基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜在臨床微生物檢驗中的應用與發(fā)展

張 嶸

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜在臨床微生物檢驗中的應用與發(fā)展

張 嶸

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜； 微生物鑒定； 細菌耐藥性； 分子流行病學

Application and development of MALDI-TOF MS in clinical microbiology laboratory

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）自20世紀90年代開始成功用于細菌的快速鑒定，其原理是根據(jù)不同細菌的特征性蛋白指紋圖譜進行細菌鑒定，打破了傳統(tǒng)生化反應方法煩瑣的鑒定流程，大大縮短了檢測時間，降低了檢測成本，且具有準確、高通量等優(yōu)勢，為臨床微生物檢驗帶來了革命性的發(fā)展。MALDI-TOF MS在臨床微生物實驗室的應用主要涵蓋以下方面：①病原微生物的鑒定；②細菌耐藥性的檢測；③某些特定菌株的分子流行病學分析。

1 MALDI-TOF MS在病原菌鑒定中的應用

1.1 培養(yǎng)后病原微生物鑒定

MALDI-TOF MS對培養(yǎng)后臨床病原菌的快速檢測已十分成熟，有文獻評估臨床常用的2臺質(zhì)譜儀——布魯克公司Biotyper MS和物生梅里埃公司的VITEK MS的鑒定性能，其對臨床常見病原菌的鑒定準確率均達95%以上[1]。此外，MALDI-TOF MS在厭氧菌、真菌、分枝桿菌及其他少見或難培養(yǎng)細菌的鑒定方面與傳統(tǒng)方法相比較具有明顯優(yōu)勢。

采用傳統(tǒng)方法鑒定厭氧菌周期長，鑒定困難，有些菌種之間很難區(qū)分，不能滿足臨床實驗室快速準確的要求。隨著MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫不斷完善，MALDI-TOF MS對臨床分離的厭氧菌鑒定準確率已經(jīng)達到90%以上[2]。與“金標準”16S rRNA相比，197株臨床分離厭氧菌，MALDI-TOF MS鑒定準確率為94.9%[3]。真菌亦是臨床鑒定的難題，質(zhì)譜對臨床常見白念珠菌、近平滑念珠菌、熱帶念珠菌、新生隱球菌等鑒定總準確率能達96%以上，但是對數(shù)據(jù)庫中未包含的菌種，例如弗比恩畢赤酵母無法給出鑒定結果，需要自建庫進行補充[4]。由于菌絲和細胞壁破碎困難，絲狀真菌是目前質(zhì)譜鑒定的瓶頸，有文獻報道經(jīng)復雜的前處理后，390株臨床分離的絲狀真菌的鑒定準確率僅為85.6%[5]。

質(zhì)譜的另一個優(yōu)勢是對細菌復合群的鑒定，常規(guī)的生化反應均難將復合群區(qū)分到種。Biotyper MS的數(shù)據(jù)庫對醋酸鈣-鮑曼不動桿菌復合群的區(qū)分能力可達到100%[6]，VITEK MS對于鏈球菌屬，尤其對肺炎鏈球菌和其他鏈球菌之間的區(qū)分準確率可達99.1%（115/116）[7]。結核分枝桿菌復合群菌種同源性高，鑒定困難，Biotyper MS可鑒定至種的水平，結核分枝桿菌和牛分枝桿菌的鑒定準確率在96%左右[8]，對非結核分枝桿菌復合群細菌鑒定準確率為98.4%（65/66）[9]。目前國產(chǎn)質(zhì)譜儀對臨床革蘭陰性桿菌的鑒定準確率可達到98.05%，但是對某些復合群的鑒別仍然有待提高[10]。

質(zhì)譜用于支原體的鑒定目前還有一定的困難，主要由于數(shù)據(jù)庫有限，樣本混合其他細菌，或合并多種支原體感染，干擾質(zhì)譜儀鑒定的準確性。目前質(zhì)譜可通過自建庫或直接分析某一種如肺炎支原體特征峰進行鑒定[11]。

1.2 臨床樣本直接檢測細菌

質(zhì)譜針對培養(yǎng)后病原菌的鑒定可縮短鑒定時間，但仍需培養(yǎng)18～24 h，而將質(zhì)譜運用于臨床樣本的直接檢測，可大大縮短檢測周轉時間（turnaround time，TAT），對于臨床細菌及真菌感染患者的早期診斷和治療有重要意義。

鑒于血流感染的重要性，MALDI-TOF MS用于陽性血培養(yǎng)標本的快速檢測一直是研究的熱點，標本前處理能除去血液中血細胞以及其他非細菌成份的干擾，對直接檢測尤為重要。差速離心的方法在菌量大于107cfu/mL時準確率在87%左右[12]；分離膠方法檢出率約59%；Sepsityper商品化試劑盒可檢出88%細菌，陰性菌鑒定準確率更高[13]；合適的裂解劑（如SDS和saponin）可提高直接檢測的檢出率。從目前文獻綜合評估，Sepsityper具有標準化、準確率高的優(yōu)點，但操作稍復雜，且成本較裂解劑及分離膠方法高。

目前MALDI-TOF MS直接檢測血培養(yǎng)還存在一些問題。臨床常用血培養(yǎng)瓶如BacT/ALERT活性炭需氧瓶內(nèi)活性炭吸附細菌導致細菌濃度降低，前處理后檢測效果不佳，需要鑒定短時間培養(yǎng)后生成菌膜，需要耗時4～8 h[14]；革蘭陽性菌的鑒定準確率低于革蘭陰性菌；無法可靠地區(qū)分肺炎鏈球菌與草綠色鏈球菌[15]；混合感染樣本只能檢測一種細菌或無法給出鑒定結果[16]；對厭氧菌的鑒定準確率在75%左右等。國內(nèi)外對MALDI-TOF MS運用于臨床標本的直接鑒定都持樂觀態(tài)度，中國臨床微生物質(zhì)譜共識專家組以及上海醫(yī)學會檢驗醫(yī)學專科委員會臨床微生物學組均發(fā)表了關于血培養(yǎng)直接質(zhì)譜檢測共識，將MALDI-TOF MS用于血培養(yǎng)直接檢測作為未來的手段。

除了血培養(yǎng)陽性標本外，MALDI-TOF MS還可用于尿液標本的直接檢測。尿液樣本經(jīng)離心后洗滌，對菌量＞105cfu/mL的尿液樣本檢出率為92.7%，尤其是革蘭陰性桿菌顯示很好的符合性[17]。采用SDS前處理，可大大提高方法準確度。文獻對比發(fā)現(xiàn)過濾（78.9%）和固體培養(yǎng)（84.2%）比差速離心（68.4%）有更高的準確率，MALDI-TOF MS在尿液樣本的直接檢測具有巨大潛力[18]。其他無菌體液標本的快速檢測報道不多，主要為腦脊液，已有報道檢出腦膜炎患者腦脊液中肺炎鏈球菌、布魯菌和肺炎克雷伯菌[19-20]。

2 MALDI-TOF MS在細菌耐藥性檢測中的研究與應用

MALDI-TOF MS應用于細菌耐藥性的檢測是質(zhì)譜在微生物檢驗中的另一個拓展。根據(jù)目前已有的報道，大致可分為：①直接尋找耐藥菌中特異峰，采用特定的軟件分析獲得耐藥和敏感細菌的差異性（直接分析法）；②根據(jù)細菌產(chǎn)生特異性酶水解抗生素，檢測抗生素峰圖的變化，確認是否耐藥（酶水解法）；③曲線下面積計算法；④其他方法。

2.1 直接分析法

在2000年，Edwards-Jones等[21]首次提出了采用MALDI-TOF MS快速區(qū)分MRSA和MSSA，隨后更多的研究驗證了MALDI-TOF MS對MRSA和MSSA具有區(qū)分能力。Biotyper MS采用分析軟件區(qū)分MRSA組的準確率為83.3%，MSSA組為90.9%[22]，見圖1；VITEK MS通過建立SuperSpectra，選擇3個特征峰區(qū)分MRSA和MSSA，準確率達到84%和91%[23]，見圖2。同理，MALDI-TOF MS對耐萬古霉素腸球菌也可進行快速區(qū)分，采用GA算法其特異度和靈敏度分別為92.40%和99.18%[24]。2014年，Lau等[25]發(fā)現(xiàn)質(zhì)荷比為11109 Da是blaKPC表達pKpQIL肽的特征峰，通過該特征峰可快速區(qū)分產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌。

2.2 酶水解法

腸桿菌科細菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌對β內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類抗生素的耐藥機制大多數(shù)是由于產(chǎn)生水解抗生素的酶，如CTX-M、KPC、NDM和OXA酶等。2011年首次報道MALDI-TOF MS檢測碳青霉烯酶，整個過程1～2.5 h即可完成[26]。隨后大量文獻報道，針對革蘭陰性桿菌β內(nèi)酰胺酶以及碳青霉烯酶耐藥菌株的檢測，通過孵育水解抗生素區(qū)分耐藥株和敏感株[27-28]。胡燕燕等[29]比較產(chǎn)KPC型碳青霉烯酶腸桿菌科細菌在不同藥物濃度下水解厄他培南的能力，推薦0.1 g/L的厄他培南作為水解底物來檢測產(chǎn)KPC型腸桿菌科細菌。為了加快水解時間，有研究報道，添加NH4HCO3等促進水解酶活性物質(zhì)從而提高腸桿菌科細菌KPC酶水解美羅培南的能力，將靈敏度從76%提高至98%[30]。

圖1 MRSA（紅色×）和MSSA（綠色○）的二維分析圖Figure 1 Two-dimensional profiling of MRSA （red×） and MSSA （green ○） isolates

圖2 MRSA（紅色峰）和MSSA（藍色峰）的區(qū)分Figure 2 The SuperSpectra of MRSA （red peaks） and MSSA （blue peaks）

2.3 曲線下面積法

2009年，Marinach等[31]發(fā)現(xiàn)白念珠菌在不同濃度氟康唑的壓力下，其表達的蛋白組分會發(fā)生改變，用MALDI-TOF MS能定性地表現(xiàn)出來?；诖嗽?，近2年興起一種確定細菌耐藥的新方法——曲線下面積法：細菌在含有抗生素的溶液中培養(yǎng)，敏感菌株會被抗生素抑制，細菌濃度大大降低，在質(zhì)譜峰圖上有直觀的體現(xiàn)。根據(jù)孵育前后質(zhì)譜峰曲線下面積的比值（cutoff值）來判斷細菌對該藥物是否耐藥，可定量得到細菌對該抗生素的MIC值，見圖3。2014年，Lange等[32]檢測108株肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物的敏感性，結果與E試驗相比，該方法靈敏度和特異度分別為97.3%和93.5%。2016年，Sparbier等[33]對大量藥物進行半定量的分析，包括青霉素類、頭孢菌素類、碳青霉烯類、氟喹諾酮類以及氨基糖苷類，該方法能夠快速測定抗生素對細菌的MIC值，鑒定與藥敏結果在短時間內(nèi)完成。

圖3 敏感株（A，B）與耐藥株（C，D）曲線下面積比值與cutoff值的比較Figure 3 Comparison of area ratio and cutoff value between the sensitive strains （A， B） and resistant strains （C， D）

2.4 其他方法

外膜蛋白缺失是導致細菌耐藥的另一重要原因，Cai等[34]首次采用質(zhì)譜快速檢測外膜蛋白缺失引起碳青霉烯類耐藥的肺炎克雷伯菌，與SDSPAGE比較，MALDI-TOF MS具有快速、準確、直觀等優(yōu)勢。Hu等[35]對外膜蛋白缺失的大腸埃希菌快速檢測，進一步驗證了質(zhì)譜檢測外膜蛋白的可靠性。

近年來發(fā)展的耐藥快速檢測方法還包括采用核素標記生長培養(yǎng)基中特定氨基酸。細菌生長程度不同，培養(yǎng)基中核素標記的氨基酸消耗程度不同，通過檢測核素反映細菌的耐藥情況。目前研究采用這種方法檢測MRSA，孵育3 h甚至更少時間即可得到結果[36]。

質(zhì)譜技術在耐藥性檢測中的應用已經(jīng)顯示出巨大潛力，如能與培養(yǎng)后純菌落鑒定相結合，可將TAT時間縮短24～48 h，如與直接樣本檢測相結合，則可將報告臨床時間提早48～54 h。

3 MALDI-TOF MS在流行病學的應用研究

質(zhì)譜除了對細菌耐藥的快速檢測外，還可用于聚類分析和主成份分析，為醫(yī)院感染和傳染性疾病的監(jiān)測、防控提供方法。傳統(tǒng)的細菌同源性主要是采用多位點序列分型（MLST）、脈沖場凝膠電泳（PFGE）等分子生物學分析手段對細菌管家基因以及特異的限制性內(nèi)切酶剪切后的DNA片段進行研究，質(zhì)譜同源性分析主要是基于檢測細菌的蛋白質(zhì)，因此在分型方法上與MLST和PFGE存在差異。2011年，首次采用質(zhì)譜技術對金黃色葡萄球菌進行分型，通過13個特征峰，找到不同的CC群組與組之間的差異[37]，見圖4。后續(xù)有研究者利用質(zhì)譜對不同ST型的金黃色葡萄球菌ST17和ST1進行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結果顯示同一ST型之間菌株分布集中，不同ST型之間距離明顯[38]。黃永祿等[39]采用Biotyper MS對產(chǎn)ESBL大腸埃希菌最常見ST型ST131和ST405型進行聚類分析，兩組之間存在明顯分簇情況，靈敏度和特異度分別為97.9%和93.3%，VITEK MS通過建立SuperSpectra，對ST131和非ST131型大腸埃希菌采用自建數(shù)據(jù)庫并進行分析和驗證，得到兩者區(qū)分的靈敏度和特異度分別為86.6%和95.1%[40]。在小樣本量的比較中，MALDI-TOF MS分型結果與“金標準”PFGE分型情況完全相同，且具有更快速、成本更低的優(yōu)勢。雖然質(zhì)譜用于分型尚處于研究階段，但有希望成為一種新的快速分型方法。

圖4 MALDI分型與CC分型的聚類分析樹狀圖Figure 4 Dendrogram representation of hierarchical cluster analysis of the MALDI types and CC types

4 總結和展望

MADLI-TOF MS經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，為臨床微生物實驗室?guī)砹烁锩缘陌l(fā)展。其具有的快速、準確、靈敏、高通量等特點，加上操作簡單和低耗材的優(yōu)勢在臨床微生物實驗室被推廣?，F(xiàn)階段MADLI-TOF MS在微生物檢測中還存在很大的發(fā)展和提升空間，隨著技術的不斷發(fā)展，相信在不久的將來，一定會成為微生物常規(guī)工作的一大支柱。

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R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 06-0703-06

10.16718/j.1009-7708.2017.06.018

浙江大學附屬第二醫(yī)院檢驗科， 杭州 310009。

張嶸（1972—），女，博士，主任技師，主要從事微生物方面研究。

張嶸，E-mail：brigitte_zx@163.com。

2017-02-27 修回日期：2017-06-20