叉反應(yīng)率/%

4 結(jié)論

綜上所述，ELISA試劑盒的選用應(yīng)從技術(shù)指標(biāo)、操作條件的差異、特異性和檢驗(yàn)?zāi)康牡确矫婢C合考慮。在技術(shù)性能方面滿足實(shí)驗(yàn)室要求的前提下，再考慮成本問題，最終選擇適合實(shí)驗(yàn)室的ELISA試劑盒。

[1]郭衛(wèi)，韓小賢，李洋，等.糧油食品中真菌毒素的研究進(jìn)展 [J].食品工程，2010（7）：104.

[2]中華人民共和國國家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì).GB 5009.22—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016：10-12.

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.GB 5009.111—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙酰衍生物的測(cè)定 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016：53-61.

[4]GB 5009.209—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定 [S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2016：25-30.◇

Screening of Enzyme-linked Immunosorbent Kit in Detection Mycotoxin

LIANG Lijun1，WANG Lijuan2
（1.Shanxi Institute of Grain and Oil Science，Taiyuan，Shanxi 030024，China；2.Shanxi Food Quality Monitoring Center，Taiyuan，Shanxi 030024，China）

Mycotoxins is one of the main pollutants of the grain and oil food.Under the condition of appropriate，they are constantly produced widespread and have been threatening the health of humans and animals.As the global economic integration process，the standard of the limit to of mycotoxins has become more and more strict，the detection technology is also put forward higher requirements.This paper collected seven ELISA kit of related data to make some proposals for the kit choosing through the analysis of its main parameters.

ELISA KIT；mycotoxins；filtrate；performance

R155.5

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.11.016

1671-9646（2017） 11a-0053-03

2017-09-23

梁利軍（1985— ），女，本科，助理工程師，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。