PNL2在黑素瘤中的表達(dá)及意義

熱依拉·莫合塔爾+康曉靜+羅東

[摘要]目的：通過(guò)檢測(cè)PNL2單克隆抗體在不同類別黑素瘤中的表達(dá)情況，探討PNL2在黑素瘤診斷中的意義。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)47例黑素瘤（黏膜黑素瘤11例，肢端黑素瘤24例，非肢端黑素瘤12例），10例正常皮膚組織中PNL-2，S-100，HMB-45的表達(dá)情況，分析它們與患者臨床生物病理特征的關(guān)系。結(jié)果：黑素瘤組PNL-2陽(yáng)性率為87.23%（41/47），正常皮膚的表達(dá)率為10%（1/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；PNL-2檢測(cè)靈敏度和特異性分別為87.23%（41/47）和90%（9/10）；其在黑素瘤中的陽(yáng)性率與年齡、Clark分級(jí)有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與性別、民族、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P>0.05）；肢端和非肢端黑素瘤中PNL2與S100、HMB45的表達(dá)差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；黏膜黑素瘤中PNL2表達(dá)陽(yáng)性率明顯大于S100、HMB45（P<0.05）。結(jié)論：PNL2對(duì)黑素瘤具有高特異性，可以作為診斷黑素瘤的一種新的生物標(biāo)記物，尤其對(duì)黏膜黑素瘤的診斷有一定意義。

[關(guān)鍵詞]黑素瘤；PNL2單克隆抗體；黏膜黑素瘤；免疫組標(biāo)記物

[中圖分類號(hào)]R739.5 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2017）-10-0053-04

Abstract： Objective To detect the expression of PNL2 in different types of melanoma and to explore the meaning of the auxiliary diagnosis of melanoma. Methods We detected the expression of PNL2，S100 and HMB45 in 47 cases of melanoma （11 of mucosa， 24 of acromegaly and 12 of non-acra ） and 10 cases of normal skin tissue using immunohistochemistry and analyzed their relationship with the clinical pathological characteristics. Results The positive rate of PNL2 was 87.23% （41/47） in melanoma group and 10%（1/10）in normal skin. The difference was statistically significant（P<0.05）. The sensitivity and specificity were 87.23% （41/47） and 90%（9/10） respectively.The positive rate of PNL2 in melanoma was significantly related with Age and Clark grade（P<0.05） and not significantly with gender， nationality and the of lymph node metastasis（P>0.05）. Conclusion PNL2 is highly specific for melanoma and can be used as a new biomarker for the diagnosis of melanoma， especially for the diagnosis of mucosal melanoma

Key words： melanoma； PNL2； immunohistochemical markers

惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是一種來(lái)源于黑色素細(xì)胞的惡性程度極高的皮膚腫瘤，常發(fā)生在皮膚和鄰近皮膚的黏膜、眼球的色素膜和腦膜的脈絡(luò)膜叢，亦可見(jiàn)于消化道黏膜及手足等處[1-3]，它可廣泛浸潤(rùn)皮膚表皮至皮下組織或黏膜及黏膜深層組織，甚至相鄰器官，并可通過(guò)淋巴結(jié)、血道遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或廣泛播散[4]。近年來(lái)隨著社會(huì)的發(fā)展、生活環(huán)境的改變，其發(fā)病率正在逐年增加。目前國(guó)內(nèi)外的研究仍然缺少對(duì)惡性黑色素瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移預(yù)后及治療的可靠指標(biāo)，對(duì)其發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不十分清楚[5]。惡性黑色素瘤病理診斷存在一定困難，免疫組織化學(xué)技術(shù)是診斷惡性黑色素瘤的重要輔助診斷方法，尤其對(duì)于惡性黑色素瘤的早期診斷、預(yù)后評(píng)估及治療發(fā)展過(guò)程具有重要意義[6]。腫瘤標(biāo)記物可由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生或由非腫瘤細(xì)胞，如與腫瘤有關(guān)的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生，可存在于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面[7]。由于血清腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)簡(jiǎn)便易行，在腫瘤學(xué)中的應(yīng)用日益廣泛，但在黑素瘤中大多數(shù)血清腫瘤標(biāo)記物的敏感性和特異性都不高，并且大多數(shù)在疾病晚期才高表達(dá)，因而不適于早期和亞臨床期[8]。新的黑素瘤生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)及其臨床應(yīng)用價(jià)值的研究具有重要意義，通過(guò)對(duì)黑素瘤建立一種更加準(zhǔn)確的具有治療意義的腫瘤分期和分類方法，提高黑素瘤早期檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性[9]。PNL2是一種研究較少的黑素瘤相關(guān)抗原單克隆抗體，我們參照少有的研究成果，根據(jù)黑素瘤的進(jìn)展和是否發(fā)生轉(zhuǎn)移及其組織特異性將黑素瘤分為肢端黑素瘤、非肢端黑素瘤和黏膜黑素瘤。然后用PNL2、S100、HMB45對(duì)三型黑素瘤進(jìn)行染色標(biāo)記，了解PNL2在黑素瘤中的表達(dá)。

1 材料和方法

1.1 材料：47例黑素瘤組織標(biāo)本均來(lái)自本院皮膚科及病理科2004年12月-2014年9月存檔蠟塊，病史完整。全部標(biāo)本均未做化療、放療及抗免疫治療，經(jīng)手術(shù)切除后病理學(xué)檢查確診。其中維吾爾族23例，漢族24例；男26例，女21例；年齡28～92歲，平均（61.85±13.95）歲；組織學(xué)Clark分級(jí)及發(fā)生部位情況：Ⅰ～Ⅲ級(jí)21例，Ⅳ～Ⅴ級(jí)26例；肢端黑素瘤24例，非肢端黑素瘤12例，黏膜黑素瘤11例。另選擇10例普外科及整形科因外傷切除的石蠟包埋的正常皮膚組織作為對(duì)照組，對(duì)照組10例中維吾爾族5例，漢族5例；男5例，女5例。endprint

1.2 試劑：S100單克隆抗體ab115968、HMB45單克隆抗體ab787、小鼠PNL2單克隆抗體ab12502（IgG1，上海市艾博抗貿(mào)易有限公司）；鼠兔通用型二抗，二氨基聯(lián)苯胺（DAB） 顯色劑均購(gòu)自上海市艾博抗貿(mào)易有限公司。

1.3 方法：嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。免疫組織化學(xué)法：將10%福爾馬林固定、石蠟包埋的黑素瘤組織制成4～5μm切片，常規(guī)烤片、脫蠟、水化；浸入0.01mol/L，pH值為6.0的枸櫞酸鹽緩沖液內(nèi)，熱抗原修復(fù)3min；在3%H2O2、室溫下作用10min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶；滴加一抗（稀釋度為1：800）；4℃過(guò)夜后在室溫中復(fù)溫20min；后滴加1mm EDTA緩沖液，滴加一抗（稀釋度為1：10～1：25），調(diào)pH值為9.0的稀釋液中進(jìn)行原位染色，熱抗原修復(fù)3min；室溫孵育30～60min；DAB顯色1min左右；自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，通透、脫水，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。PBS代替一抗作為空白對(duì)照，已知PNL2、S100、HMB45染色陽(yáng)性的黑素瘤切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)：所有切片在做免疫組化前均現(xiàn)切現(xiàn)用，所有免疫組化結(jié)果由2位病理科專家雙盲閱片判讀結(jié)果，免疫組化陽(yáng)性染色結(jié)果為大多數(shù)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞漿棕黃色著色，陰性為不著色或單一孤立的胞核著色、零星細(xì)胞的單一淺著色、單核巨噬細(xì)胞著色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：將觀察數(shù)據(jù)錄入到excel2014版表格中進(jìn)行函數(shù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PNL2單克隆抗體在黑素瘤和正常皮膚組織中的表達(dá)：PNL2單克隆抗體在黑素瘤和正常皮膚組織中染色陽(yáng)性分別為41例和1例，染色陽(yáng)性率分別為87.23%和10%，兩組表達(dá)率的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05） 。見(jiàn)圖1、2。

2.2 PNL2單克隆抗體的靈敏度和特異性：PNL2免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前患者病理組織切片免疫染色金標(biāo)準(zhǔn)相比較，在47例黑素瘤患者中，PNL2染色陽(yáng)性結(jié)果41例，陰性6例。對(duì)照組有1例出現(xiàn)假陽(yáng)性，PNL2靈敏度和特異性分別為87.23%（41/47）和90%（9/10）。見(jiàn)表1。

2.3 PNL2染色陽(yáng)性與惡性黑素瘤患者臨床表型的相關(guān)性：PNL2染色陽(yáng)性與惡性黑素瘤患者主要臨床病理資料間的關(guān)系見(jiàn)表2。PNL2在年齡、Clark分級(jí)方面，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；患者性別、民族、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等單因素對(duì)黑色素瘤PNL2染色陽(yáng)性均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 三種類型黑素瘤中S100、PNL2、HMB45的表達(dá)結(jié)果：對(duì)比各型黑素瘤中PNL2和S100，PNL2和HMB45的陽(yáng)性率大小，肢端和非肢端黑素瘤中PNL2和S100，PNL2和HMB45兩組的陽(yáng)性率大小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；黏膜黑素瘤中PNL2染色陽(yáng)性率明顯大于S100、HMB45（P<0.05）。見(jiàn)表3。

3 討論

PNL2蛋白（PNL2 protein，簡(jiǎn)稱PNL2）是一種抗黑素瘤相關(guān)抗原單克隆抗體，在黑素瘤相關(guān)免疫標(biāo)記物中研究相對(duì)較少。Rochaix等[10]2003年首次提出PNL-2是一種新的單克隆抗體、主要針對(duì)抗黑素細(xì)胞抗原。最初，PNL2是以人生長(zhǎng)抑素受體為抗原而生產(chǎn)的單克隆抗體，理論上該重組蛋白可以與人生長(zhǎng)抑素受體第2亞型（SST2）的羧基端相結(jié)合。最終發(fā)現(xiàn)PNL2不能與SST2相結(jié)合，但可以與黑素細(xì)胞和粒細(xì)胞中的某種未知抗原相結(jié)合。目前與PNL2相對(duì)應(yīng)的抗原尚未明確。

本研究針對(duì)PNL2檢測(cè)靈敏度和特異性分別為87.23%（41/47）和91.49%（43/47），可見(jiàn)PNL2的特異度較高。與傳統(tǒng)抗體S100、HMB45相比在診斷肢端黑素瘤和非肢端黑素瘤，PNL2并未顯示出優(yōu)勢(shì)；但在黏膜黑素瘤中S100和HMB45的表達(dá)均低，而PNL2卻相對(duì)表達(dá)高，與此同時(shí)，相比肢端、非肢端黑素瘤而言，PNL2的陽(yáng)性率在黏膜黑素瘤中陽(yáng)性率最高，達(dá)72.73%，可見(jiàn)PNL2尤其適合S-100和HMB45陽(yáng)性率低的黏膜黑素瘤的診斷。Morris等[11]曾用PNL2在9例均起源于鼻腔鼻竇黏膜黑素瘤中的試驗(yàn)結(jié)果顯示，4例彌漫性陽(yáng)性染色中PNL2陽(yáng)性率為77.8%，HMB45為77.8%，Melan A為50%，S100為87.5%和MITF為40%。另外3例PNL2優(yōu)于Melan A和MITF。類比HMB45對(duì)黏膜黑素瘤的高靈敏度，PNL-2對(duì)黏膜黑素瘤的靈感度較高，優(yōu)于Melan A和MITF，且特異性優(yōu)于S100。因此，Morris等[11]提出PNL2可作為頭頸部黏膜黑素瘤診斷的重要輔助指標(biāo)。

Aung等[12]的研究發(fā)現(xiàn)在黏膜黑素瘤中，PNL2陽(yáng)性率很高，可替代黏膜黑素瘤陰性率較高的S100、KBA62等免疫標(biāo)記物。由于位于頭部和頸部的黏膜黑素瘤的組織學(xué)診斷較為困難，且免疫組化染色在皮膚病變的表達(dá)結(jié)果并不可靠。與Rochaix等[10] 的研究相比，他們發(fā)現(xiàn)PNL2免疫染色標(biāo)記廣泛應(yīng)用于正?；驉盒匀祟惤M織和各種黑素細(xì)胞病變范圍的分析，有很高的特異性，給予皮膚黏膜和口腔黏膜黑素細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和粒細(xì)胞免疫組化染色時(shí)，PNL2顯示高表達(dá)。與本次研究結(jié)果相同。

本研究發(fā)現(xiàn)PNL2在正常對(duì)照組的黑素細(xì)胞中不表達(dá)，對(duì)照組出現(xiàn)1例假陽(yáng)性，考慮到Rochaix等[10]指出在不同的痣組織學(xué)類型如皮內(nèi)痣、表皮痣和混合痣，PNL2大多數(shù)都是陰性，只有散在分布的痣細(xì)胞在其真皮乳頭層才能被標(biāo)記。因此，推測(cè)出現(xiàn)假陽(yáng)性可能與分布真皮乳頭層的痣細(xì)胞有關(guān)。另外，根據(jù)Busam等[9]采用傳統(tǒng)的石蠟組織切片和幾種組織微陣列板，檢測(cè)PNL2、Melan A/MART-1（A103）、Tyrosinase（T311）、HMB45（GP100）和MITF（D5）在黑素瘤中的免疫反應(yīng)，得出除了血管平滑肌脂肪瘤、慢性髓性白血病和惡性異型外周神經(jīng)鞘瘤（惡性Triton腫瘤）這三種非黑素瘤的PNL2表達(dá)陽(yáng)性，其余非黑素瘤均為陰性。正常黑素細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞及黑素細(xì)胞病變良性痣以及原發(fā)性惡性黑素瘤尤其是上皮樣的變體，均顯示PNL2表達(dá)陽(yáng)性（但不包括其它正常的細(xì)胞類型）。因此，推測(cè)正常對(duì)照組假陽(yáng)性與三種非黑素瘤和上皮樣變體有關(guān)。endprint

PNL2在黑素瘤中的陽(yáng)性率與Clark分級(jí)有一定的關(guān)系，可見(jiàn)Clark分級(jí)偏中、晚期的黑素瘤PNL2陽(yáng)性率明顯高于Clark分級(jí)偏早期患者，與Ramos-Vara等[10]提出PNL2早期免疫染色黑素瘤患者，其陽(yáng)性率較低的結(jié)果一致?？梢?jiàn)，PNL2同S100、HMB45、Melan A、Tyrosinase、MITF等黑素瘤免疫標(biāo)記抗體一樣，對(duì)黑素瘤早期診斷的效果欠佳。本研究年齡大于60歲的黑素瘤患者PNL-2陽(yáng)性率顯著高于小于60歲的患者，鑒于Mayer等[11]的研究指出大于60歲的黑素瘤患者基礎(chǔ)疾病較多，加上心理負(fù)擔(dān)等綜合因素使得他們的疾病進(jìn)展較快，可能大多處于中晚期黑素瘤，故PNL2的陽(yáng)性率較高。Mayer等[11]還報(bào)道近幾十年來(lái)男性由于社會(huì)、心理負(fù)擔(dān)較女性大，其黑素瘤進(jìn)展較快，但本研究性別對(duì)PNL2染色陽(yáng)性率無(wú)影響，可能與近些年女性的社會(huì)及心理壓力也逐年增長(zhǎng)有關(guān)。

免疫組化是一種廣泛用于日常病理診斷試驗(yàn)的一種檢測(cè)技術(shù)，是一種具有精確、快速、費(fèi)用低等特點(diǎn)[12]。PNL2是一種研究較少的黑素瘤相關(guān)抗原單克隆抗體。其對(duì)黑素瘤具有普遍高特異性，尤其對(duì)其它標(biāo)記物陽(yáng)性率低的黏膜黑素瘤。因此，更多有關(guān)PNL2蛋白以及基因組的研究應(yīng)受到人們的重視，以增加這種標(biāo)記的臨床應(yīng)用，并有望用于黑素瘤的靶向治療、預(yù)后判斷、指導(dǎo)患者用藥及為黑素瘤h患者提供最佳的個(gè)體化治療方案。

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[收稿日期]2017-01-10 [修回日期]2017-09-20

編輯/張惠娟endprint