鮑曼不動桿菌對8種常用抗菌藥物敏感試驗不同方法的比較

溫海楠， 謝守軍， 趙建宏， 孫 倩， 魏宏蓮， 時東彥， 李志榮， 徐 麗， 聞海峰

鮑曼不動桿菌對8種常用抗菌藥物敏感試驗不同方法的比較

溫海楠1， 謝守軍1， 趙建宏2，3， 孫 倩2， 魏宏蓮2， 時東彥2， 李志榮3， 徐 麗4， 聞海峰5

目的分析河北省細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)（Hebarin）鮑曼不動桿菌耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)，驗證不同藥敏試驗方法結(jié)果，提高耐藥性監(jiān)測數(shù)據(jù)質(zhì)量，指導(dǎo)臨床實驗室使用合理的藥敏試驗方法。方法回顧性分析Hebarin鮑曼不動桿菌藥敏數(shù)據(jù)。收集126株鮑曼不動桿菌，應(yīng)用E試驗法、紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法檢測其對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、亞胺培南和美羅培南的藥敏試驗結(jié)果。結(jié)果126株鮑曼不動桿菌藥敏試驗結(jié)果顯示，3種方法中細(xì)菌對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、頭孢他啶藥敏結(jié)果存在明顯差異（P＜0.05）；紙片擴(kuò)散法的分類一致性、一般錯誤率、嚴(yán)重錯誤率、極嚴(yán)重錯誤率均在可接受范圍，紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星的分類一致性存在明顯差異（P＜0.05）。結(jié)論不同的藥敏試驗方法會導(dǎo)致不同的耐藥結(jié)果，從而使耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)出現(xiàn)方法學(xué)的差異。應(yīng)用VITEK儀器進(jìn)行藥敏試驗時，哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星的藥敏結(jié)果要結(jié)合紙片擴(kuò)散法或E試驗方法進(jìn)行驗證，以便更加準(zhǔn)確地指導(dǎo)臨床用藥。

鮑曼不動桿菌； E試驗法； 紙片擴(kuò)散法； VITEK

鮑曼不動桿菌是醫(yī)院環(huán)境中常見的條件致病菌，該菌具有多重耐藥性和易于傳播性，可以通過院內(nèi)的各種媒介傳給患者，導(dǎo)致感染。隨著近年來廣譜抗生素的大量使用，鮑曼不動桿菌可以引起很多科室的感染流行[1-2]。鮑曼不動桿菌可通過多種途徑規(guī)避抗菌藥物的作用，能夠主動獲取外源性耐藥基因，發(fā)展成為多重耐藥菌株，并對多種類型的抗菌藥物耐藥，如碳青霉烯類、四環(huán)素類、頭孢菌素類、喹諾酮類等[3]。鮑曼不動桿菌在不同地區(qū)的耐藥率存在一定的差異，2015年全國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)顯示鮑曼不動桿菌上報數(shù)據(jù)排名革蘭陰性菌的第4位，對碳青霉烯類耐藥率為25.6%～82.1%，全國平均耐藥率為59.0%，其中河北省耐藥率為65.1%[4]。亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌對多種抗生素的耐藥率都在50%以上，部分甚至達(dá)100%[5]。目前鮑曼不動桿菌的臨床實驗室藥敏試驗方法主要有紙片擴(kuò)散法、E試驗法、儀器法等。在統(tǒng)計2016年河北省細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)（Hebarin）數(shù)據(jù)結(jié)果時發(fā)現(xiàn)，鮑曼不動桿菌因各臨床實驗室使用藥敏方法的不同而使耐藥性呈現(xiàn)較大差別，而準(zhǔn)確規(guī)范的藥敏方法是保證臨床正確用藥、實現(xiàn)有效治療的前提。鮑曼不動桿菌耐藥日趨嚴(yán)重，對臨床藥敏試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性也提出了較高的要求。因此本課題選取臨床分離鮑曼不動桿菌菌株使用不同的藥敏試驗方法對結(jié)果進(jìn)行驗證。

本研究應(yīng)用E試驗法為參考方法，對臨床實驗室常用的紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、亞胺培南和美羅培南8種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗，比較不同藥敏試驗方法的分類一致性及抗菌藥物的敏感性，探討Hebarin鮑曼不動桿菌藥敏試驗結(jié)果的質(zhì)量，并指導(dǎo)實驗室應(yīng)用適當(dāng)或補充的藥敏試驗方法對鮑曼不動桿菌進(jìn)行藥敏試驗，保證藥敏試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1數(shù)據(jù)來源 Hebarin共收集42所醫(yī)院上報的耐藥數(shù)據(jù)，剔除菌株總量不足的5所醫(yī)院后，剩余37所醫(yī)院的數(shù)據(jù)納入分析。納入分析的37所醫(yī)院通過“全國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)”將數(shù)據(jù)上報后，Hebarin使用WHONET5.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選、分析、統(tǒng)計。

1.1.2菌株來源 收集2016年11月承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院、河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院臨床住院患者分離到的126株鮑曼不動桿菌（實驗組），剔除同一患者的同一標(biāo)本來源的重復(fù)分離株。所有菌株需經(jīng)VITEK 2-Compact GN卡進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC 27853，購自衛(wèi)生部臨檢中心。

1.1.3試劑與儀器 水解酪蛋白瓊脂（MH）購自溫州康泰公司；藥敏紙片包括哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、亞胺培南和美羅培南均為英國OXOID產(chǎn)品；哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、亞胺培南和美羅培南E試驗條為溫州康泰公司產(chǎn)品；VITEK 2-Compact GN-AST09藥敏卡為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1藥敏試驗方法及結(jié)果判讀 藥敏試驗方法、質(zhì)量控制及結(jié)果判讀：敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）遵循美國CLSI M100S（2016年版）進(jìn)行操作[6]；VITEK 2-Compact系統(tǒng)試驗方法、質(zhì)量控制遵循儀器藥敏試驗操作說明。本研究應(yīng)用E試驗法為參考方法。

1.2.2數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)CLSI M23-A2文件[7]，分類一致性（categorical agreement，CA）指實驗方法與參考方法的符合率，極嚴(yán)重錯誤率（very major errors，VME）指參考方法的結(jié)果為 R，實驗方法為 S； 嚴(yán)重錯誤率（major errors，ME）指參考方法的結(jié)果為S，實驗方法為 R；一般錯誤率（minor errors，MIE）指參考方法的結(jié)果為R或S，實驗方法為I，或者參考方法的結(jié)果是I，實驗方法為S或R；可接受的誤差范圍為：CA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，MIE≤10%。

1.2.3統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用卡方檢驗對各種方法的S%、I%、R%進(jìn)行比較，并對各檢測方法與E試驗法之間的一致性進(jìn)行檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Hebarin數(shù)據(jù)分析

使用WHONET5.6軟件對Hebarin中的鮑曼不動桿菌藥敏試驗結(jié)果回顧性分析。發(fā)現(xiàn)對鮑曼不動桿菌應(yīng)用VITEK儀器法、紙片擴(kuò)散法檢測的藥敏結(jié)果存在差異。如對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、亞胺培南和美羅培南的2種藥敏方法的耐藥結(jié)果均不一致。

2.2 E試驗法、紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法藥敏試驗結(jié)果比較

對收集的126株鮑曼不動桿菌應(yīng)用E試驗法、紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法針對上述抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗，環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南的3種方法的藥敏試驗結(jié)果無差別；哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、頭孢他啶藥敏試驗結(jié)果存在明顯差異（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 126株鮑曼不動桿菌紙片擴(kuò)散法、VITEK儀器法和E試驗法藥敏試驗結(jié)果比較 Table 1 The antimicrobial susceptibility results of 126 Acinetobacter baumannii strains tested by Kirby-Bauer method，VITEK and E-test method

2.3 Hebarin與本研究結(jié)果比較

Hebarin鮑曼不動桿菌耐藥率與本研究實驗組中126株鮑曼不動桿菌耐藥率結(jié)果比較，紙片擴(kuò)散法，Hebarin對8種藥物的耐藥率均高于實驗組；VITEK儀器法，Hebarin僅對阿米卡星的耐藥率高于本實驗組，MIC50、MIC90均為4 mg/L；實驗組E試驗法MIC50結(jié)果均高于其他方法。見圖1、表2。

2.4 紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法與E試驗法比較

以E試驗法為參考方法，紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法CA、MIE、ME、VME分析結(jié)果，見表3。其中，紙片擴(kuò)散法幾種抗菌藥物的CA均大于90%，MIE為0～6.3%，ME為0，VME為0，均在可接受范圍。VITEK儀器法哌拉西林-他唑巴坦：CA為86.5%，MIE為13.5%；阿米卡星：CA為50.0%，VME為46.8%；左氧氟沙星：VME為1.6%，按照判斷標(biāo)準(zhǔn)均為不可接受的結(jié)果。哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星的CA比較存在明顯差異（P＜0.05）。

圖1 Hebarin和實驗組鮑曼不動桿菌耐藥率Figure 1 The resistance rates of Acinetobacter baumannii

表2 鮑曼不動桿菌MIC50和MIC90結(jié)果Table 2 The MIC50 and MIC9 values of eight antimicrobial agents against Acinetobacter baumannii strains（mg/L）

表3 紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法與E試驗法結(jié)果比較Table 3 The susceptibility results of Kirby-Bauer method and VITEK compared with E-test（%）

3 討論

鮑曼不動桿菌是醫(yī)院感染的重要致病菌之一，其對常用抗菌藥物的耐藥率呈逐年上升的趨勢。該菌具有多重耐藥和交叉耐藥的特性，對抗感染治療提出了巨大的挑戰(zhàn)[8-9]。準(zhǔn)確的藥敏試驗結(jié)果對臨床合理使用抗菌藥物具有重要的指導(dǎo)意義。國家也為抗生素的合理使用制定了一系列計劃，包括選取符合條件的醫(yī)院參加全國細(xì)菌耐藥性監(jiān)測網(wǎng)，及時準(zhǔn)確上報數(shù)據(jù)，以及抗生素合理使用專項計劃等活動。Hebarin每年組織專家對本省多所醫(yī)院上報的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，參加Hebarin的成員單位均具有良好的實驗基礎(chǔ)，室內(nèi)質(zhì)控合格，且已通過國家或本省室間質(zhì)評。但通過對上報的數(shù)據(jù)分析來看，不同醫(yī)院由于藥敏試驗方法、儀器質(zhì)量、操作手法等原因可使結(jié)果呈現(xiàn)較大差異。分析Hebarin中的鮑曼不動桿菌紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法的藥敏試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)鮑曼不動桿菌對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、頭孢他啶、亞胺培南和美羅培南的耐藥率明顯不同，本課題選取臨床菌株使用不同的藥敏試驗方法對上述的試驗結(jié)果進(jìn)行驗證。

我們通過實驗驗證顯示，126株鮑曼不動桿菌應(yīng)用E試驗法、紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法進(jìn)行藥敏試驗，對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星、頭孢他啶藥敏結(jié)果存在明顯差異，與Hebarin鮑曼不動桿菌藥敏方法數(shù)據(jù)趨勢一致；而環(huán)丙沙星、亞胺培南、美羅培南的3種方法結(jié)果之間無差別，與Hebarin的結(jié)果不一致。對比Hebarin鮑曼不動桿菌對上述抗菌藥物VITEK儀器法的MIC50和MIC90結(jié)果，本實驗的MIC50與Hebarin MIC50一致，MIC90大致低于Hebarin 1個稀釋度，由此可推斷藥敏試驗結(jié)果可能與Hebarin藥敏數(shù)據(jù)不完全一致，但是藥敏試驗方法確實存在差異，可能與選取的樣本或藥敏試驗方法有關(guān)。VITEK儀器法MIC50、MIC90均低于E試驗方法，這可能導(dǎo)致整體耐藥率偏低，是導(dǎo)致Hebarin VITEK儀器法的耐藥率普遍低于紙片法的原因。為了進(jìn)一步探究結(jié)果不一致的原因，我們以E試驗法為參考方法，應(yīng)用紙片擴(kuò)散法和VITEK儀器法進(jìn)行了藥敏試驗的比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紙片擴(kuò)散法藥敏結(jié)果與參考方法更吻合，實驗中的8種抗菌藥物CA、MIE、ME、VME均在可接受范圍，而VITEK儀器法哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星均有不可接受的結(jié)果出現(xiàn)。聞海豐等[10]通過對Hebarin的數(shù)據(jù)分析及對538株鮑曼不動桿菌的藥敏試驗方法分析發(fā)現(xiàn)，VITEK儀器法檢測阿米卡星敏感性試驗結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)方法差異較大，與本研究結(jié)果一致。VITEK儀器法檢測阿米卡星的敏感率遠(yuǎn)高于其他方法，與阿米卡星對鮑曼不動桿菌的抗菌作用中介于細(xì)菌明顯生長與完全不生長之間存在的緩慢生長區(qū)有關(guān)[11]，VITEK儀器法檢測時間多在8 h內(nèi)，此時正處于細(xì)菌的緩慢生長區(qū)，從而導(dǎo)致儀器的假敏感現(xiàn)象，而非正常的稀釋法結(jié)果。但哌拉西林-他唑巴坦和左氧氟沙星這2種藥物在VITEK儀器法出現(xiàn)不可接受結(jié)果的原因尚無文獻(xiàn)闡述，是否與藥物本身有關(guān)還需要進(jìn)一步實驗證實。

VITEK儀器法藥敏試驗采用的是微量MIC法，使用預(yù)先包被好含不同抗菌藥物的藥敏卡，其良好的操作性、重復(fù)性與時效性廣受實驗室歡迎，但短時間的試驗結(jié)果可能導(dǎo)致細(xì)菌生長不全造成的假敏感現(xiàn)象，這可能是Hebarin數(shù)據(jù)中VITEK儀器法耐藥率低于紙片法的原因。我國目前采用CLSI推薦的藥敏方法，對于普通藥敏試驗推薦的判讀結(jié)果時間為18～24 h，對于儀器法的這種現(xiàn)象是否可以通過延長培養(yǎng)孵育時間來解決，還有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)無論是Hebarin數(shù)據(jù)還是本次實驗藥敏結(jié)果，紙片法的CA、MIE、ME、VME均在可接受范圍，而VITEK儀器法在哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、左氧氟沙星幾種藥物上則不同程度出現(xiàn)不可接受的結(jié)果。對比本實驗中E試驗法、紙片擴(kuò)散法、VITEK儀器法的藥敏結(jié)果和CA結(jié)果，提示臨床實驗室工作人員在做藥敏試驗中，除應(yīng)用比較便捷的VITEK儀器外，針對部分有疑問的結(jié)果還應(yīng)輔以其他方法進(jìn)行確認(rèn)試驗，得出準(zhǔn)確的抗菌藥物敏感性，指導(dǎo)臨床合理用藥，保證耐藥性監(jiān)測網(wǎng)的數(shù)據(jù)質(zhì)量，使其在監(jiān)測菌株耐藥趨勢及合理使用抗生素上發(fā)揮更為重要的作用。

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Susceptibility of Acinetobacter baumannii isolates to eight antimicrobial agents tested by different methods

WEN Hainan, XIE Shoujun, ZHAO Jianhong, SUN Qian, WEI Honglian, SHI Dongyan, LI Zhirong, XU Li, WEN Haifeng.
（Department of Laboratory Medicine, Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde Hebei 067000, China）

ObjectiveThe purpose of this study was to analyze the susceptibility profile ofAcinetobacter baumanniito antimicrobial agents, and validate the results of different antimicrobial susceptibility testing methods, for improving the quality of antibiotic resistance monitoring data.MethodsThe susceptibility data of Hebei Provincial Antimicrobial Resistant Investigation Net were analyzed retrospectively and 126 strains ofA. baumanniiwere collected. The susceptibility ofA. baumanniito piperacillintazobactam, amikacin, gentamicin, ciprofloxacin, levofloxacin, ceftazidime, imipenem, and meropenem was tested by E-test, Kirby-Bauer method and VITEK system.ResultsThe susceptibility results of the 126A. baumanniistrains showed that the susceptibility to piperacillin-tazobactam, amikacin, gentamicin, levofloxacin and ceftazidime was significantly different between the three methods (P＜0.05). The categorical agreement, major error,minor error, and very major error of Kirby-Bauer method were within acceptable range. There were evident difference in classification consistency for piperacillin-tazobactam, amikacin,levofloxacin between Kirby-Bauer method and VITEK(P＜0.05).ConclusionsDifferent antimicrobial susceptibility testing methods may lead to different results of resistance monitoring data. Bias may be generated in antibiotic resistance surveillance if different methods are used. The susceptibilityresults of piperacillin-tazobactam, amikacin, levofloxacin derived from VITEK system should be validated by Kirby-Bauer or E-test method.

Acinetobacter baumannii; E-test; Kirby-Bauer method; VITEK

R978.1

A

1009-7708 ( 2017 ) 06-0680-05

10.16718/j.1009-7708.2017.06.013

河北省科技廳基礎(chǔ)條件平臺建設(shè)項目（河北省醫(yī)學(xué)微生物菌種資源標(biāo)準(zhǔn)平臺建設(shè)10966142D）。

1. 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，河北承德 067000；2. 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗科；3. 河北省臨床檢驗中心；4. 滄州市人民醫(yī)院檢驗科；5. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院檢驗科。

溫海楠（1987—），女，碩士，主管檢驗師，主要從事臨床微生物感染與細(xì)菌耐藥研究。

趙建宏，E-mail：zhaojh_2002@yahoo.com。

2017-03-30 修回日期：2017-05-14