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      胰腺癌血漿循環(huán)游離DNA甲基化預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建及應(yīng)用

      2021-03-24 07:54:10黃一鳴康亞妮
      腫瘤 2021年8期
      關(guān)鍵詞:敏感度胰腺癌甲基化

      陳 旻,黃一鳴,趙 暉,康亞妮

      胰腺癌是高度致死性的惡性腫瘤,是目前第4大癌癥死亡原因[1],90%以上為胰腺導(dǎo)管腺癌[2]。由于超過75%的胰腺癌患者確診時(shí)已處于晚期階段[3],因此僅10%~20%患者有機(jī)會(huì)接受手術(shù)治療[4]。即便如此,在接受手術(shù)治療的胰腺癌患者中,仍有50%的患者在18個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)[5-6],因此胰腺癌患者5年生存率僅為9%[1]。所以,早期診斷胰腺癌能夠有效提高胰腺癌患者的生存率[7]。

      基于循環(huán)游離DNA(cell-free DNA,cfDNA)的液體活檢技術(shù)通過檢測(cè)腫瘤患者體液中腫瘤組織釋放的成分以實(shí)現(xiàn)腫瘤診斷,在腫瘤的早期診斷中顯示出很好的應(yīng)用前景。相較于目前常規(guī)的腫瘤檢測(cè)技術(shù),液體活檢具有微創(chuàng)、負(fù)擔(dān)小、敏感度高[8]以及結(jié)果更為全面[9]等優(yōu)勢(shì)。DNA甲基化作為一種穩(wěn)定的腫瘤早期變化事件,具有很強(qiáng)的組織穩(wěn)定性和不同的個(gè)體保守性[9],因此很適合作為有效的腫瘤早期標(biāo)志物,以實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷?;赾fDNA甲基化的液體活檢技術(shù)在實(shí)現(xiàn)胰腺癌早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)方面顯示出一定的潛力。

      本研究采用胰腺癌患者和健康人群血漿cfDNA樣本,結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌與癌旁組織的甲基化450K數(shù)據(jù),聯(lián)合篩選獲得胰腺癌血漿cfDNA甲基化候選標(biāo)志物,構(gòu)建胰腺癌的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)模型。

      1 材料與方法

      1.1 標(biāo)本和材料

      胰腺癌患者和健康人群的5份血漿樣本由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院提供;QIAamp循環(huán)核酸試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司;KAPA Hyper Prep試劑盒購(gòu)自KAPA Biosystems公司;5-甲基胞嘧啶單克隆抗體購(gòu)自EpiGentek公司;Q5高保真DNA聚合酶購(gòu)自New England Biolabs公司。

      1.2 方法

      1.2.1 血漿樣本收集

      收集胰腺癌患者血漿樣本3份以及健康人群血漿樣本2份,所有患者均簽署知情同意書,并獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

      1.2.2 血漿cfDNA提取

      在手術(shù)和藥物治療之前,使用EDTA抗凝管收集5 mL外周血。在采集后6 h內(nèi),1 500×g離心15 min以純化血漿。使用QIAamp循環(huán)核酸試劑盒從800 μL血漿中提取cfDNA,應(yīng)用2100 Bioanalyzer系統(tǒng)(購(gòu)自Agilent Technologies公司)進(jìn)行定量。

      1.2.3 MeDIP-seq建庫(kù)和測(cè)序

      使用KAPA Hyper Prep試劑盒,將約20 ng cfDNA與Illumina接頭相連接。構(gòu)建的cfDNA文庫(kù)與95 ℃變性10 min。使用5-甲基胞嘧啶單克隆抗體,使甲基化cfDNA從文庫(kù)中免疫沉淀。使用Q5高保真DNA聚合酶進(jìn)一步擴(kuò)增MeDIP DNA。采用2100 Bioanalyzer系統(tǒng)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估,擴(kuò)增文庫(kù)由Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序。

      1.2.4 血漿cfDNA原始數(shù)據(jù)的處理與差異甲基化區(qū)域(differential methylation regions,DMRs)篩選

      使 用Trim_Galore(0.4.3版 本)去 除Illumina接頭,Cutadapt(1.8.3版本)切除低質(zhì)量序列。采用Bowtie2軟件(2.1.0版本)將處理后的序列比對(duì)到人類參考基因組GRCh38/hg38(UCSC)。比對(duì)完成后,通過SAMtools(1.3.1版本)過濾唯一比對(duì)序列,并通過Picard(1.2版本)去除重復(fù)序列。最后,應(yīng)用MACS2軟件(2.1.0版本)對(duì)序列進(jìn)行校峰。預(yù)處理完成后,應(yīng)用DiffBind R軟件包(2.8.0版本)篩選胰腺癌患者與健康人群之間的DMRs(P<0.05,log|FC|>1)。對(duì)篩選獲得的DMRs,應(yīng)用ChIPseeker R軟件包(1.5.1版本)進(jìn)行注釋,進(jìn)一步篩選出其中位于基因啟動(dòng)子區(qū)的DMRs用于后續(xù)分析。

      1.2.5 胰腺癌與癌旁組織甲基化450K數(shù)據(jù)的獲取與差異甲基化位點(diǎn)(differential methylation positions,DMPs)的篩選

      從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取胰腺癌與癌旁組織樣本的甲基化450K數(shù)據(jù)(GSE49149),共獲得胰腺癌組織樣本155個(gè),癌旁組織樣本19個(gè)。應(yīng)用ChAMP R軟件包(2.18.3版本)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制和預(yù)處理,并且篩選出DMPs(P<0.05,|Δβ|>0.2)。選擇位于啟動(dòng)子區(qū)域的DMPs用于后續(xù)分析。

      1.2.6 胰腺癌血漿cfDNA與胰腺癌組織甲基化狀態(tài)的聯(lián)合分析及模型的建立

      篩選出位于啟動(dòng)子區(qū)域且與DMRs擁有相同靶基因和甲基化差異趨勢(shì)的DMPs,將這些DMPs作為胰腺癌血漿cfDNA甲基化候選位點(diǎn)用于模型的構(gòu)建。將GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的胰腺癌與癌旁組織的甲基化450K數(shù)據(jù)按1:1分為訓(xùn)練集與測(cè)試集,在訓(xùn)練集中進(jìn)行模型的構(gòu)建。采用500次Lasso算法進(jìn)一步縮減候選位點(diǎn),選取在500次Lasso算法中出現(xiàn)500次的位點(diǎn)作為具有顯著診斷能力的位點(diǎn)。從CFEA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取14組健康人群的血漿cfDNA甲基化450K數(shù)據(jù),將其作為血漿背景的依據(jù),排除選擇的位點(diǎn)中血漿背景干擾較大的位點(diǎn),采用余下的位點(diǎn),在訓(xùn)練集中采用Lasso算法構(gòu)建胰腺癌模型。

      1.2.7 胰腺癌模型的診斷性能與預(yù)后性能的評(píng)估

      《意見》堅(jiān)持市場(chǎng)主導(dǎo)、政府引導(dǎo)、精準(zhǔn)施策的基本原則,以供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革為主線,提出了推動(dòng)綠色餐飲發(fā)展的主要任務(wù):一是健全綠色餐飲標(biāo)準(zhǔn)體系,二是構(gòu)建大眾化綠色餐飲服務(wù)體系,三是促進(jìn)綠色餐飲產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,四是培育綠色餐飲主體,五是倡導(dǎo)綠色發(fā)展理念。

      通過繪制受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線計(jì)算曲線下面積(area under the curve,AUC),計(jì)算特異度和敏感度以評(píng)估模型的診斷效能。除了使用訓(xùn)練集和測(cè)試集評(píng)估模型的效能以外,為防止模型產(chǎn)生過擬合,另從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取一組臨床信息齊全的胰腺癌與癌旁組織甲基化450K樣本,包括184個(gè)胰腺癌組織樣本和10個(gè)癌旁組織樣本,作為獨(dú)立測(cè)試集評(píng)估模型的診斷效能。通過繪制Kaplan-Meier法繪制生存曲線以及多重時(shí)間依賴性ROC曲線,在獨(dú)立測(cè)試集中評(píng)估模型的預(yù)后預(yù)測(cè)能力。此外,采用多因素COX回歸分析胰腺癌預(yù)后相關(guān)因素。

      1.2.8 數(shù)據(jù)處理平臺(tái)

      本研究的測(cè)序數(shù)據(jù)均采用Linux Mint 17.3 Rosa系統(tǒng)進(jìn)行分析,包括高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的質(zhì)檢、預(yù)處理、比對(duì)、去重和校峰等。下游分析均采用R version 4.0.2軟件,包括差異甲基化分析、模型構(gòu)建和效能評(píng)估等。

      2 結(jié)果

      2.1 血漿cfDNA中DMRs的篩選結(jié)果

      共篩選獲得857個(gè)差異高甲基化區(qū)域和933個(gè)差異低甲基化區(qū)域(圖1A)。經(jīng)過注釋后,發(fā)現(xiàn)共有26.13%的DMRs位于啟動(dòng)子區(qū)(圖1B),其中包括高甲基化區(qū)域225個(gè)和低甲基化區(qū)域243個(gè)。

      Fig.1 The results of differential methylation regions (DMRs) analysis of plasma cell-free DNA (cfDNA).A:The heatmap of all DMRs (P<0.05,|logFC|>1),in which the blue ones are DMRs hypomethylated in pancreatic cancer patients’ plasma cfDNA and the red ones are DMRs hypermethylated in pancreatic cancer patients’ plasma cfDNA.B:The annotation results of DMRs.圖1 血漿cfDNA差異甲基化分析結(jié)果(A)DMRs(P<0.05,|logFC|>1)熱圖和DMRs注釋結(jié)果(B)

      2.2 胰腺癌組織和癌旁組織DMPs篩選結(jié)果

      從胰腺癌組織和癌旁組織樣本中共篩選獲得7 630個(gè)高甲基化位點(diǎn)以及8 763個(gè)低甲基化位點(diǎn)(圖2)。其中,位于啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化位點(diǎn)2 186個(gè),低甲基化位點(diǎn)1 190個(gè)。

      Fig.2 The volcano plot of all differentially methylated positions (DMPs) (P<0.05,|Δβ|>0.2) in pancreatic cancer tissues,where blue dots are those methylation sites hypomethylated in pancreatic cancer tissues,and red dots are those methylation sites hypermethylated in pancreatic cancer tissues.圖2 胰腺癌組織DMPs(P<0.05,|Δβ|>0.2)的火山圖

      2.3 胰腺癌模型的構(gòu)建

      將胰腺癌血漿cfDNA與組織樣本聯(lián)合進(jìn)行分析,共獲得41個(gè)具有潛在診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)能力的血漿cfDNA候選甲基化位點(diǎn)。通過500次Lasso迭代算法進(jìn)一步篩選,留下6個(gè)候選位點(diǎn),包括3個(gè)高甲基化位點(diǎn)(圖3A)和3個(gè)低甲基化位點(diǎn)(圖3B)。對(duì)這6個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行血漿背景干擾的排除,其中甲基化位點(diǎn)cg12951282在胰腺癌組織和健康人群血漿cfDNA中都表現(xiàn)出明顯的低甲基化狀態(tài),存在明顯的干擾,因此將其排除(圖3D)。使用剩余的5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行胰腺癌模型的構(gòu)建?;贚asso算法構(gòu)建的胰腺癌模型的基本信息見表1。

      Fig.3 Screening results of methylation sites.A:The methylation status of 3 hypermethylated sites.B:The methylation status of 3 hypomethylated sites.C:The methylation status in plasma background of 3 hypermethylated sites.D:The methylation status in plasma background of 3 hypomethylated sites.圖3 甲基化位點(diǎn)的篩選結(jié)果

      表1 胰腺癌甲基化分析模型的基本信息Table Basic information of methylation analysis model for pancreatic cancer

      2.4 胰腺癌模型診斷效能的評(píng)估結(jié)果

      從箱線圖和ROC曲線來看,該診斷模型在訓(xùn)練集和測(cè)試集中都可以很好地鑒別胰腺癌患者與健康人群(圖4)。在訓(xùn)練集中的AUC值為0.998(圖4B),特異度為0.962,敏感度為0.750;在測(cè)試集中的AUC為0.997(圖4D),特異度為0.987,敏感度為0.875。由此可見,該模型具有很好的診斷效能。在獨(dú)立測(cè)試集中,同樣得到令人滿意的結(jié)果,AUC值為0.963(圖4F),特異度為0.900,敏感度為0.788。

      Fig.4 The diagnostic performance of pancreatic cancer model in training,test and independent test sets.A:The box plot of model in the training set.B:The receiver operating characteristic (ROC) curve of model in the training set.C:The box plot of model in the test set.D:The ROC curve of model in the test set.E:The box plot of model in the independent test set.F:The ROC curve of model in the independent test set.AUC:Area under the curve.圖4 胰腺癌模型在訓(xùn)練集、測(cè)試集和獨(dú)立測(cè)試集中的診斷效能

      2.5 胰腺癌模型對(duì)預(yù)后的預(yù)測(cè)效能評(píng)估結(jié)果

      Kaplan-Meier曲線顯示,胰腺癌模型可以有效地將胰腺癌患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組(P=0.002)(圖5A)。此外,該模型可以較為準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)胰腺癌患者1、3和5年的生存情況,AUC值分別為0.61、0.71和0.74(圖5B)。多因素COX回歸分析顯示,種族、年齡、性別和腫瘤分期不是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P>0.05,圖6)。

      Fig.5 The ability of pancreatic cancer model to predict prognosis in the independent test set.A:The Kaplan-Meier survival curves of the model.B:The time-dependent receiver operating characteristic (ROC)curve of the model.AUC:Area under the curve.

      Fig.6 The forest plot of prognostic factors in patients with pancreatic cancer.圖6 胰腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)因素的森林圖

      3 討論

      液體活檢技術(shù)是腫瘤早期檢測(cè)領(lǐng)域最具應(yīng)用前景的技術(shù)之一,可以在微創(chuàng)條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤患者進(jìn)行較為全面的早期篩查。相較于一般的基于基因組特征的液體活檢技術(shù),基于cfDNA甲基化的篩查方式能夠在更早期鑒別腫瘤患者和健康人群,其表觀遺傳特征也更為普遍和穩(wěn)定[10]。本研究使用胰腺癌患者和健康人群的血漿cfDNA甲基化數(shù)據(jù),與胰腺癌組織和癌旁組織的甲基化450K數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析,構(gòu)建了具有較好的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)能力的模型。

      在構(gòu)建模型時(shí),綜合了胰腺癌患者cfDNA的高甲基化特征和低甲基化特征,更為全面地揭示了胰腺癌患者與健康人群的差異,并且具有更好的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)能力。既往研究在構(gòu)建胰腺癌診斷模型時(shí),大多數(shù)僅考慮胰腺癌患者cfDNA高甲基化特征,或是僅考慮低甲基化特征。MELNIKOV等[11]的模型基于5個(gè)基因啟動(dòng)子區(qū)的低甲基化,而YI等[12]、HENRIKSEN等[13]和LI等[14]的研究都聚焦于一些基因的高甲基化特征,這可能導(dǎo)致部分特征的丟失,造成診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)能力的不足。同時(shí),此前的模型大多僅具有診斷或預(yù)測(cè)預(yù)后的能力,而無法同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)胰腺癌患者的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)。本研究構(gòu)建的模型不僅具有理想的診斷效能,還能對(duì)胰腺癌患者的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè),顯著提高了模型的應(yīng)用價(jià)值。

      應(yīng)用胰腺癌血漿cfDNA甲基化預(yù)測(cè)模型篩選到5個(gè)胰腺癌血漿cfDNA甲基化位點(diǎn),分別位于GALNT9、CACNA1H、ADAMTS2、THBS1和KIAA1671基因的啟動(dòng)子區(qū),其中GALNT9、CACNA1H和ADAMTS2基因的啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)高甲基化趨勢(shì),而THBS1和KIAA1671基因的啟動(dòng)子區(qū)呈現(xiàn)低甲基化趨勢(shì)。在這些基因中,ADAMTS2[15]和THBS1[11]基因在胰腺癌患者中呈現(xiàn)出與既往研報(bào)道的相同的甲基化趨勢(shì),表明ADAMTS2基因的高甲基化和THBS1基因的低甲基化是胰腺癌的標(biāo)志物之一,而其他基因在胰腺癌甲基化相關(guān)研究中尚未見報(bào)道。

      本研究構(gòu)建的模型診斷胰腺癌的敏感度為87.4%,特異度為84.6%,AUC值為0.962。目前臨床上應(yīng)用的胰腺癌生物學(xué)標(biāo)志物是CA19-9。KATHERINE等[16]的研究中,對(duì)胰腺癌患者診斷的敏感度為78.2%,特異度為82.8%,都明顯低于本模型。而癌胚抗原作為一種常用的癌癥生物標(biāo)志物,在胰腺癌患者中的敏感度和特異度也較低,僅為44.2%和84.8%。MELNIKOV等[11]構(gòu)建了5個(gè)基因的低甲基化特征模型,在尚無獨(dú)立測(cè)試集的情況下,區(qū)分胰腺癌患者與健康人群的敏感度和特異度分別僅為76%和59%。YI等[12]發(fā)現(xiàn)了2個(gè)高甲基化標(biāo)志物,診斷胰腺癌的敏感度為81%,特異度為85%。HENRIKSEN等[13]基于8個(gè)基因的高甲基化特征,診斷胰腺癌的敏感度為76%,特異度為83%,但未經(jīng)過測(cè)試集的驗(yàn)證。

      綜上所述,本研究構(gòu)建的cfDNA甲基化診斷模型有望提高胰腺癌的診斷效能,其敏感度高于癌胚抗原(44.2%)和CA19-9(78.2%)。該模型在測(cè)試集和獨(dú)立測(cè)試集中均通過驗(yàn)證,顯示出較高的敏感度和適用性。該模型還具有較好的預(yù)后預(yù)測(cè)能力??傊?,基于cfDNA甲基化的液體活檢技術(shù)可以有效提高胰腺癌的診斷效能,為胰腺癌的早期診斷提供新的思路和理論依據(jù)。

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