超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中鏈霉素的研究

方 益，李佩佩，嚴(yán)忠雍，陳 思，張 帥

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所；浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021)

超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中鏈霉素的研究

方 益，李佩佩，嚴(yán)忠雍，陳 思，張 帥

(浙江省海洋水產(chǎn)研究所；浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 舟山 316021)

建立了水產(chǎn)品中鏈霉素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。水產(chǎn)品樣品經(jīng)三氯乙酸溶液水解提取，固相萃取柱凈化，經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定。通過優(yōu)化前處理與色譜條件，鏈霉素在1.0～50ng/mL范圍內(nèi)具有有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)0.995以上，水產(chǎn)品樣品平均回收率在81%～105%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.8%～9.5%之間，定量檢出限為10.0μg/kg，該方法高效、靈敏、準(zhǔn)確，可廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)品中鏈霉素的檢測。

超高效液相色譜-質(zhì)譜法；鏈霉素；水產(chǎn)品

鏈霉素(streptomycin，SM)是一種廣譜氨基糖苷類抗生素，此類抗生素的抗菌作用強(qiáng)，革蘭氏陰性菌對(duì)其較為敏感，如沙門氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌等，屬于水產(chǎn)品中常用的抗生素。由于鏈霉素對(duì)人體具有較大的毒副作用，嚴(yán)重時(shí)可能造成休克和耳聾等癥狀[1]，對(duì)嬰幼兒的神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的傷害[2]。鏈霉素在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中會(huì)被添加，以達(dá)到抗病的目的，但是長期使用會(huì)導(dǎo)致鏈霉素的累積，并通過食物鏈進(jìn)入人體，造成極大危害，長期食用帶有鏈霉素的水產(chǎn)品，人體容易產(chǎn)生耐藥性。由于一些養(yǎng)殖戶違規(guī)使用鏈霉素的獸藥來防治水產(chǎn)養(yǎng)殖品的病害，從而導(dǎo)致水產(chǎn)品中鏈霉素殘留被檢出，尤其在水產(chǎn)品出口中發(fā)生抗生素等藥物殘留超標(biāo)，造成了經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。因此，對(duì)于研究快速定量檢測水產(chǎn)品中鏈霉素殘留量具有很重要的意義。

但由于鏈霉素具有較高的水溶性和離子化傾向，容易與蛋白組織等結(jié)合，導(dǎo)致回收率較低；同時(shí)與鏈霉素相似的結(jié)構(gòu)較多，色譜分離不理想，分離條件難以摸索等，目前對(duì)于水產(chǎn)品中鏈霉素殘留的測定方法研究較少[5-7]。目前，鏈霉素殘留的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法[8]、微生物法[9]、液相色譜法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]，但微生物法和酶聯(lián)免疫法易產(chǎn)生假陽性，一般僅用于市場內(nèi)快速檢測；而液相色譜法檢測周期較長，而且靈敏度較低，達(dá)不到鏈霉素殘留檢測要求；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是目前的主流檢測方法，均采用普通C18反相色譜柱，流動(dòng)相中需要添加離子對(duì)試劑，容易污染色譜柱和質(zhì)譜檢測器，而且前處理過程復(fù)雜，鏈霉素色譜柱保留效果差，峰型較差。故需建立了一種水產(chǎn)品中鏈霉素殘留超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜快速檢測方法。

本試驗(yàn)采用三氯乙酸溶液水解提取，固相萃取柱凈化，經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定檢測，擬建立水產(chǎn)品中鏈霉素的快速檢測方法，為水產(chǎn)品的質(zhì)量安全提供參考依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧電離源(美國Waters公司)；旋渦振蕩器(德國IKA公司)；高速離心機(jī)(德國Beckman公司)；固相萃取柱(WCX，60 mg /3mL，Waters公司)，24位固相萃取裝置(美國Supelco公司)；0.22μm濾膜(上海安譜)。

鏈霉素(純度≥98%，德國DR.Ehrensotorfer)；乙酸銨(純度99%)；乙腈(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；三氯乙酸溶液(5%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)，稱取三氯乙酸25g，溶于475mL水，混勻)，乙酸溶液(2%，體積分?jǐn)?shù)，量取乙酸溶液2mL，用水定容至100mL，混勻)；甲醇溶液(25%，體積分?jǐn)?shù)，取50mL甲醇，用水定容至200mL)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 儀器參數(shù)

1.2.1.1 液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH HILIC C18柱 2.1μm×50mm，1.7μm；流動(dòng)相(A)：0.1%甲酸5mM乙酸銨溶液；流動(dòng)相(B)：乙腈；洗脫程序見表1；流速0.3mL/min，柱溫40℃，樣品室溫度4℃，進(jìn)樣量10μL。

表1 流動(dòng)相洗脫程序

1.2.1.2 質(zhì)譜條件參數(shù)

離子源：電噴霧離子源，正離子掃描(ESI+)；檢測方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.50kV；錐孔電壓：50V；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：380℃；脫溶劑氣流量：600L/hr；錐孔氣流：50 L/hr；碰撞氣流量：0.24mL/min；鏈霉素離子對(duì)信息見表2。

表2 離子對(duì)信息

*為定量離子對(duì)

1.2.2 樣品提取

稱取稱取5.00g(精確到0.01g)樣品，置于50mL 離心管中，加入10mL三氯乙酸溶液，超聲5min，充分混合振蕩旋渦90s，經(jīng)6000r/min離心10min，取出上清液。殘留樣品使用10mL三氯乙酸溶液重復(fù)提取、離心，合并上清液，用氨水調(diào)節(jié)pH值至7左右，備用。

1.2.3 樣品凈化

分別使用3mL乙酸溶液、5mL水活化WCX固相萃取柱，移取提取液上樣，依次用5mL水、5 mL甲醇溶液淋洗固相萃取小柱，減壓抽干，用3mL乙腈-乙酸溶液(體積比為25：75)洗脫，收集洗脫液，用乙腈定容至3mL，過0.22μm濾膜，待檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

由于鏈霉素的極性較大，在C18等普通反相色譜柱上難以保留，必須采用離子對(duì)試劑才能獲得較好的保留效果，但是離子對(duì)試劑會(huì)污染離子源，可能會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的離子抑制，難以去除。故選擇水性HILIC色譜柱，水性化合物在HILIC色譜柱具有較好的保留效果，從而避免使用離子對(duì)試劑。

2.2 提取方式的選擇

鏈霉素屬于熱穩(wěn)定和極性高的化合物，在酸堿環(huán)境下穩(wěn)定，難溶于有機(jī)溶劑，但水溶性好，在水產(chǎn)品中可與蛋白質(zhì)結(jié)合。因此能夠水解樣品組織，沉淀蛋白質(zhì)，從水產(chǎn)品組織中游離出氯霉素是提取的關(guān)鍵。一般水解組織和沉淀蛋白，通常采用磷酸溶液、三氯乙酸溶液、乙酸鉛溶液等沉淀蛋白，本文考察了用磷酸溶液、三氯乙酸溶液、乙酸鉛溶液等沉淀蛋白的方法，其中三氯乙酸溶液蛋白沉淀效果好，且回收率及重復(fù)性較好。由于三氯乙酸溶液偏酸性，過弱陽離子交換固相萃取柱時(shí)，酸性環(huán)境會(huì)降低鏈霉素的回收率，所以將提取液的pH調(diào)節(jié)至7.0左右。

2.3 線性關(guān)系、檢出限、回收率和精密度

配制鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為1.0，2.0，5.0，10，20，50ng/mL，按照1.2.1進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。以峰響應(yīng)為y值，各系列梯度濃度為x值繪制曲線。線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(S/N =3)見表3。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

Fig.1 Chromatogram of standard solution

選取不含有鏈霉素的水產(chǎn)品(對(duì)蝦)，分別添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，做6次平行，按照1.2.1、1.2.2、1.2.3進(jìn)行樣品前處理和測定，計(jì)算回收率與精密度，結(jié)果見表3。

表3 線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、回收率和精密度(n=6)

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中鏈霉素的方法，水產(chǎn)品樣品經(jīng)三氯乙酸溶液提取，固相萃取柱凈化，經(jīng)超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定檢測，前處理步驟摒棄使用離子對(duì)試劑，保護(hù)儀器，簡單方便，提高了檢測效率，已應(yīng)用于實(shí)際檢測任務(wù)中，取得了良好的效果，具有較高的推廣價(jià)值。

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(本文文獻(xiàn)格式：方益，李佩佩，嚴(yán)忠雍，等.超高效液相色譜-質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中鏈霉素的研究[J].山東化工，2017，46(20)：67-69.)

ResearchontheDeterminationofStreptomycininAquaticProductsbyUltra-liquidChromatography-mass

FangYi,LiPeipei,YanZhongyong,ChenSi,ZhangShuai

(Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang; Key lab of Sustainable Utilization of Technology Research for Fishery Resource of Zhejiang, Zhoushan 316021,China)

A ultra-liquid chromatography-mass method was developed for determining aquatic products in aquatic products. Aquatic products samples were extracted directly by acetocaustin solution, solid phase extraction column purification, determination by ultra performance liquid chromatography mass spectrometry. Through the optimization of pretreatment and chromatographic conditions of streptomycin in the range of 1.0～50ng/mL with a good linear relationship, the correlation coefficient is above 0.995, the average recovery rate of water samples was between 81%～105%, the relative standard deviation between 3.8%-9.5%, quantitative detection limit is 10.0g/kg, the method is efficient, sensitive and accurate, and can be widely applied to detecting streptomycin in aquatic products..

ultra-liquid chromatography-mass method; streptomycin; aquatic products

2017-08-16

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017C32032)，浙江省科技計(jì)劃公共服務(wù)項(xiàng)目(2016F30022)

方 益(1986—)，浙江舟山人，碩士，主要從事水產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全。

O657.7+2

A

1008-021X(2017)20-0067-03