α-地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征X 染色體相關基因的表達及1p/19q 遺傳學改變在星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤診斷中的意義

郅 程，賴妙玲，郝卓芳，梅開勇，歐陽小明，翁潔玲，鐘 玲，唐 甜，李麗娜

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510260

α-地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征X 染色體相關基因的表達及1p/19q 遺傳學改變在星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤診斷中的意義

郅 程，賴妙玲，郝卓芳，梅開勇，歐陽小明，翁潔玲，鐘 玲，唐 甜，李麗娜

廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510260

目的探討a-地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征X染色體相關基因（ATRX）的表達及1p/19q遺傳學改變在星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤診斷中的意義。方法星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤共53例，采用免疫組化及熒光原位雜交技術檢測ATRX的表達及染色體1p/19q分子遺傳學改變。結(jié)果星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤中ATRX突變率（ATRX表達為陰性）分別為60.0%、44.4%及50.0%；星形細胞瘤染色體1p及19q單缺失和1p/19q共缺失率均為0%，少突膠質(zhì)細胞瘤缺失率分別為54.5%、0%和45.5%，少突星形細胞瘤缺失率分別為12.5%、0%和0%，少突膠質(zhì)細胞瘤染色體1p/19缺失率（包括共缺失及單缺失）與非少突膠質(zhì)細胞腫瘤（包括星形細胞瘤及少突星形細胞瘤）比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.032）。聯(lián)合檢測ATRX表達及1p/19q缺失情況，少突星形細胞瘤與星形細胞瘤及少突膠質(zhì)細胞瘤比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.046，P=0.003）。結(jié)論染色體1p/19q缺失主要發(fā)生在少突膠質(zhì)細胞瘤中，對少突膠質(zhì)細胞瘤的診斷具有重要價值；少突星形細胞瘤與星形細胞瘤的遺傳學分子改變具有一定的差異性。

星形細胞瘤；少突膠質(zhì)細胞瘤；少突星形細胞瘤；a-地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征X染色體相關基因；1p/19q；免疫組化；熒光原位雜交

2015年，基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）腫瘤的分子學特征，世界衛(wèi)生組織對CNS腫瘤的分類進行了新的修訂（2016版）[1]，較2007版從概念到實踐都有提升[2]。在2016版CNS腫瘤分類中，對于膠質(zhì)瘤的診斷與鑒別診斷，確定了分子標志物在分類診斷中的重要意義。其中，異檸檬酸脫氫酶（IDH）、α-地中海貧血/精神發(fā)育遲滯綜合征X染色體相關基因（ATRX）和1p/19q等3個分子標記物對于診斷及其判斷預后非常重要[3]。此外，2016版分類標準中，少突星形細胞瘤的診斷存在巨大爭議。新分類強調(diào)，組織學上同時含星形細胞和少突膠質(zhì)細胞兩種成分的膠質(zhì)瘤，需要進行腫瘤基因檢測后歸為星形細胞瘤或少突膠質(zhì)細胞瘤。然而，在日常的診斷工作中，根據(jù)世界衛(wèi)生組織推薦的分子標記物對少突星形細胞瘤進行重新分類，仍會出現(xiàn)問題。因此，本實驗將通過檢測星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤組織中ATRX的表達及1p/19q的缺失情況，研究少突星形細胞瘤與星形細胞瘤和少突膠質(zhì)細胞瘤在分子遺傳學方面的差異，從而為今后對少突星形細胞瘤的診斷提供幫助。

1 資料與方法

1.1 研究資料

組織來自廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院病理科2010～2015年間病理石蠟確診標本53例，患者術前均未接受放療或化療。按2007年版“WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的病理分類”，樣本情況如下：星形細胞瘤25例（WHOⅡ級14例，WHOⅢ級11例），少突膠質(zhì)細胞瘤18例（WHOⅡ級7例，WHOⅢ級11例），少突星形細胞瘤10例（WHOⅡ級2例，WHOⅢ級8例）。標本用10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 ATRX免疫組化檢測 （1）常規(guī)切片脫蠟并水化；（2）過氧化氫去離子水作用10 min；（3）pH 6.0檸檬酸鹽高壓修復5 min；（4）滴加ATRX（克隆號：HPA00-1906，Sigma-Aldrich，稀釋度：1：50），4 ℃過夜；（5）滴加二抗并室溫下作用30 min；（6）DAB顯色10 min；（7）蘇木素復染、脫水、透明，中性樹膠封片。組織中的非腫瘤細胞作為陽性對照，另外用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.2 1p/19q熒光原位雜交 標本經(jīng)常規(guī)處理后，切3～4 μm石蠟切片，采用熒光原位雜交 1p/19q雙色探針試劑盒（LS I1p36/1q25 and LSI19q13/19p13雙色探針購于北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司）檢測腫瘤中1p/19q雜合性缺失。

1.3 結(jié)果判斷

1.3.1 ATRX免疫組化檢測結(jié)果判斷 ATRX表達于腫瘤細胞的細胞核。腫瘤細胞的細胞核為棕黃色顆粒樣染色，即判為腫瘤細胞陽性。如組織內(nèi)的腫瘤細胞核沒有染色，但組織內(nèi)非腫瘤細胞，如：血管內(nèi)皮細胞、小膠質(zhì)細胞、淋巴細胞或反應性星形膠質(zhì)細胞的胞核為棕黃色顆粒樣染色，或陽性腫瘤細胞數(shù)＜10%，均視為陰性[4]。免疫組化結(jié)果由兩位病理醫(yī)師采用雙盲法閱片判定，如有判定爭議的標本，則不納入實驗統(tǒng)計。

1.3.2 1p/19q熒光原位雜交結(jié)果判斷 使用40倍物鏡以多個腫瘤細胞區(qū)域進行掃描，確定樣本是否有異質(zhì)性，選擇細胞核分布良好的區(qū)域，使用100倍物鏡按照一定的方向計數(shù)。各計數(shù)200個細胞核中1p36信號數(shù)和1q21信號數(shù)及19q13信號數(shù)和19p13信號數(shù)，計算1p36信號數(shù)與1q21信號數(shù)及19q13信號數(shù)與19p13信號數(shù)的比值，根據(jù)兩者比值判斷是否有缺失，若1p36/1q21＜0.7和/或19q13/19p13＜0.7則視為有缺失。

1.4 統(tǒng)計學方法

用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件包進行數(shù)據(jù)處理。多組間突變率的比較用多個樣本率的χ2檢驗，其中當有理論頻數(shù)＜5時用似然比χ2檢驗，當理論頻數(shù)均大于5時用非校正χ2檢驗；兩組間突變率的比較用兩樣本率的χ2檢驗，其中當有理論頻數(shù)＜5時用校正χ2檢驗，當理論頻數(shù)均＞5時用非校正χ2檢驗，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ATRX在星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤中的表達情況

53例病例中，星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤ATRX突變（ATRX表達為陰性）率分別為60.0%、44.4%及50.0%（表1）。少突星形細胞瘤ATRX突變率與星形細胞瘤比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.292，P=0.589），少突星形細胞瘤ATRX突變率與少突膠質(zhì)細胞瘤比較差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.080，P=0.778）。

表1 ATRX在星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤中的表達（例）

2.2 星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤中染色體1p/19q缺失情況

本研究共檢測了25例病例中的1p和19q缺失情況，其中包括星形細胞瘤3例（WHOⅡ級1例，WHOⅢ級2例），少突膠質(zhì)細胞瘤14例（WHOⅡ級6例，WHOⅢ級8例），少突星形細胞瘤8例（WHOⅡ級2例，WHOⅢ級6例）。星形細胞瘤染色體1p，19q及1p/19q缺失率均為0，少突膠質(zhì)細胞瘤染色體1p，19q及1p/19q缺失率分別為54.5%、0和45.5%，少突星形細胞瘤染色體1p，19q及1p/19q缺失率分別為12.5%、0和0。少突星形細胞瘤染色體1p/19缺失率（包括共缺失及單缺失）與星形細胞瘤比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.055）；少突星形細胞瘤1p/19缺失率（包括共缺失及單缺失）與少突膠質(zhì)細胞瘤比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.011）；少突膠質(zhì)細胞瘤染色體1p/19缺失率（包括共缺失及單缺失）與非少突膠質(zhì)細胞瘤（包括星形細胞瘤及少突星形細胞瘤）比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.032，表2）。

表2 不同組織學類型膠質(zhì)瘤染色體1p/19q缺失（例）

2.3 聯(lián)合檢測星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤中ATRX表達與染色體1p/19q缺失情況

同時檢測ATRX表達及1p和19q雜合性及共缺失情況的25例病例中，ATRX表達及1p/19q缺失情況在3者之間的分布見表3，其中8例少突星形細胞瘤中有5例未發(fā)現(xiàn)存在ATRX突變及1p/19q缺失；3例星形細胞瘤均存在ATRX突變，10例少突膠質(zhì)細胞瘤存在1p/19q雜合性或共缺失。少突星形細胞瘤與星形細胞瘤及少突膠質(zhì)細胞瘤比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.046，P=0.003）。

表3 不同組織學類型膠質(zhì)瘤ATRX表達及1p/19q缺失（例）

3 討論

隨著分子生物學的發(fā)展，一些腫瘤的發(fā)生遺傳學基礎逐步被闡明，2014年國際神經(jīng)病理學會議上確立中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）腫瘤的診斷需要整合客觀的分子數(shù)據(jù)，并形成了WHO（2016）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類（新版分類）[1]。2016版CNS腫瘤分類標準中，少突星形細胞瘤的診斷存在巨大爭議。新分類強調(diào)，組織學上的少突星形細胞瘤需要進行腫瘤基因檢測后歸為星形細胞瘤或少突膠質(zhì)細胞瘤。然而，在日常的診斷工作中，根據(jù)WHO推薦的分子標記物對少突星形細胞瘤進行重新分類，仍會出現(xiàn)以下無法歸類的病例。

IDH、ATRX和1p/19q等3個分子標記物對于膠質(zhì)瘤的診斷及其判斷預后非常重要。在彌漫性膠質(zhì)瘤中IDH1和IDH2突變都有發(fā)生，但以IDH1突變?yōu)橹鱗5-7]。彌漫性星形細胞瘤（特別是WHO II和Ⅲ級），少突膠質(zhì)細胞瘤，繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤IDH1突變率達70%[8-10]。ATRX基因是2011年首次發(fā)現(xiàn)在CNS腫瘤中存在突變?nèi)笔У腫11]，隨后研究發(fā)現(xiàn)ATRX突變可見于成人型彌漫性星形細胞瘤（45%～67%）、間變性星形細胞瘤（57%～73%）和繼發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤（33%～57%）及兒童型腦干彌漫性星形細胞瘤（22%）和非腦干高級別膠質(zhì)瘤（48%），成人型原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤很少見（4%～8%）[12-15]。有ATRX突變的膠質(zhì)瘤均同時存在IDH突變，同時存在這兩種突變的腫瘤中，大部分又同時具有Tp53突變[16-18]。因此同時存在IDH和ATRX突變的膠質(zhì)瘤可作為病理診斷星形細胞瘤的診斷要點。少突膠質(zhì)細胞瘤與染色體1p/19q共缺失具有強烈的相關性[19]。研究發(fā)現(xiàn)，具有染色體1p/19q缺失的病例常常伴隨IDH基因突變，但與TP53突變相互獨立，并與ATRX突變相互排斥，因此有助于星形細胞瘤與少突膠質(zhì)細胞瘤相互鑒別[20-21]。

本研究中，星形細胞瘤、少突膠質(zhì)細胞瘤及少突星形細胞瘤均存在不同程度的ATRX突變（15/25，8/18，5/10），同時檢測染色體1p/19q在3者中缺失率，發(fā)現(xiàn)染色體1p/19q無論是共缺失還是1p單缺失主要存在于少突膠質(zhì)細胞瘤中，而星形細胞瘤及少突星形細胞瘤染色體1p/19q缺失率明顯降低，這一點與文獻報道少突膠質(zhì)細胞瘤與染色體1p/19q缺失相關一致，也進一步證實染色體1p/19q缺失在少突膠質(zhì)細胞瘤診斷中的作用。在檢測的8例少突星形細胞瘤中，其中7例未發(fā)現(xiàn)存在染色體1p/19q缺失（缺失率僅為12.5%），按照WHO（2016）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類（新版分類），未能歸為少突膠質(zhì)細胞瘤。然而，與星形細胞瘤相比，少突星形細胞瘤的ATRX表達與染色體1p/19q缺失情況與前者又具有一定的差異性。因此，根據(jù)WHO（2016）中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類（新版分類），在未發(fā)現(xiàn)存在染色體1p/19q缺失的少突星形細胞瘤是否可以完全歸類于星形細胞瘤，還有待進一步研究。

[1]Louis DN, Perry A, Reifenberger G, et al. The 2016 World Health Organization classification of tumors of the central nervous system:a summary[J]. Acta Neuropathol, 2016, 131(6): 803-20.

[2]Louis DN, Ohgaki H, Wiestler OD, et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system[J]. Acta Neuropathol, 2007, 114(2): 97-109.

[3]Louis DN, Perry A, Burger P, et al. International society of Neuropathology-Haarlem consensus guidelines for nervous system tumor classification and grading[J]. Brain Pathol, 2014, 24(5):429-35.

[4]Chaurasia A, Park SH, Seo JW, et al. Immunohistochemical analysis of ATRX, IDH1 and p53 in glioblastoma and their correlations with patient survival[J]. J Korean Med Sci, 2016,31(8): 1208-14.

[5]Hartmann C, Meyer J, Balss J, et al. Type and frequency of IDH1 and IDH2 mutations are related to astrocytic and oligodendroglial differentiation and age: a study of 1,010 diffuse gliomas[J]. Acta Neuropathol, 2009, 118(4): 469-74.

[6]Capper D, Weissert S, Balss J, et al. Characterization of R132H mutation-specific IDH1 antibody binding in brain tumors[J]. Brain Pathol, 2010, 20(1): 245-54.

[7]Parsons DW, Jones S, Zhang X, et al. An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme[J]. Science, 2008,321(5897): 1807-12.

[8]Yalaza C, Ak H, Cagli MS, et al. R132H mutation in IDH1 gene is associated with increased tumor HIF1-Alpha and serum VEGF levels in primary glioblastoma multiforme[J]. Ann Clin Lab Sci,2017, 47(3): 362-4.

[9]Jantima MD, Erik A, Williams M, et al. The diagnostic use of immunohistochemical surrogates for signature molecular genetic alterations in gliomas[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2016, 75(1):4-18.

[10]Neumann JE, Dorostkar MM, Korshunov A, et al. Distinct histomorphology in molecular subgroups of glioblastomas in young patients[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2016, 75(5): 408-14.

[11]Heaphy CM, de Wilde RF, Jiao Y, et al. Altered telomeres in tumors with ATRX and DAXX mutations[J]. Science, 2011,333(641): 425-8.

[12]Purkait S, Miller CA, Kumar A, et al. ATRX in diffuse gliomas with its Mosaic/heterogeneous expression in a subset[J]. Brain Pathol, 2017, 27(2): 138-45.

[13]褚明亮, 張著學, 張 赟, 等. ATRX在不同類型中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中的表達及其在鑒別診斷中的意義[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2016, 32(18): 3026-9.

[14]Wiestler B, Capper D, Holland TA, et al. ATRX loss refines the classification of anaplastic gliomas and identifies a subgroup of IDH mutant astrocytic tumors with better prognosis[J]. Acta Neuropathol, 2013, 126(3): 443-51.

[15]Wu G, Diaz AK, Paugh BS, et al. The genomic landscape of diffuse intrinsic pontine glioma and pediatric non-brainstem high-grade glioma[J]. Nat Genet, 2014, 46(5): 444-50.

[16]Cancer Genome Atlas Research Network, Brat DJ, Verhaak RG, et al. Comprehensive, integrative genomic analysis of diffuse Lower-Grade gliomas[J]. N Engl J Med, 2015, 372(26): 2481-98.

[17]Reuss DE, Sahm F, Schrimpf D, et al. ATRX and IDH1-R132H immunohistochemistry with subsequent copy number analysis and IDH sequencing as a basis for an "integrated" diagnostic approach for adult astrocytoma, oligodendroglioma and glioblastoma[J].Acta Neuropathol, 2015, 129(1): 133-46.

[18]Yan H, Parsons DW, Jin G, et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas[J]. N Engl J Med, 2009, 360(8): 765-73.

[19]Weller M, Weber RG, Willscher E, et al. Molecular classification of diffuse cerebral WHO grade II/III gliomas using genome- and transcriptome-wide profiling improves stratification of prognostically distinct patient groups[J]. Acta Neuropathol, 2015, 129(5):679-93.

[20]Takano S, Ishikawa E, Sakamoto N, et al. Immunohistochemistry on IDH 1/2, ATRX, p53 and Ki-67 substitute molecular genetic testing and predict patient prognosis in grade III adult diffuse gliomas[J]. Brain Tumor Pathol, 2016, 33(2): 107-16.

[21]Cheung N, Zhang JH, Lu C, et al. Association of age at diagnosis and genetic mutations in patients with neuroblastoma[J]. JAMA,2012, 307(10): 1062-71.

Significance of expression of IDH-1, ATRX and molecular genetic alterations of chromosome 1p/19q in diagnosis of astrocytoma, oligodendroglioma and oligoastrocytoma

ZHI Cheng, LAI Miaoling, HAO Zhuofang, MEI Kaiyong, OUYANG Xiaoming, WENG Jieling, ZHONG Ling, TANG Tian, LI Lina

Department of Pathology, the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510260, China

ObjectiveTo explore the expression of α-Thalassemia/Mental Retardation Syndrome X-linked (ATRX) and molecular genetic alterations of chromosome 1p/19q in diagnosis of astrocytoma, oligodendroglioma and oligoastrocytoma.MethodsWe analyzed ATRX expression status by immunohistochemistry in 53 patients with astrocytoma, oligodendroglioma or oligoastrocytoma.The molecular genetic alterations of chromosome 1p/19q with fluorescence in situ hybridization in these tumors were analyzed.ResultsThe mutation rate of ATRX in astrocytoma, oligodendroglioma or oligoastrocytoma were 60.0%, 44.4%, 50.0%; The loss rates of chromosome 1p, 19q and 1p/19q were0%, 0%, 0% in astrocytoma; 54.5%, 0%, 45.5% in oligodendroglioma and 12.5%, 0%, 0% in oligoastrocytoma respectively, with significant differences between oligodendroglioma and non-oligodendroglioma (P=0.032). Conjoint analysis of ATRX mutation and loss rates of chromosome 1p, 19q and 1p/19q status defined 3 subtypes of gliomas, with significant difference (P=0.046,P=0.003).ConclusionsThe loss of 1p/19q is mainly occurred in oligodendroglioma, which can be used as a oligodendroglioma marker in diagnosis. There are significant differences between astrocytoma and oligoastrocytoma about the molecular genetic alterations.

astrocytoma; oligodendroglioma; oligoastrocytoma; ATRX; 1p/19q; immunohistochemistry; fluorescence in situ hybridization

2017-09-12

郅 程，主治醫(yī)師，碩士，E-mail: zhichengcy0125@163.com

郝卓芳，E-mail: patty128@163.com