米湯發(fā)酵乳乳酸菌的篩選及其制備工藝

陳大衛(wèi)，楊壯壯，黃玉軍，瓦云超，張玉律，杜楊洋，李春雨

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

米湯發(fā)酵乳乳酸菌的篩選及其制備工藝

陳大衛(wèi)，楊壯壯，黃玉軍，瓦云超，張玉律，杜楊洋，李春雨

（揚(yáng)州大學(xué)江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009）

從貴州酸湯樣品中分離篩選乳酸菌，并研究米湯的添加量、發(fā)酵時(shí)間、白砂糖添加量等工藝條件對米湯發(fā)酵乳感官特性的影響，最終確定米湯發(fā)酵乳的最佳工藝配方。結(jié)果表明，適合米湯發(fā)酵乳發(fā)酵的菌株為M-14-3-3和P-3-3-7；當(dāng)米湯添加量20%，白砂糖添加量8%，兩菌株的混合比例1∶1，并以4%的接種量，于37℃下發(fā)酵15 h時(shí)，米湯發(fā)酵乳的口感細(xì)膩、酸甜適口，具有米湯特有的清香，其酸度為94.8°T，黏度為1 236 cP，活菌數(shù)為1.5×108CFU/mL，理化及微生物指標(biāo)均符合風(fēng)味發(fā)酵乳產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)；15 d內(nèi)具有較好的貯藏特性，乳酸菌活菌數(shù)7.5×107CFU/mL，酸度117.3°T，黏度1670 cP。

米湯；發(fā)酵乳；制備工藝

米湯性味甘平，具有益氣、養(yǎng)陰、潤燥的功能，除含有大量的煙酸、VB1，VB2，以及磷、鐵等無機(jī)鹽外，還含有較多的碳水化合物和脂肪等營養(yǎng)元素；同時(shí)含有的人體必需脂肪酸含量也高于其他食物，經(jīng)常喝米湯有助于消化和對脂肪的吸收；米湯中還含有豐富的色氨酸，能夠促使大腦神經(jīng)細(xì)胞分泌出一種催人欲睡的“血清素”，有助于睡眠[1]。

乳酸菌作為人體腸道中的重要益生菌，具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、改善胃腸道功能、增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力和免疫力等功能[2]，被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵。益生乳酸菌發(fā)酵米湯的一個(gè)重要功能就是具有更完善的營養(yǎng)功能，包括人體必需的糖分、脂肪和蛋白質(zhì)，同時(shí)維生素含量更為豐富，含有18種氨基酸，包括人體必需的8種氨基酸，且每種氨基酸比非發(fā)酵米湯含量高，能夠更好地發(fā)揮抗疲勞和增強(qiáng)機(jī)體對外界應(yīng)激能力的作用。米湯發(fā)酵乳還含有多種微量元素，尤其鈣、鋅、鐵、銅含量較豐富，鈣能維持人體骨骼和牙齒的健康，具有安定情緒的作用；鋅能促進(jìn)生長發(fā)育，增強(qiáng)創(chuàng)傷組織的再生能力，加速組織愈合，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；鐵是構(gòu)成血紅蛋白的主要成分之一，缺鐵可引起缺鐵性貧血。因此，隨著生活水平的不斷提高及自我保健意識(shí)的增強(qiáng)，米湯發(fā)酵乳越來越受到消費(fèi)者的歡迎。

貴州“米酸湯”“紅酸湯”中的乳酸菌含量較高，且適合于米湯的發(fā)酵[3-4]。因此，從中篩選乳酸菌，并以品質(zhì)較好的糙米為米湯原料，探討發(fā)酵過程中的接菌方式、米湯添加量、發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵條件對米湯發(fā)酵乳風(fēng)味的影響，進(jìn)而確定米湯發(fā)酵乳的最適發(fā)酵工藝條件，為米湯發(fā)酵乳的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

米酸湯、紅酸湯，貴州農(nóng)家制備；全脂乳粉，新西蘭恒天然公司提供；氫氧化鈉、鹽酸、胰胨、魚粉蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、半胱氨酸、吐溫-80、氯化鈣、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、酚酞，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，以上試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JF-SX-500型全自動(dòng)滅菌鍋，日本TOMY公司產(chǎn)品；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司產(chǎn)品；黏度測定儀（RVD-VII+），Brook Field Engineering Laboratories產(chǎn)品；GYB60-6S型高壓均質(zhì)機(jī)，上海東華高壓均質(zhì)機(jī)廠產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的分離純化及鑒定

將貴州“米酸湯”“紅酸湯”樣品經(jīng)梯度稀釋后，采用MRS固體培養(yǎng)基分離樣品中的乳酸菌[5]，于37℃下培養(yǎng)48 h，挑取平板上的疑似乳酸菌菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢，并進(jìn)行接觸酶、KOH、吲哚、運(yùn)動(dòng)性等生理生化試驗(yàn)[6]。將純化后的乳酸菌于MRS液體培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)24 h，置于4℃冰箱中貯藏備用或凍干保藏。

1.2.2 乳酸菌的篩選

將活化后的乳酸菌按3%接種量接種至全脂乳培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)，參照GB 5009.239—2016[7]的方法分別在0，2，4，6，8，10 h時(shí)測定發(fā)酵乳的酸度，采用黏度計(jì)測定其黏度值。

1.2.3 米湯發(fā)酵乳發(fā)酵條件的研究

用粉碎機(jī)將糙米粉碎（粗粉） 得到米粉，經(jīng)過100目篩篩選得到精細(xì)米粉，混以一定量水經(jīng)煮沸得到米糊，再過濾取湯則獲得原味米湯。將米湯添加到牛乳中發(fā)酵。發(fā)酵后于4℃下冷藏，之后對發(fā)酵乳進(jìn)行品嘗打分。

發(fā)酵乳感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 發(fā)酵乳感官評分標(biāo)準(zhǔn)

（1）接菌方式。將含有20%米湯，9%白砂糖的牛乳均質(zhì)后殺菌、冷卻；將篩選獲得的菌種分別以單一菌株及兩者比例分別以1∶1，2∶1，1∶2的方式接種后，在41℃條件下發(fā)酵16 h，根據(jù)表1評定接菌方式對產(chǎn)品感官特性的影響（試驗(yàn)中百分比均以牛奶用量為基準(zhǔn)）。

（2） 米湯添加量。將分別含有10%，15%，20%，25%，30%米湯，9%白砂糖的牛乳均質(zhì)后殺菌、冷卻；將混合比例為1∶1的M-14-3-3與P-3-3-7以3%的接種量接種發(fā)酵，在41℃條件下發(fā)酵16 h，依據(jù)表1評定不同米湯添加量對產(chǎn)品感官特性的影響。

（3）發(fā)酵時(shí)間。將含有20%米湯，9%白砂糖的牛乳均質(zhì)后殺菌、冷卻；將混合比例為1∶1的M-14-3-3與P-3-3-7以3%的接種量接種發(fā)酵，于41℃條件下分別發(fā)酵10，12，14，16，18 h，依據(jù)表1評定不同發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)品感官特性的影響。

（4）發(fā)酵溫度。將含有20%米湯，9%白砂糖的牛乳均質(zhì)后殺菌、冷卻；將混合比例為1∶1的M-14-3-3與P-3-3-7以3%的接種量接種發(fā)酵，分別在29，33，37，41，于45℃條件下發(fā)酵14 h，依據(jù)表1評定不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)品感官特性的影響。

（5） 白砂糖添加量。將含有20%米湯及分別含有7%，8%，9%，10%，11%白砂糖的牛乳均質(zhì)后殺菌，冷卻；將混合比例為1∶1的M-14-3-3與P-3-3-7以3%的接種量接種發(fā)酵，于37℃條件下發(fā)酵14 h，依據(jù)表1評定不同白砂糖添加量對產(chǎn)品感官特性的影響。

（6）乳酸菌接種量。將含有20%米湯，9%白砂糖的牛乳均質(zhì)后殺菌、冷卻；將篩選獲得的乳酸菌分別以以2.5%，3.0%，3.5%，4.0%，4.5%，5.0%的接種量接種發(fā)酵，于37℃條件下發(fā)酵14 h，依據(jù)表1評定不同乳酸菌接種量對產(chǎn)品感官特性的影響。

（7）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇米湯添加量、白砂糖添加量、發(fā)酵時(shí)間及發(fā)酵溫度作為4個(gè)因素，各取3個(gè)水平，以感官評價(jià)作為指標(biāo)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)表，進(jìn)行米湯發(fā)酵乳發(fā)酵工藝的優(yōu)化。

米湯發(fā)酵乳工藝因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 米湯發(fā)酵乳工藝因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.4 米湯發(fā)酵乳的感官、理化及微生物指標(biāo)

按照國標(biāo)GB 19302—2010[8]的方法測定米湯發(fā)酵乳的感官、理化及微生物指標(biāo)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化

從貴州“米酸湯”“紅酸湯”樣品中分離純化出16株菌株，其中“米酸湯”中7株，“紅酸湯”中9株，分別命名為M-14-3-3，M-14-3-2，M-14-3-1，M-4-7-3，M-4-7-4，M-4-3-2，M-4-3-1，M17-6-3-6，M17-6-3-2，P-1-3-2，P-3-3-2，P-3-3-7，L-4-3-4，L-14-3-3，L-14-7-4，L-4-3-3，對分離的菌株進(jìn)行革蘭氏染色發(fā)現(xiàn)，16株菌株為革蘭氏陽性，無運(yùn)動(dòng)性，過氧化氫酶試驗(yàn)為陰性，KOH試驗(yàn)為陽性，均產(chǎn)酸；綜合分析將16菌株初步判定為乳酸菌。

分離菌株的典型形態(tài)（光鏡×1 600倍）見圖1。

圖1 分離菌株的典型形態(tài)（光鏡×1 600倍）

2.2 乳酸菌的產(chǎn)酸能力

16株乳酸菌在12%全脂復(fù)原乳中，于37℃下培養(yǎng)10 h內(nèi)的酸度變化如表3所示；測定菌株培養(yǎng)60 h后的最大產(chǎn)酸量。

乳酸菌的產(chǎn)酸能力見表3，菌株最大產(chǎn)酸量見表4。

由表3可知，大部分菌株發(fā)酵10 h的酸度均大于70°T，通過分析還發(fā)現(xiàn)，菌株M-14-3-3，M-14-3-1，M-4-7-3，M-4-7-4，M-4-3-1，M17-6-3-6， M17-6-3-2， P-1-3-2， P-3-3-2， P-3-3-7，L-14-3-3，L-4-3-3的最大產(chǎn)酸速率分別為9.00，7.81， 9.39，8.10， 9.65，7.49， 8.99， 5.75，8.55，10.75，8.26 °T/h。M-14-3-3，P-3-3-7 的產(chǎn)酸速率中等，而Anne Saint-eve等人[9]的研究發(fā)現(xiàn)，中等產(chǎn)酸速率的菌株能使酪蛋白膠束更穩(wěn)定且蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更為堅(jiān)固。

由表4可知，菌株M-14-3-3，P-3-3-2及P-3-3-7的最大產(chǎn)酸量顯著高于其他菌株（p＜0.05），分別為177.64，171.66，176.94°T。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選取產(chǎn)酸量大及產(chǎn)酸速率中等的M-14-3-3和P-3-3-7這2株菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表3 乳酸菌的產(chǎn)酸能力/°T

表4 菌株最大產(chǎn)酸量/°T

2.3 米湯發(fā)酵乳的發(fā)酵工藝

分別將菌株M-14-3-3，P-3-3-7及其混合后（比例分別為1∶1，2∶1，1∶2） 進(jìn)行發(fā)酵，研究不同的接種量、米湯添加量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度及白砂糖添加量對米湯發(fā)酵乳感官的影響。

米湯發(fā)酵乳的評分結(jié)果見圖2，米湯發(fā)酵乳工藝條件正交試驗(yàn)見表5，感官評分直觀分析見圖3。

由圖2（a） 可知，當(dāng)菌株M-14-3-3，P-3-3-7以1∶1的比例發(fā)酵米湯時(shí)，其感官評價(jià)得分大于單一菌株及其他混合比例發(fā)酵；據(jù)圖2（b） 可知，米湯發(fā)酵乳發(fā)酵16 h時(shí)的感官得分最高，之后評分下降；由圖2（c）可知，米湯發(fā)酵乳在37℃發(fā)酵時(shí)感官得分最高，之后評分下降；由圖2（d） 可知，米湯發(fā)酵乳的感官評分隨米湯添加量的增加而增加，當(dāng)米湯添加量為20%時(shí)達(dá)到最高，之后開始下降；由圖2（e）可知，當(dāng)白砂糖的添加量為9%時(shí)，感官評分最高；由圖2（f）可知，米湯發(fā)酵乳的感官評分隨接菌量的增加而增加，當(dāng)接菌量為4%時(shí)，感官評分最高。

對米湯和白砂糖添加量、發(fā)酵時(shí)間及溫度進(jìn)行正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)（表5），米湯添加量、白砂糖添加量等因素對米湯發(fā)酵乳的感官評價(jià)均具有較大影響；表5及圖2表明，米湯發(fā)酵乳感官評分的較佳工藝參數(shù)組合為A2B1C3D2，即米湯添加量20%，白砂糖添加量8%，發(fā)酵時(shí)間15 h，發(fā)酵溫度37℃。

2.4 米湯發(fā)酵乳產(chǎn)品品質(zhì)及貯藏特性

2.4.1 米湯發(fā)酵乳的產(chǎn)品品質(zhì)

米湯發(fā)酵乳的感官指標(biāo)見表6，米湯發(fā)酵乳的理化指標(biāo)見表7，米湯發(fā)酵乳的微生物指標(biāo)見表8。

圖2 米湯發(fā)酵乳的評分結(jié)果

表5 米湯發(fā)酵乳工藝條件正交試驗(yàn)

圖3 感官評分直觀分析

表6 米湯發(fā)酵乳的感官指標(biāo)

表7 米湯發(fā)酵乳的理化指標(biāo)

表8 米湯發(fā)酵乳的微生物指標(biāo)

由表6可以看出，米湯發(fā)酵乳呈乳白微黃色，具有米湯特有的清香，組織細(xì)膩、表面光滑，凝乳均勻、無分層、無乳清析出；由表7可知，米湯發(fā)酵乳的酸度和黏度分別為94.8°T，1 236 cP，均在參考標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)；蛋白質(zhì)及脂肪的含量分別為2.56%，3.35%，均高于參考標(biāo)準(zhǔn)；由表8可知，乳酸菌數(shù)為1.5×108CFU/mL，高于參考標(biāo)準(zhǔn)，而大腸桿菌落數(shù)為0，低于參考標(biāo)準(zhǔn)；因此，米湯發(fā)酵乳的感官、理化及微生物指標(biāo)均符合風(fēng)味發(fā)酵乳產(chǎn)品的國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)。

2.4.2 米湯發(fā)酵乳的貯藏特性

米湯發(fā)酵乳的貯藏特性見表9。

表9 米湯發(fā)酵乳的貯藏特性

由表9數(shù)據(jù)可以看出，米湯發(fā)酵乳在貯藏期內(nèi)的貯藏特性比較好，15 d后的活菌數(shù)較高，為7.5×107CFU/mL；后酸化程度較低，酸度為117.3°T，黏度隨著貯藏時(shí)間的增加而增加，15 d后的黏度為1 670 cP。

3 結(jié)論

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵含有米湯的牛乳，其VC、葉酸和β-胡蘿卜素的含量更豐富[10]，而VC能夠促進(jìn)膠原蛋白的合成，增強(qiáng)機(jī)體對外界環(huán)境的抗應(yīng)激能力和免疫力，促進(jìn)氨基酸代謝和改善鈣、鐵吸收；葉酸對嬰幼兒神經(jīng)細(xì)胞和腦細(xì)胞發(fā)育有促進(jìn)作用和抗腫瘤作用，缺乏可引起巨紅細(xì)胞性貧血及白細(xì)胞減少癥；β-胡蘿卜素是一種抗氧化劑，具有解毒作用，是維護(hù)人體健康不可缺少的營養(yǎng)素，對抗癌、預(yù)防心血管疾病、白內(nèi)障及抗氧化有顯著功能[11]。同時(shí)所含有的有益菌群，同豐富的營養(yǎng)成分一起對調(diào)整人體腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)人體健康及預(yù)防消化道疾病也具有不可忽視的作用。

由于米湯有豐富的維生素和水溶性膳食纖維，含有促進(jìn)乳酸菌生長的生長因子，添加到發(fā)酵乳中，能夠促進(jìn)乳酸菌生長繁殖，且具有良好的色澤與特別的滋氣味，使發(fā)酵乳帶有天然的乳白色和大米的特殊清香，使得發(fā)酵乳既具有誘人的色澤，又酸甜可口。但是，當(dāng)米湯添加過量時(shí)，會(huì)對乳酸菌的生長產(chǎn)生較大的影響，使得發(fā)酵乳過酸，析出乳清，同時(shí)酸味與過濃郁的米湯滋氣味相結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致不愉悅的口感與口味的產(chǎn)生。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，米湯添加量對米湯發(fā)酵乳的口味產(chǎn)生了至關(guān)重要的影響；溫度對于米湯發(fā)酵乳的發(fā)酵有較大影響，溫度過高會(huì)導(dǎo)致酸化過快，不利于風(fēng)味物質(zhì)形成，同時(shí)也不利于胞外多糖的產(chǎn)生及發(fā)酵乳黏度的形成；而一定量的白砂糖既能改善發(fā)酵乳的風(fēng)味又能促進(jìn)產(chǎn)酸，但白砂糖濃度過高時(shí)可以抑制產(chǎn)酸量和細(xì)菌生長。

從貴州“米酸湯”“紅酸湯”中分離篩選獲得的菌株M-14-3-3和P-3-3-7的產(chǎn)酸量較大、產(chǎn)酸速率中等，以4%接種量發(fā)酵的米湯發(fā)酵乳具有米湯特有的清香、組織細(xì)膩、表面光滑、無乳清析出，其酸度和黏度適中，蛋白質(zhì)及脂肪的含量等理化及微生物指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)，乳酸菌活菌數(shù)較高；且在貯藏期內(nèi)理化及微生物指標(biāo)均符合風(fēng)味發(fā)酵乳的國家標(biāo)準(zhǔn)；其他營養(yǎng)成分在后期試驗(yàn)中還需進(jìn)一步分析。

[1]李劍欣，張緒梅，徐琪壽.色氨酸的生理生化作用及其應(yīng)用 [J].氨基酸和生物資源，2005，27（3）：58-62.

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Screening on Lactic Acid Bacteria of Rice Water Fermented Milk and its Processing

CHEN Dawei，YANG Zhuangzhuang，HUANG Yujun，WA Yunchao，ZHANG Yulv，DU Yangyang，LI Chunyu
（Key Laboratory of Dairy Biological Technology and Safety Control，College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009，China）

Lactic acid bacteria （LAB） were screened from sour soup in Guizhou，and the rice water content，fermentation time，addition content of sucrose and other effects of process conditions on rice fermented milk sensory characteristics were studied，and the optimum formula of rice fermented milk were confirmed.The results showed that the obtained strains M-14-3-3 and P-3-3-7 were suitable for rice fermented milk fermentation，which was delicate taste，sweet and sour with suitable mouth and with the unique fragrance of rice when the rice water content 20%，sucrose 8%，and the inoculation amount of proportion of strains（1∶1） 4%，37 ℃ fermentation 15 h，and acidity 94.8 °T，viscosity 1 236 cP，viable count of LAB 1.5×108CFU/mL，and physicochemical and microbial indexes were in line with national standards.The rice fermented milk had the good storage characteristics in the 15 days storage period，which the viable count 7.5×107CFU/mL， the acidity 117.3 °T，and the viscosity 1 670 cP.

rice soup；fermented milk；fermentation process

TS201.3

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.12.007

1671-9646（2017） 12a-0022-05

2017-10-09

國家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（31701627）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（17KJB550009）；江蘇省高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目（17KJA550004）；揚(yáng)州大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新基金“益生菌發(fā)酵果蔬汁的制備及活性物質(zhì)的研究”（201605）；揚(yáng)州大學(xué)教改課題博士專項(xiàng)課題（YZUJX2017-17B）。

陳大衛(wèi)（1986— ），男，博士，講師，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。