應用Illumina MiSeq高通量測序技術分析活性銀離子處理飲用水微生物多樣性

辛冰牧，劉 亞，朱德斌，吳元亮，王 靜，張 紅，呂志堂，謝 瓊?

（1.中國航天員科研訓練中心，北京 100094；2.河北大學生命科學院，保定 071000）

應用Illumina MiSeq高通量測序技術分析活性銀離子處理飲用水微生物多樣性

辛冰牧1，劉 亞2，朱德斌1，吳元亮1，王 靜1，張 紅1，呂志堂2，謝 瓊1?

（1.中國航天員科研訓練中心，北京 100094；2.河北大學生命科學院，保定 071000）

為觀察作為載人航天消毒劑的銀離子消毒水所呈現(xiàn)的微生物多樣性，采用Illumina MISeq高通量測序技術，對添加不同濃度的活性銀離子的市售桶裝水和對照水樣進行了分析，分組為CK（對照）、L（0.1 mg／L）、M（0.3 mg／L）和H（0.5 mg／L）組，每隔30 d定期取樣，同時以GB 4789-2010進行了菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)測定和16S rDNA V3-V4區(qū)高通量測序，以及生物信息學分析，包括群落結(jié)構、多樣性、主成分及物種豐度分析。結(jié)果表明：CK組30 d菌落計數(shù)即達557.3±58.2，活性銀離子有較為顯著的抑菌效果（L組60 d后1.7±0.6、H組90 d后1.7±0.6）；高通量測序數(shù)據(jù)顯示，其群落結(jié)構比例最大的是變形菌門，其次是厚壁菌門，然后是放線菌門；beta多樣性和主成分分析結(jié)果顯示鞘氨醇單胞菌屬和乳球菌屬豐度較高；活性銀離子對飲用水有顯著的抑菌作用，且可減少細菌群落。

桶裝飲用水；Illumina Miseq；微生物群落；活性銀離子

1 引言

載人航天飛行供水的技術難題隨乘員人數(shù)的增加和飛行時間延長而復雜。早期空間飛行時間短，乘組人數(shù)少，主要從地面攜帶飲用水，如水星飛船，飛行時間15 min～1.4 d，貯水袋在飛行前貯2.7 kg清潔水；阿波羅登月飛船首次使用燃料電池水作為飲用水水源，并首次使用碘作為消毒劑［1］?？紤]到碘可能會影響航天員的甲狀腺功能，1997年美國載人飛船加裝了飲用前清除碘的設備［2］。

俄羅斯和平號空間站及目前的國際空間站俄羅斯艙使用活性銀離子作為消毒劑，對飲用水進行消毒。聯(lián)盟號飛船飲用水水質(zhì)標準中銀的限定濃度為0.2 mg／L，在空間站階段為0.5 mg／L，這個改變和飛行期延長有關［3］。銀離子的消毒機理包括銀離子能破壞細菌體內(nèi)可分解葡萄糖、蔗糖和尿素的酶類，主要是破壞羧基和巰基；銀離子能與賴氨酸、精氨酸和半胱氨酸等反應，使蛋白質(zhì)變性而失去活性；銀離子可以破壞細菌細胞膜結(jié)構；此外，銀離子可以作用于微生物DNA分子的特定位點，破壞DNA分子結(jié)構。

為了保障航天員在太空飛行過程中飲水安全，目前國際空間站對水質(zhì)實施定期監(jiān)測，采用培養(yǎng)計數(shù)和腸菌顯色反應來衡量水質(zhì)，飲用水標準為低于50 CFU／mL，腸菌不得檢出［4］。La Duc等人對空間站下行水樣進行檢測發(fā)現(xiàn)，盡管使用培養(yǎng)法未有檢出細菌，但使用16S rDNA測序法卻得到了幾種條件致病菌，包括阿菲波菌屬、赭菌屬、寡氧單胞菌屬和丙酸菌屬等［5］。

微生物的傳統(tǒng)研究方法主要是將微生物進行培養(yǎng)和分離（culture-dependent），然而該方法能培養(yǎng)的微生物不足1%［6］。隨著測序技術和數(shù)據(jù)處理分析能力的飛速發(fā)展，以及人們對微生物之間相互依存的共生互利和平衡關系的認識深入，一種可以對環(huán)境中所有微生物進行研究而不依賴培養(yǎng)的新方向——宏基因組學應運而生。

宏基因組（Metagenome），或稱為“元基因組”，于1998年由Handelsman等在一篇研究土壤微生物的文章中首次提出，當時的定義是“微生物群落中的所有基因組的集合”［7］。在此之后，宏基因組的概念漸漸為人們所接受，并涌現(xiàn)了許多針對海洋、土壤、人類腸道等微生物的典型研究工作，目前的宏基因組研究主要指對細菌的研究。宏基因組是近年研究的熱點，數(shù)據(jù)量較為龐大，尤其需要高通量的測序技術和高效的數(shù)據(jù)處理能力作為依托。

高通量測序技術可以對數(shù)百萬個DNA分子進行同時測序，這使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，克服了傳統(tǒng)檢測技術的缺陷，能全面和客觀地反應微生物多樣性。本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術，分析經(jīng)不同濃度活性銀離子處理的桶裝水，觀察銀離子消毒水微生物種群多樣性，為保障航天員在太空飛行過程中飲水安全提供依據(jù)。

2 方法

本研究采用市售新鮮桶裝水，并用不同濃度的活性銀離子處理（添加的銀離子濃度分別為0、0.1、0.3和0.5 mg／L）。

2.1 菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)測定

將新鮮市售桶裝水置于消毒處理的飲水機上，以不添加活性銀離子組為對照組CK，設計添加不同濃度的活性銀離子（0.1、0.3和0.5 mg／L），分別為L組、M組和H組，每隔30 d定期取樣，共取樣五次，分別為第0、30、60、90、120 d，CK組分別標識為CK-1～5，L組為L-1～5，M組為M-1～5，H組為H-1～5，以食品安全國家標準GB 4789-2010所述方法進行菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)測定，研究其保質(zhì)效果。

2.2 16S rDNA高通量測序

對于以上各組，同步進行16S rDNA V3-V4區(qū)的高通量測序，具體步驟為：1）對樣品進行處理，定期取樣（每隔30 d），采用濾膜過濾法過濾3000 mL樣品；2）用MoBio Power Water?DNA Isolation Kit提取處理后樣品中微生物總基因組DNA；3）進行聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴增；4）MiSeq高通量測序。

2.3 對高通量測序結(jié)果進行生物信息學分析

采用微生態(tài)定量分析流程（Quantitative Insights Into Microbial Ecology，QIIME），對測序結(jié)構進行Beta分析，使用vegan軟件，做非度量多維尺度分析圖（Nonmetric Multidimensional Scaling，NMDS）；進行主成分分析（Principal Components Analysis，PCA），并繪制PCA分析圖。利用軟件MetaPhlAn做物種群落結(jié)構分析。

3 結(jié)果及分析

3.1 菌落計數(shù)結(jié)果及大腸菌群數(shù)測定

每隔30 d定期取水樣，共取樣5次，使用食品安全國家標準GB 4789-2010所述方法進行菌落總數(shù)檢測方法，檢測水中細菌總數(shù)（表1）。隨著取樣時間的延長，菌落數(shù)相應增加，為了保證結(jié)果的可靠性，部分組別采用稀釋涂布的方法。

表1 不同濃度銀離子處理飲用水菌落計數(shù)結(jié)果／CFUTable 1 The concentration of bacteria in water treated or untreated with silver ions（colony formingunits，CFU）

由表1可以看出，不同濃度活性銀離子對于飲用水有明顯延長保質(zhì)期的效果，水體內(nèi)微生物數(shù)量得到了有效的控制，而CK對照組在30 d內(nèi)菌落數(shù)就相比其他三組有明顯增高，60 d后菌落數(shù)多不可計。L組由于活性銀離子濃度較小，抑菌作用相對來說較弱，故120 d后菌落數(shù)亦多不可計，而H和M組菌落數(shù)一直維持較低水平，說明活性銀離子對于開封后桶裝飲用水的保質(zhì)效果比較明顯。

此外，根據(jù)食品安全國家標準《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》GB 4789-2010檢測可得，杜氏小管中均未產(chǎn)生氣泡，說明均為陰性管，開封后的桶裝飲用水中大腸桿菌的菌群數(shù)量很少或者沒有。

3.2 Illumina Miseq高通量測序結(jié)果數(shù)據(jù)分析

3.2.1 基于群落結(jié)構分析

通過測序并利用Qiime生成多樣品物種豐度分布圖（圖1）。深棕色代表變形菌門，深藍色代表放線菌門，亮黃色代表厚壁菌門的微生物群。整體來看，各組的物種豐度基本相同，所占比例最大的是變形菌門，其次是厚壁菌門，然后是放線菌門。

CK五組放線菌門的微生物群比H、L和M三組有比較明顯的優(yōu)勢，而厚壁菌門則相對少于H、L和M三組。分析原因可能是活性陰離子的選擇性作用，CK組與其他三組差別較明顯。

3.2.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性是不同生態(tài)系統(tǒng)之間多樣性的比較，利用各樣品序列間的進化及豐度信息來計算樣品間距離，反映樣品間是否具有顯著的微生物群落差異，NMDS分析圖常用于Beta多樣性分析顯示樣本或組之間的差異（圖2）。結(jié)果表明，CK五組的微生物群落差異相對于其他三組來說比較大，樣本間相距較遠；而H、M和L三組相對來說差異較小，樣本間距離較近，說明CK對照組隨著時間的延長，微生物群落變化較大；而其余三組由于有不同濃度的活性銀離子處理，抑菌效果比較明顯，群落差異較小，說明活性銀離子的處理較為有效。

3.2.3 主成分分析

主成分分析（PCA）是揭示大樣本、多變量數(shù)據(jù)或樣本之間內(nèi)在關系的一種方法，旨在利用降維的思想，把多指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標，降低觀測空間的維數(shù)，以獲取最主要的信息。對屬水平上的分類及物種豐度進行主成分分析，繪制PCA圖，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，CK-2、CK-3、CK-4、CK-5相對于其他組來說微生物群落差異較大，而CK-1組與其他并無明顯區(qū)別?？赡苁怯捎诘谝淮稳訒r間較短，微生物菌群并未開始繁殖，所以對照與經(jīng)過處理的實驗組并沒有明顯區(qū)別。而CK的后四次取樣，則與其他各組差別較大，分析原因是由于隨著時間的延長，微生物菌群開始大幅度繁殖，說明活性銀離子處理水樣的方法較為有效。

3.2.4 物種群落結(jié)構圖

基于物種和豐度信息，構建物種群落結(jié)構圖，可以反映樣品中的物種和豐度分布情況，從中發(fā)現(xiàn)豐度較高的物種。

根據(jù)屬水平的豐度信息，利用軟件MetaPhlAn繪制物種群落結(jié)構圖。結(jié)果顯示鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）和乳球菌屬（Lactococcus）豐度較高，如圖4所示。

4 討論

本研究首先采用食品安全國家標準GB 4789-2010所述方法進行菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)測定，對不同濃度活性銀離子處理的開封后桶裝飲用水進行檢測，結(jié)果表明：0.3 mg／L銀離子可有效控制水中微生物數(shù)量小于2 CFU／mL，時間可達3個月，與文獻［8］結(jié)果有對比性。同時，采用Illumina MiSeq高通量測序結(jié)合Qiime生物分析技術，對上述樣本進行了微生物多樣性分析。

對于群落結(jié)構的分析結(jié)果表明，無論是銀離子處理組還是未經(jīng)處理組，各組的物種豐度基本相同，所占比例最大的是變形菌門，其次是厚壁菌門，然后是放線菌門。放線菌門的微生物群在未經(jīng)銀離子處理的CK五組比銀離子處理組有比較明顯的優(yōu)勢，厚壁菌門則相對較少；而銀離子處理組變形菌門相對較多，分析原因可能是活性銀離子的選擇性作用。M.T.La Duc等人使用非培養(yǎng)法對國際空間站再生水復水食物及飲用水進行檢測，也發(fā)現(xiàn)水中可檢出α、β及γ變形菌。

Beta多樣性分析的結(jié)果顯示CK五組的微生物群落差異比較大，相距較遠，CK對照組隨著時間的延長，微生物群落變化較大；而不同濃度的活性銀離子處理組相對來說差異較小，距離較近，提示抑菌效果比較明顯，所以群落差異較小，PCA也得到相同的結(jié)果。

根據(jù)檢出菌屬水平的豐度信息結(jié)果可以看出，銀離子消毒水鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）屬于變形菌門；乳球菌屬（Lactococcus）豐度較高，屬于厚壁菌門。一項早期對空間站早期環(huán)境微生物檢測的結(jié)果顯示，有27種細菌從水樣中檢出，其中鞘氨醇單胞菌屬占25%，甲基桿菌屬（Methylobacterium）占18%。其他檢出菌還包括羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、芽生菌屬（Blastobacter）［10］。Gokulan等人的研究表明存在具有銀離子抗性基因的病原微生物，此外空間環(huán)境也會對微生物的生物學特征產(chǎn)生影響而產(chǎn)生特殊的抗性［11-12］。

基于宏基因組物種豐度信息，以及物種的基因組數(shù)據(jù)庫信息，可以得到樣品群落的功能基因種類以及其豐度信息，深入了解樣品中的微生物群落以及比較樣品間在功能基因方面的差異［9］。Langille MG［13］等人利用PICRUSt軟件，對使用16sRNA特異基因序列檢測出的微生物物種和豐度信息進行功能基因預測，提示與癌癥、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、代謝性疾病及感染性疾病的相關性，而這些疾病也是載人航天中保障航天員健康需要重點關注的。因此，研究航天飲用水中微生物生物多樣性，可能對于預測和預防疾病、保障航天員健康具有指導意義。

5 結(jié)論

本研究采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法及Illumina Miseq高通量測序法，結(jié)合生物信息技術，分析了銀離子對飲用水的消毒效果及微生物多樣性。結(jié)果表明：0.3 mg／L銀離子可有效控制水中微生物數(shù)量，時間可達3個月，滿足飲用水國家標準要求的限值，也能夠滿足國際空間站水微生物的限值標準。

高通量測序的結(jié)果顯示，銀離子消毒水中微生物群落差異減少，以變形菌門最豐富，同時變形菌門中鞘氨醇單胞菌屬豐度最高。Illumina Miseq測序技術通量高、速度快，結(jié)合生物信息學科揭示微生物與環(huán)境之間的關系，具有極大的發(fā)展?jié)摿?。但分子生物學技術其高敏感性，有時無法區(qū)分活細胞和死細胞，這可能需要與培養(yǎng)法或其他證據(jù)共同達到精準檢測的目的，這也是非培養(yǎng)法在軌應用必須解決的問題。

（References）

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Microbiota Diversity Analysis of Potable Water Treated with Silver Ion Using Illumina Miseq Sequencing Technology

XIN Bingmu1，LIU Ya2，ZHU Debin1，WU Yuanliang1，WANG Jing1，ZHANG Hong1，LYU Zhitang2，XIE Qiong1?
（1.China Astronaut Research and Training Center，Beijing 100094，China；2.Academy of Life Science，Hebei University，Baoding 071000，China）

Silver ion is commonly used in water purification in human space flight missions.To analyze and compare the microbiota diversity in potable water treated or untreated with silver ion，barrelled water were treated with different concentrations of silver ion and analyzed by Illumina MISeq sequencing.The experiments were divided into the CK（Con），L（0.1 mg／L），M（0.3 mg／L）and H（0.5 mg／L）groups and sampling was made once every 30 days.Genomic DNA of the samples was extracted and the 16S rDNA V3-V4 region was amplified by PCR and identified by Illumina.The bioinformatic analysis included the community composition，the beta diversity，the principal components，and species abundance analyses.The bacteria concentrations were lower in water treated with silver ion than that of the untreated.Protecobacteria was the predominant phylums.The two second most commonly identi？ed genera were Firmicutes and Actinobacteria.Beta diversity and principal components analysis showed that lower variations in community composition were presented in water treated with silver ion analyzed，while Sphingomonas and Lactococcus might be the top two species according to the abundance analysis.The data showed that silver ions could effectively suppress the reproduction and simplify the community composition of bacteria.

potable water；Illumina Miseq；microbiota；silver ion

Q939.93

A

1674-5825（2017）06-0824-05

2017-05-03；

2017-10-12

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2015ZX09J15102-002）；載人航天預先研究項目（2012SY54A1106）

辛冰牧，女，博士，助理研究員，研究方向為航天實施醫(yī)學。E-mail：xin_bm＠163.com

?通訊作者：謝瓊，女，博士，研究員，研究方向為航天實施醫(yī)學。E-mail：xieqio＠sina.com

（責任編輯：龐迎春）