黑素瘤干細(xì)胞在黑素瘤轉(zhuǎn)移中的研究進(jìn)展

尹起亮，于佳弘，徐 夢，杜曉雪

黑素瘤是起源于皮膚黑素細(xì)胞的一種惡性腫瘤，其惡性程度高，易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，約占皮膚癌相關(guān)死亡人數(shù)的75%[1-2]，對放療和化療抵抗明顯。分子靶向治療和免疫治療雖已證實(shí)可一定程度延長患者的生存期[3-4]，但大多數(shù)患者在1年內(nèi)出現(xiàn)耐藥[5]。因此，傳統(tǒng)的治療方法并不能取得令人滿意的療效。近年來，隨著腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cells，TSCs）學(xué)說的興起，已有證據(jù)顯示TSCs可能是腫瘤轉(zhuǎn)移的起源細(xì)胞[6-7]。TSCs是腫瘤組織中具有自我更新和分化潛能的一組細(xì)胞，由于其在體內(nèi)處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，具有抵抗放療和化學(xué)藥物的作用，同時存在特異性表面標(biāo)志物，表現(xiàn)出高度耐藥的特性，因此TSCs被認(rèn)為是引發(fā)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源TSCs[8-9]。既往研究提出，腫瘤轉(zhuǎn)移的實(shí)質(zhì)就是TSCs的轉(zhuǎn)移和歸巢[10]。同樣，黑素瘤干細(xì)胞（melanoma stem cells，MSCs）在黑素瘤轉(zhuǎn)移中亦扮演著重要的角色。MSCs對化療藥物耐受也解釋了傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物僅能抑制或縮小腫瘤，而不能完全根除，最終還是出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[11-12]。雖然目前尚未完全闡明MSCs促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的機(jī)制[13-14]，但MSCs可以表達(dá)多種細(xì)胞標(biāo)志物，包括CD133、ATP結(jié)合盒亞家族B成員5（ATP-binding cassette subfamily B member 5，ABCB5）、CD271、CD20和 乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）等（表1），通過調(diào)控多種信號通路（Notch、Hedgehog和Wnt等）的激活或抑制以維持MSCs的特性，進(jìn)而促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）和新生血管生成，加速腫瘤的轉(zhuǎn)移[14-16]（圖1）。因此，進(jìn)一步研究MSCs在黑素瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用，對于探尋黑素瘤的有效治療方法至關(guān)重要。

表1 MSCs標(biāo)志物的作用Table 1 Mechanism of MSCs markers

Fig.1 Melanoma stem cells (MSCs) account for only a small part of melanoma cells,which express a variety of cell markers such as CD133,ATP-binding cassette subfamily B member 5 (ABCB5),CD271,CD20,aldehyde dehydrogenase (ALDH),etc.The activation of the signaling pathways (including Notch,Hedgehog and Wnt pathways) is modulated by these markers to maintain the characteristic of MSCs,thus promoting the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and angiogenesis of melanoma,and accelerating the tumor metastasis.圖1 MSCs表達(dá)多種細(xì)胞標(biāo)志物，通過調(diào)控多種信號通路以維持MSCs特性，促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和新生血管生成，加速腫瘤轉(zhuǎn)移

1 MSCs表面標(biāo)志物調(diào)控黑素瘤轉(zhuǎn)移

1.1 CD133

CD133作為一種功能未知的表面蛋白，在人黑素瘤組織中可見表達(dá)，但在正常皮膚組織中幾乎檢測不到[35]。已證實(shí)在包括黑素瘤在內(nèi)的多種類型腫瘤中，CD133作為一種干細(xì)胞相關(guān)表面抗原與腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)[18,36-37]。研究顯示，CD133＋黑素瘤細(xì)胞可上調(diào)411個基因的表達(dá)，與血管生成、黏附和遷移密切相[38-39]。CD133＋MSCs具有啟動腫瘤進(jìn)展的潛力，CD133通過Notch1激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，進(jìn)而調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，導(dǎo)致腫瘤血管生成增加，促進(jìn)肺轉(zhuǎn)移[38,40]。此外，轉(zhuǎn)移性黑素瘤中CD133、p-p38和p-MEK3/6的表達(dá)水平均明顯高于癌旁組織[17,38]，提示Notch1及其調(diào)控的MAPK信號通路網(wǎng)絡(luò)可能成為MSCs介導(dǎo)的黑素瘤治療的潛在靶點(diǎn)[41-42]。研究發(fā)現(xiàn)，CD133＋和ABCB5＋MSCs參與血管周圍小生境的形成，采用RNAi技術(shù)阻斷CD133表達(dá)后，干細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力明顯降低，并下調(diào)了與血管微環(huán)境密切相關(guān)的CD144和ABCB5分子的表達(dá)，而ABCB5-細(xì)胞失去了形成CD144＋血管生成擬態(tài)樣管道的能力，證實(shí)CD133＋/ABCB5＋MSCs存在于相互吻合的CD144＋血管生成擬態(tài)樣管道中，提示CD133＋MSCs可以通過促進(jìn)血管生成擬態(tài)以及特定的血管微環(huán)境的形成，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[43-44]。體內(nèi)研究中，ZIMMERER等[45]利用體內(nèi)熒光顯微鏡，證實(shí)CD133＋黑素瘤D10細(xì)胞異種移植至裸鼠體內(nèi)，能夠觸發(fā)重要的血管生成過程，而腫瘤血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的必要條件。另有研究提發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移性黑素瘤患者的CD133＋表達(dá)水平是原發(fā)性黑素瘤患者的2倍[46]。RAPPA等[41]證實(shí)CD133在人轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而降低了黑素瘤的形成和轉(zhuǎn)移潛能。此外，針對CD133不同表位的單克隆抗體顯示出劑量依賴性細(xì)胞毒性[47]。因此，CD133可作為轉(zhuǎn)移性黑素瘤治療的一個潛在治療靶點(diǎn)。

1.2 ABCB5

ABCB5是ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中的一員，是細(xì)胞膜電位的一種調(diào)控因子，可以調(diào)節(jié)正常皮膚祖細(xì)胞之間的相互融合，被認(rèn)為是MSCs的標(biāo)志物之一[27,48]。眾所周知，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白通過腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物外排介導(dǎo)多藥耐藥，這一現(xiàn)象通常與TSCs相關(guān)[49-50]。ABCB5作為MSCs的標(biāo)志物，具有較高的致瘤能力，并與其他的MSCs標(biāo)志物如CD133共表達(dá)[51-52]。臨床研究顯示，ABCB5可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，在色素性黑素痣組織中ABCB5的表達(dá)水平普遍較低，而在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞亞群中則表達(dá)增強(qiáng)[20,53]。已有研究證實(shí)ABCB5＋MSCs可促進(jìn)黑素瘤轉(zhuǎn)移[54]。MA等[55]在黑素瘤患者外周血中發(fā)現(xiàn)ABCB5＋黑素瘤細(xì)胞，將此種細(xì)胞移植至NOD/SCID/IL2小鼠可使其發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且轉(zhuǎn)移程度與ABCB5＋黑素瘤細(xì)胞數(shù)量成正比。FRANK等[56]證實(shí)ABCB5＋人黑素瘤細(xì)胞通過表達(dá)內(nèi)皮特異性標(biāo)志物和其他血管生成蛋白促進(jìn)血管生成擬態(tài)形成，而血管生成擬態(tài)在黑素瘤血管新生中具有至關(guān)重要的作用[57]。同一組研究表明，人黑素瘤ABCB5＋亞群優(yōu)先表達(dá)Tie1和CD144等血管生成分化標(biāo)志物，ABCB5＋和CD133＋黑素瘤特異性TSCs優(yōu)先表達(dá)VEGF受體1和VEGF，這對人類黑素瘤細(xì)胞的血管生成擬態(tài)至關(guān)重要，可進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[38,56]。有研究指出，ABCB5促進(jìn)黑素瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的一個潛在機(jī)制是ABCB5抑制T細(xì)胞活化，使機(jī)體具有免疫侵襲能力[58]。ABCB5＋細(xì)胞亞群的主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）Ⅰ類受體、黑素瘤相關(guān)抗原、共刺激分子B7.2和程序性死亡受體1（programmed death-1，PD-1）的表達(dá)水平均低于ABCB5-細(xì)胞，這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)靶向ABCB5 MSCs標(biāo)志物對黑素瘤的治療有益，包括正在進(jìn)行的針對PD-1受體的臨床試驗(yàn)[59]。

1.3 CD271

CD271又稱為低親和力神經(jīng)生長因子受體（nerve growth factor receptor，NGFR）或p75NTR，是MSCs的一種特征性的標(biāo)志物[27,60-61]。研究證實(shí)，CD271＋黑素瘤細(xì)胞較CD271-細(xì)胞更具成瘤能力，且與黑素瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移尤其是與周圍神經(jīng)轉(zhuǎn)移相關(guān)[62-64]。既往研究報道，CD271是用于鑒別黑素瘤異質(zhì)性亞群最可靠的細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD271＋黑素瘤細(xì)胞在小鼠體內(nèi)可形成肝轉(zhuǎn)移和肺轉(zhuǎn)移，而CD271-黑素瘤細(xì)胞則不能形成轉(zhuǎn)移，并且在人類樣本實(shí)驗(yàn)中得到了相似的結(jié)果，與原發(fā)性黑素瘤細(xì)胞株相比，轉(zhuǎn)移性細(xì)胞株中CD271/Sox10陽性細(xì)胞的比例顯著增 加[65-66]。SCHNEGG等[67]和VALYI-NAGY等[68]指出，血管周圍小生境中有較多CD133＋和CD271＋MSCs的積累，并且形成血管生成擬態(tài)的黑素瘤細(xì)胞對CD271呈陽性表達(dá)。VALYINAGY等[68]利用免疫熒光技術(shù)檢測二維和三維培養(yǎng)的人葡萄膜黑素瘤細(xì)胞系C918中CD271的表達(dá)，結(jié)果顯示三維培養(yǎng)時，構(gòu)成血管生成擬態(tài)管道的腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CD271，而非血管生成擬態(tài)管道構(gòu)成的細(xì)胞則不表達(dá)CD271，證實(shí)三維培養(yǎng)形成血管生成擬態(tài)管道的黑素瘤細(xì)胞獲得了TCSs樣表型，并且參與了血管生成擬態(tài)的形成。臨床研究顯示，晚期黑素瘤循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）中ABCB5＋CD271＋RANK＋MSCs數(shù)量顯著增加，表明CTCs在MSCs中高度富集，這是導(dǎo)致遠(yuǎn)處繼發(fā)性腫瘤形成的重要因素[69-70]。此外，CD271和ABCB5陽性黑素瘤細(xì)胞表達(dá)低水平的黑素瘤相關(guān)抗原如MART-1，這支持了表達(dá)MSCs標(biāo)志物的黑素瘤細(xì)胞逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的觀點(diǎn)[24]。體外條件下，CD271在黑素瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)抑制了黑素瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）的產(chǎn)生，并且CTL來源的干擾素γ反過來誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞CD271的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)黑素瘤抗原的產(chǎn)生[71]，提示表達(dá)高水平CD271＋的黑素瘤細(xì)胞與較高的腫瘤轉(zhuǎn)移潛能和較差的預(yù)后相關(guān)[25,34]。

1.4 CD20

CD20是一種B細(xì)胞表面標(biāo)志物，在黑素瘤細(xì)胞系中存在持續(xù)表達(dá)CD20的TSCs亞群[27,72]。既往研究顯示，與黑素瘤細(xì)胞系WM115黏附細(xì)胞相比，以非黏附（黑素瘤球體細(xì)胞）形式增殖的WM115細(xì)胞表達(dá)了更高水平的CD20，而黑素瘤球狀細(xì)胞移植至小鼠體內(nèi)更易形成腫瘤[72]，說明CD20＋黑素瘤細(xì)胞在體內(nèi)外均表現(xiàn)出干細(xì)胞特性[73]。與TSCs在腫瘤中僅占小部分的觀點(diǎn)一致，CD20＋細(xì)胞僅占黑素瘤細(xì)胞總數(shù)的2%左右[20,74]，但在晚期轉(zhuǎn)移性黑素瘤中，利用抗CD20單克隆抗體靶向治療黑素瘤的療效卻較非靶向治療的療效更為顯著[75-76]，甚至可使黑素瘤完全緩解，提示CD20＋MSCs可能是黑素瘤發(fā)生和發(fā)展的根源[76-77]。雖然目前尚無明確證據(jù)顯示CD20＋MSCs直接參與黑素瘤轉(zhuǎn)移，但是CD20＋黑素瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性已得到證實(shí)，其高致瘤性和遷移能力是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的主要原因[76,78]。因此，CD20可能成為未來黑素瘤治療的新靶點(diǎn)。

1.5 ALDH

ALDH是一組可將乙醛氧化成乙酸的同工酶，是多種TSCs的標(biāo)志物，并與不同類型實(shí)體瘤的多藥耐藥和免疫耐受相關(guān)[29,79]。ALDH是MSCs的一種細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物[14]。研究發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)ALDH的黑素瘤細(xì)胞（即ALDHhigh細(xì)胞）具有MSCs的特性[80-81]。ALDHhigh較ALDHlow（ALDH 低表達(dá)的黑素瘤細(xì)胞）可以產(chǎn)生更多的黑素瘤克隆球體[80]，而沉默ALDH基因表達(dá)后，黑素瘤在體內(nèi)的形成能力明顯受抑[81-82]。CONTADOR-TROCA等[83]通過反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)穩(wěn)定下調(diào)小鼠黑素瘤B16F10細(xì)胞AhR和（或）ALDH1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)ALDH1表達(dá)可以抑制AhR表達(dá)缺失黑素瘤細(xì)胞的腫瘤轉(zhuǎn)移，并且降低AhR敲除細(xì)胞中CD133＋/CD29＋/CD44＋細(xì)胞的數(shù)量和黑素球的大小，從而證實(shí)在AhR缺乏背景下，ALDH1過度激活可促進(jìn)黑素瘤的進(jìn)展。相似地，采用shRNA沉默黑素瘤細(xì)胞中ALDH1的表達(dá)后，將腫瘤接種于小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)沉默ALDH1的表達(dá)不僅可以顯著延緩異種移植黑素瘤的形成和生長，并且顯著減少轉(zhuǎn)移瘤的數(shù)目和負(fù)荷[84-85]。由此可見，靶向ALDH可能是治療晚期黑素瘤的有效策略。

1.6 其他分子標(biāo)志物

Sox10是黑素細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化過程中的一個關(guān)鍵性的核轉(zhuǎn)錄因子，有潛力成為MSCs的標(biāo)志物之一[86-87]。Sox10在黑素瘤前哨淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移灶中的陽性率接近100%，明顯高于S100、HMB45、melanA等其他黑素瘤標(biāo)志物，與黑素瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[86,88]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CD271＋黑素瘤細(xì)胞的干細(xì)胞特性可能與CD271/Sox10相互作用網(wǎng)絡(luò)有關(guān)，但具體機(jī)制尚未闡明[89]。CD133＋小鼠和人黑素瘤細(xì)胞可表達(dá)高水平的Oct3/4、Nanog和Sox10，能夠促進(jìn)腫瘤新生血管形成[38]，由此表明Sox10與MSCs的其他標(biāo)志物可以相互調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)展。

CXC趨化因子受體6（CXC chemokine receptor 6，CXCR6）也是MSCs的一種重要標(biāo)志物。CXCR6＋黑素瘤細(xì)胞與ABCG2＋黑素瘤細(xì)胞相比，可在更短的時間內(nèi)形成更大體積的腫瘤，并且ABCG2＋和CXCR6＋雙陽性細(xì)胞較ABCG2＋或CXCR6＋單陽性細(xì)胞具有更高的致瘤潛力[90]，從而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。

CD44近年來已被作為MSCs的特異性標(biāo)志物而應(yīng)用于臨床前研究[91]。有研究證實(shí)，阻斷胰島素樣生長因子1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）可通過下調(diào)干細(xì)胞標(biāo)志（Sox2、Oct3/4、CD44和CD133）以及干細(xì)胞功能特性，阻止黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為和EMT過程[92]。由此說明，CD44在黑素瘤轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。

2 靶向MSCs特異性標(biāo)志物的研究

MSCs表面標(biāo)志物與其他細(xì)胞之間存在差異，具有相對特異性，因此可作為分子靶向治療的靶點(diǎn)，不僅能夠清除MSCs，還能夠防止正常細(xì)胞受到損害，從而達(dá)到最佳的抗腫瘤療效。組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 6，HDAC6）抑制劑Tubacin可促進(jìn)人轉(zhuǎn)移性黑素瘤細(xì)胞FEMX-I釋放含有CD133＋的外泌體，使細(xì)胞內(nèi)CD133含量下降，進(jìn)而抑制FEMX-I細(xì)胞的增殖和克隆形成能力[93]。此外，利用CD133單克隆抗體作用于FEMX-I黑素瘤細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可以通過細(xì)胞毒作用抑制黑素瘤細(xì)胞增殖，并且發(fā)現(xiàn)經(jīng)shRNA介導(dǎo)下調(diào)黑素瘤細(xì)胞CD133的表達(dá)后可以減少黑素瘤的肺及脊髓轉(zhuǎn)移[41]。穿心蓮內(nèi)酯可阻斷黑素瘤細(xì)胞中Notch1依賴性CD133的表達(dá)，降低MAPK信號通路的活化水平，從而抑制腫瘤生長、血管新生和轉(zhuǎn)移[38]。氧化亞銅納米粒子可明顯抑制TSCs標(biāo)志物SOX10和CD271 的表達(dá)，進(jìn)而加快A375和WM266-4細(xì)胞中高表達(dá)CD271的細(xì)胞凋亡，抑制其致瘤性[94]。露那辛可降低MSCs標(biāo)志物ALDH和干細(xì)胞因子Nanog的表達(dá)水平，促使小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）表達(dá)上調(diào)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的集落形成能力和異種移植腫瘤的生長，并且促進(jìn)ALDHhigh向ALDHlow黑素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化[95]。厚樸酚可通過降低Notch2及下游靶蛋白Hes-1和cyclin D1的表達(dá)水平，下調(diào)CD271、CD166、JARID1B和ABCB5的表達(dá)，進(jìn)而抑制黑素瘤細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬[96]。在臨床試驗(yàn)中，抗CD20單克隆抗體利妥昔單抗被應(yīng)用于CD20＋轉(zhuǎn)移性黑素瘤的治療，抗CD20單克隆抗體可以消除CD20＋黑素瘤細(xì)胞，并且增加外周B細(xì)胞數(shù)量[97]。體內(nèi)外黑素瘤細(xì)胞研究顯示，MSCs誘導(dǎo)的血管生成擬態(tài)可作為抗腫瘤化合物（天然植物化學(xué)物羽扇豆醇）的一個頗具潛力的生物學(xué)靶點(diǎn)[98]，通過抑制血管新生而阻止腫瘤轉(zhuǎn)移。然而，當(dāng)前的研究主要集中在細(xì)胞和動物層面，尚缺乏大規(guī)模的臨床研究給予佐證。

3 小結(jié)與展望

MSCs的研究為探索黑素瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、耐藥和治療方法提供了全新的思路。MSCs在黑素瘤的發(fā)生和發(fā)展中，尤其是腫瘤的轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色，通過MSCs特異性標(biāo)志物的相互作用以及對相關(guān)信號通路的調(diào)控以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。因此，全面了解腫瘤轉(zhuǎn)移中的MSCs標(biāo)志物及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制尤為重要，有助于發(fā)現(xiàn)更多有效的黑素瘤分子靶向治療靶點(diǎn)。雖然目前MSCs誘導(dǎo)腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究已得到廣泛關(guān)注，但仍處于初級研究階段。隨著對MSCs標(biāo)志物及其相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究不斷深入，相信在不遠(yuǎn)的未來，有望找到一種可以有效抑制黑素瘤轉(zhuǎn)移甚至根治黑素瘤的治療策略。